Bio-T kit PDCoV (Porcine DeltaCoronaVirus)

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1 MANUEL D UTILISATION Protocole simplifié Bio-T kit PDCoV (Porcine DeltaCoronaVirus) Cat. N BioTK réactions Détection de toutes les souches du PDCoV par RT-PCR en temps réel avec contrôle positif interne (IPC) exogène Type d échantillon Fèces Conservation des échantillons de préférence à -80 C ou à défaut à -20 C Extractions ARN recommandées Billes magnétiques (ex : BioSellal BioExtract SuperBall Cat.N BES384) Colonnes de silice (ex : BioSellal BioExtract Column Cat.N BEC050 ou BEC250) D autres kits d extraction sont utilisables : contacter le service technique pour plus d informations. Réservé à l usage vétérinaire Description du produit La technique de RT-PCR en temps réel permet de révéler la présence d acide nucléique (AN) cible de façon précise et rapide. Le Bio-T kit PDCoV permet de détecter, dans le même essai, la présence de tous les types de souches du PDCoV grâce à un marquage FAM et de l IPC exogène extrait en même temps que l échantillon, grâce à un marquage Cy5. Les échantillons compatibles avec le Bio-T kit PDCoV sont les fèces. BioSellal recommande l utilisation des kits d extractions BioExtract SuperBall ou BioExtract Column. Contenu du kit et conditions de conservation Description Master Mix (MM) prêt à l emploi Internal itive Control (IPC) = ARN contrôle d amplification exogène External itive Control (EPC) =ADN contrôle positif de détection du PDCOV Eau RNAse/DNAse free Tableau 1. Descriptif du contenu du kit Référence Volume /tube MMPDCOV-A 410 µl IPCRNA-A 135 µl EPCPDCOV-A 110 µl Aqua-A 1 ml Présentation bouchon gris Sachet A bouchon violet Sachet B bouchon rouge Sachet C bouchon bleu Sachet C Conservation -20 C à l abri de la lumière, Zone «MIX» -20 C Zone «Extraction» -20 C Zone «Ajout d AN» 4 C ou -20 C Zone «Ajout d AN» Les réactifs du kit sont stables jusqu à la date d expiration indiquée sur le sachet, sous réserve du bon respect des conditions de conservation. MUs/PDCoV/00001/FR 1 / 7

2 Principales précautions à appliquer Porter les équipements de protection individuelle appropriés (blouse, gants jetables, lunettes de protection ). Travailler dans des zones dédiées et séparées afin d éviter toute contamination : «Extraction» (stockage des échantillons non extraits, zone avec matériel d extraction), «MIX» (stockage des MM prêts à l emploi, préparation de plaques qrt-pcr), «Ajout d AN» (stockage et addition des AN extraits et des contrôles dans la plaque qrt-pcr), «PCR» (zone finale, contenant le(s) thermocycleur(s)). Utiliser des équipements dédiés pour chaque zone de travail (gants, blouse, pipettes, vortex, ) Décongeler tous les réactifs stockés à -20 C avant utilisation. Vortexer et centrifuger rapidement (centri-boule) tous les réactifs avant utilisation. Utiliser des pointes à filtre Lors de l extraction, il est recommandé de travailler sous PSM jusqu à la fin de l étape de lyse des échantillons. Il est recommandé de ne pas excéder 3 cycles de congélation-décongélation des réactifs, des échantillons, des lysats et des AN extraits. Suivant votre utilisation, nous vous préconisons de faire des aliquotes de volume adéquat. Travailler avec de l'arn est plus exigeant que de travailler avec de l'adn (instabilité de l'arn et omniprésence des RNases). Pour ces raisons, des précautions particulières doivent être prises : o Toujours porter des gants. o Traiter toutes les surfaces et les équipements avec des agents d inactivation des RNAses (disponible dans le commerce). o Après avoir mis des gants et décontaminé le matériel, minimiser les contacts avec les surfaces et les équipements pour éviter la réintroduction des RNases. o Utiliser des consommables «RNAse free». o Il est recommandé de conserver les ARN réfrigérés pendant la manipulation puis de les congeler dès que possible de préférence à -80 C ou à défaut à -20 C. o Ouvrir et refermer individuellement les tubes au fur et à mesure et limiter les durées d ouverture afin d éviter le contact avec les RNases présentes dans l environnement (peau, poussières, surfaces de travail ) Description des étapes à suivre : de l échantillon jusqu au résultat Prétraitement des fèces qrt-pcr Cette étape a pour but d homogénéiser les fèces afin d optimiser l extraction. Elle nécessite l utilisation de bille de verre non fourni dans les kits d extraction. Il est obligatoire d inclure un échantillon «contrôle négatif» (NCS) afin de valider l absence d inter-contamination des échantillons sur l ensemble du process. Pour ce contrôle, la matrice (fèces) est remplacée par de l eau (RNAse/DNAse free) et sera traitée en parallèle des échantillons d intérêt depuis l étape de prétraitement jusqu à l étape d extraction de l ARN incluse. 1. Dans un tube de 5 ou 15ml, ajouter 3 billes de verre de diamètre 2 mm (non fourni). 2. Ajouter 1g de fèces. 3. Ajouter 4 ml d eau RNAse/DNAse free (non fourni). 4. Vortexer 1 minute. 5. Transférer 1 ml de l homogénat dans un tube 1.5 ml (non fourni). 6. Centrifuger 1 min à g. 7. Transférer 500µl du surnageant dans un nouveau tube 1.5ml. Ce tube peut être conservé à -20 C. 100µl de ce surnageant sera utilisé pour l extraction ARN. Extraction d ARN BioSellal propose 2 kits d extraction : BioExtract Column (Cat. N BEC050 ou BEC250) basé sur l utilisation de colonne de silice, préconisé pour l extraction de 1 à échantillons en parallèle. BioExtract SuperBall (Cat. N BES384) basé sur l utilisation de billes magnétiques et l utilisation d automates tels que le KingFisher Duo ou Flex, préconisé pour l extraction en parallèle de 12 échantillons ou plus. Note : L IPC (bouchon violet) exogène fourni dans le Bio-T kit PDCoV, doit être utilisé à cette étape. Un protocole simplifié pour chaque méthode vous est proposé ci-dessous. Pour plus d informations, contacter notre service technique ou se reporter au manuel d utilisation dédié sur MUs/PDCoV/00001/FR 2 / 7

3 Protocole simplifié d extraction BioExtract Column Cat. N BEC050 1a. Préparer la solution de lyse LA-carrier (voir tableau 2) Tableau 2. Préparation de la solution de lyse LA-carrier Nombre d échantillons N* Réactif 1 6* 12* 24* 30* Buffer LA 100 µl 660 µl 1.32 ml 2.64 ml 3.3 ml Figure 1. Résumé des étapes du protocole d extraction d ARN avec le kit BioExtract Column (Cat.N BEC050) «Carrier RNA» (1 µg/µl) 1 µl 6.6 µl 13 µl 26.4 µl 33 µl IPC exogène (fourni, tube bouchon violet) 5 µl 33 µl 66 µl 132 µl 165 µl * Afin de compenser les erreurs de pipetages, le volume préparé est de 110% du volume requis. Le volume de tampon en excès doit être jeté. Ajuster les volumes en fonction du nombre d échantillons : multiplier les volumes indiqués pour 1 échantillon par le nombre d échantillons à traiter et multiplier par 1,1. 1b. Dans un tube de 1.5 ml (non fourni) : ajouter 20 µl de Protéinase K. 1c. Ajouter 100µl d échantillon pré-traité. 1d. Ajouter dans le tube 100 µl de solution de lyse LA-carrier. 1e. Vortexer et incuber 15 min à C (à température ambiante). 1f. Centrifuger brièvement (centri-boule) puis ajouter 350 µl de Buffer LB. 1g. Vortexer puis centrifuger brièvement (centri-boule). 2a. Transférer délicatement la totalité du volume (770µl) sur la colonne BioExtract Mini Spin Column (déjà placée dans un tube collecteur de 2 ml). 2b. Centrifuger à x g pendant 1 min. Changer de tube collecteur (Mettre la colonne BioExtract dans un nouveau tube collecteur et jeter le tube collecteur contenant le filtrat). 3a. Ajouter 600 µl de Buffer W1. 3b. Centrifuger à x g pendant 1 min. Changer de tube collecteur. 3c. Ajouter 600 µl de Buffer W2. 3d. Centrifuger à x g pendant 1 min. Changer de tube collecteur. 3e. Centrifuger à x g pendant 2 min pour sécher la membrane. 4a. Mettre la colonne BioExtract Mini Spin Column dans un nouveau tube de 1.5 ml (non fourni), et jeter le tube collecteur contenant le filtrat. 4b. Ajouter 60 µl de Buffer EL (à température ambiante ou préchauffé à 70 C) délicatement au centre de la membrane. 4c. Incuber à température ambiante (15 25 C) pendant 1 min. 4d. Centrifuger à x g pendant 1 min. 4e. Conserver l éluat contenu le tube de 1.5 ml et jeter la colonne. L ARN extrait peut être conservé à 4 C si la qrt-pcr est lancée dans la journée, sinon il est recommandé de le conserver à -80 C ou à défaut à -20 C. MUs/PDCoV/00001/FR 3 / 7

4 Protocole simplifié d extraction BioExtract SuperBall Cat. N BES384 (pour utilisation avec KingFisher TM Flex, Duo, ml) 1. Préparer les consommables pour la série d extraction : KingFisher TM Flex : 4 plaques Deep-wells et 2 microplaques. Les annoter en fonction de l élément à ajouter (voir Tableau 4). KingFisher TM Duo : 1 plaque Deep-well et 1 barrette d élution. KingFisher TM ml: 1 barrette par échantillon. Sortir le plateau coulissant de l automate et positionner les barrettes dessus. 2. Préparer la solution de lyse LAB-SMB-carrier (voir Tableau 3) Tableau 3. Préparation de la solution de lyse LAB-SMB-carrier Nombre d échantillons* Réactif Buffer LA 100 µl 500 µl 1 ml 1.3 ml 1.6 ml 4.9 ml 9.7 ml Buffer LB 400 µl 2 ml 4 ml 5.2 ml 6.4 ml 19.6 ml 38.8 ml SMB (SuperBall Magnetic Beads) 25 µl 125 µl 250 µl 325 µl 400 µl ml ml Carrier RNA (1 µg/µl) 1 µl 5 µl 10 µl 13 µl 16 µl 49 µl 97 µl IPC exogène (fourni, tube bouchon violet) 5 µl 25 µl 50 µl 65 µl 80 µl 245 µl 485 µl * Pour compenser les erreurs de pipetage, pour un nombre d échantillon supérieur à 11, il est recommandé de préparer la solution pour n+1 échantillons, comme indiqué dans le Tableau 3 pour les exemples à 12, 15, 48 et 96 échantillons. Ajuster les volumes en fonction du nombre d échantillons : multiplier les volumes indiqués pour 1 échantillon par le nombre d échantillons à traiter. Le volume de tampon en excès doit être jeté. Vortexer vigoureusement pendant 3 minutes avant la première utilisation ou 1 minute pour les utilisations suivantes. 1. Au fond des puits de la «Deep-well Lysat» pour le KingFisher TM Flex, des puits de la ligne A pour le KingFisher TM Duo ou des puits en position A des barrettes pour le KingFisher TM ml : Déposer 20 µl de protéinase K. Ajouter 100 µl d échantillon pré-traité. Vortexer vigoureusement la solution LAB-SMB-carrier pendant 30 secondes puis ajouter 500 µl de solution LAB-SMB-carrier à chaque échantillon. Tableau 4. Configuration des automates KingFisher TM Flex, Duo et ml et volume des réactifs ition sur la barrette ou la plaque Flex Duo* ml Elément à ajouter Volume par puits (µl) Deep-well Lysat Ligne A ition A Lysat 720 Deep-well Wash 1 Ligne E ition B Buffer W1 700 Deep-well Wash 2 Ligne F ition C Buffer W2 700 Deep-well Wash 3 Ligne G ition D Ethanol (96 100%) 750 Microplaque Elution Elution strip ition E Buffer EL 60 Microplaque Peigne (Large 96-Rod Cover) Ligne B A positionner manuellement Peigne * Les lignes C, D et H sont vides Inclut 20 µl de Protéinase K, 100 µl d échantillon et 500 µl de solution lyse LAB-SMB-carrier. 3. Placer les plaques dans l automate en ayant sélectionné le programme «BioExtract_KF_Flex», «BioExtract_KF_Duo» ou «BioExtract_KF_mL» et démarrer. 4. En fin de programme, récupérer les éluats. L ARN extrait peut être conservé à 4 C si la qrt-pcr est lancée dans la journée, sinon il est recommandé de le conserver à -80 C ou à défaut à -20 C. 2. Distribuer les autres réactifs, selon le Tableau 4. A faire extemporanément ou à fermer pour éviter toute évaporation ou contamination. MUs/PDCoV/00001/FR 4 / 7

5 Figure 2. Résumé des étapes du protocole d extraction d ARN avec le kit BioExtract SuperBall (Cat.N BES384) Détection du PDCoV en RT-PCR temps réel avec Bio-T kit PDCoV Procédure globale à suivre Il faut tout d abord établir un plan de plaque définissant la position de chaque échantillon et incluant les contrôles décrits ci-dessous: Contrôle négatif de processus (NCS) : l eau remplace l échantillon depuis le stade initial d extraction. Le tube Aqua-A (bouchon bleu), fourni, peut être utilisé. Ce contrôle est obligatoire pour chaque série d extraction. Contrôle négatif d amplification (NC) : l eau remplace l extrait ARN au moment du dépôt sur la plaque de qrt-pcr. Ce contrôle est recommandé lors de la 1 ère utilisation du kit ou pour vérifier l absence de contamination du master mix suite à un résultat non conforme avec le NCS. Le tube Aqua-A (bouchon bleu), fourni, peut être utilisé. Contrôle positif de détection du PDCoV (EPC) : ADN synthétique fourni (bouchon rouge, EPCPDCOV-A). Ce contrôle est obligatoire. Préparation de la plaque Dans la zone réservée au «MIX» 1. Après décongélation, vortex et rapide centrifugation, transférer 15µl de Master Mix MMPDCOV-A (bouchon gris) dans chaque puits d intérêt (échantillons et contrôles). Dans la zone dédiée à l ajout de l AN 2. Ajouter 5µl d ARN extrait (ou NCS ou eau ou EPC) / puits d intérêt Note : dans le cas où l IPC exogène n a pas été ajouté lors de l extraction des échantillons, il est possible de l ajouter au moment de la préparation de la plaque de qrt-pcr : ajouter 1 µl d IPC dilué au 1/5 (bouchon violet) en plus de l ARN extrait. 3. Filmer la plaque avec le film adapté Dans la pièce dédiée à l amplification PCR Pour avoir le programme KingFisher adéquat selon la version de l automate, veuillez contacter notre service technique (tech@biosellal.com) 4. Paramétrer le thermocycleur (voir tableau 5 et 6) : mode de fonctionnement, entrée du programme, du plan de plaque. 5. Il est recommandé de centrifuger la plaque avant de la positionner dans le thermocycleur, ceci permettra d éviter la présence de gouttes sur les parois et d éliminer au maximum les bulles. 6. Démarrer le programme en mode standard (voir tableau 6). Temps de run approximatif : 100 min. MUs/PDCoV/00001/FR 5 / 7

6 Paramètres de réglage du thermocycleur Ce kit a été développé sur ABI PRISM 7500 (Fast) (Applied BioSystem) et testé sur AriaMx (Agilent). Mode ABI PRISM 7500 (Fast) Quantitation Standard curve Non Fast ou Fast AriaMx Quantitative PCR, Fluorescence Probe Référence passive ROX ROX Pour d autres thermocycleurs, contacter notre service technique. Tableau 5. Paramètres de réglage du thermocycleur pour les détecteurs et le volume réactionnel Détecteurs Cible Reporter Quencher Volume final/ puits PDCoV FAM NFQ-MGB ou None* 20µl IPC Cy5 NFQ-MGB ou None* à attribuer aux échantillons et contrôles = 15µl MM + 5µl ARN extrait ou contrôles * Choix variable suivant le modèle de thermocycleur, si besoin contacter le Service Technique de BioSellal (tech@biosellal.com) Les contrôles sont les NC (=eau), NCS (=eau extraite) et EPC (ADN cible PEDV-all, TGEV et IPC). Tableau 6. Paramètrage du thermocycleur en mode standard. Programme mode Standard Cycles Temps Température 1 cycle 20 min 50 C 1 cycle 5 min 95 C 40 cycles 10 s 95 C 45 s + acquisition des données 60 C Interprétation des résultats : principaux cas de figures Lecture des Contrôles Tableau 7. Différents scénarios de résultats concernant les contrôles NCS = Ctl de processus OBLIGATOIRE NC = Ctl d amplification FACULTATIF EPC = Ctl de détection du PDCoV OBLIGATOIRE PDCoV (FAM) Cibles IPC (Cy5) Interprétation Validé Contamination probable avec un échantillon positif lors de l extraction ou de la préparation de plaque. Oubli d ajout d ARN IPC lors de l extraction? Problème d amplification ou de reverse transcription? voir l EPC et le NC Présence d inhibiteurs de qrt-pcr? Validé * CA : Certificat d Analyse. ou Contamination probable avec un échantillon positif lors la préparation de plaque. Validé Problème lors de la qpcr : oubli de l EPC? Erreur de master mix? Comme indiqué à l étape 2 (& Préparation de la plaque), dans le cas où l ajout d IPC a été omis lors de l extraction, l IPC peut être ajouté directement dans le puits de PCR à raison de 1µl / puits dilué au 1/5. Le volume final du puits sera porté à 21 µl. Ceci n a pas d impact sur l efficacité de PCR, il n est pas nécessaire de modifier le paramètre volume du thermocycleur. MUs/PDCoV/00001/FR 6 / 7

7 Lecture des Echantillons extraits Tableau 8. Différents scénarios de résultats concernant les échantillons PDCoV (FAM) Cibles * CA : Certificat d Analyse. IPC (Cy5) Interprétation Validé Négatif Validé itif pour PDCoV Validé itif Cet échantillon peut être considéré comme positif mais il est possible qu il y ait une inhibition partielle. Ainsi la valeur de Ct/Cq obtenue est non interprétable Résultats non interprétables Oubli d addition d ARN extrait lors de la préparation de la plaque? Présence d inhibiteurs (voir NCS) dans l échantillon? Liste des réactifs en option Une gamme de quantification du virus peut être réalisée en utilisant de l ARN PDCoV quantifié. Il peut également être utilisé afin de faire une adoption de méthode selon la norme U (partie 1) Tableau 10. Réactifs en option* Réactif Description Fournisseur Cat. N ARN PDCoV ARN quantifié PDCoV (10 6 copies/µl) BioSellal PDCOVARN001* *Ces réactifs sont disponibles uniquement à la demande, contacter BioSellal (contactiosellal.com) Liste des consommables et réactifs non fournis dans le kit Consommable / Réactif Tableau 9. Consommables et réactifs non fournis dans le kit Description Fournisseur Cat. N Tube 1.5 ml Microtube 1,5 ml pp safelock eppendorf Eppendorf * BioExtract Column Kit d extraction format colonne (50 ou 250) BioSellal BioExtract SuperBall Kit d extraction format billes magnétiques (4x 96) BioSellal Pour les consommables liés au thermocycleur, se reporter au manuel d utilisation de l appareil. * Les références indiquées dans ce tableau sont données à titre indicatif BEC050 ou BEC250* BES384* Support Technique tech@biosellal.com +33 (0) Renseignements et commandes contact@biosellal.com +33 (0) MUs/PDCoV/00001/FR 7 / 7