Hémogramme automatisé

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1 Hémogramme automatisé

2 Pentra 60 Horiba-ABX Pentra 120 Retic Horiba-ABX CELL-DYN 3700 Abbot Laboratories Coulter HMX Beckman Coulter

3 LH 1500 Series Automation Beckman Coulter CELL-DYN WorkCell Abbott Laboratories

4 Intérêt Cadence d analyse échantillons /heure en 18 paramètres Exactitude des résultats (2% à 5%) Contrôle qualité intégré aux manipulations

5 Le résultat de la formule dépend de critères: morphologiques: approche descriptive normalisée multicritère taille aspect du noyau aspect du cytoplasme chimiques analytiques

6 Chargement du tube Perçage du tube et prélèvement Segmentation des aliquotes

7 1- Mesure par impédance

8 Principe de la mesure par impédance Le passage de cellules en suspension dans un liquide conducteur à travers un orifice modifie la résistance électrique entre deux électrodes ( principe Coulter) Cette variation d impédance est enregistrée sous forme d impulsions

9 La variation d'impédance Electrode interne Vide régulé Electrode externe Micro-orifice 60 à 100 µm U Flux de diluant Milieu électrolyte très conducteur Temps

10 Une cellule coupe le champ électrique * diminution de la conductivité * augmentation de la résistance électrique Le nombre d impulsions enregistré correspond au passage des cellules La hauteur des impulsions est proportionnelle au volume de la cellule détectée d où identification

11 Le tri des impulsions (pulse edit) Les impulsions générées sont triées de façon à ne garder que celles correspondant à un passage standard Le flux de balayage ( sweep flow) un flux de diluant balaie l arrière des orifices, empêchant les cellules de retourner dans la zone de détection et de perturber l analyse ( surtout pour les plaquettes)

12 La correction de coïncidence Lorsque deux cellules traversent simultanément l orifice, elles ne génèrent qu une seule impulsion de forte intensité : c est le passage en coïncidence la fréquence de coïncidence est une loi statistiquement prévisible la correction est effectuée automatiquement par l analyseur

13 La distribution N O M B R E volume Les cellules sont classées en fonction de leur volume dans différents canaux, ce qui permet la construction des histogrammes érythrocytaire et plaquettaire

14 Un nombre élevé de canaux traduit avec précision la réalité * trop faible : ne rend pas compte de la répartition volumétrique vraie * trop élevé : chaque cellule devient unique Lkc et Erc canaux Plt 64 8 canaux 16 canaux

15 Application : les numérations Numération des érythrocytes Numération des thrombocytes Numération des leucocytes

16 Numération des Globules Rouges Electrode interne Vide régulé Bac de comptage des Rouges/Plt Electrode externe Comptage et mesure du volume à partir d'une suspension cellulaire Flux de diluant Toute particule d'un volume supérieur à 36 fl est comptée comme un globule rouge Les impulsions sont triées pour retenir celles correspondant au passage standard Le résultat est assujeti à une correction dite "correction de coïncidence"

17 Analyse érythrocytaire: 7 paramètres Dilution 1/6250 VGM triple comptage Mesure entre 24 et 360 fl en 256 canaux la plage fl représente les interférences

18 Indice de distribution érythrocytaire Coefficient de variation calculé à partir de la courbe érythrocytaire Donne l étalement de la distribution autour de la valeur moyenne modérément élevé: anisocytose indices très élevés: anomalies importantes ( double population, schizocytes, drépanocytes)

19 L'IDC ou IDR ou RDW L'IDC est une valeur statistique correspondant au CV % calculé sur la distribution des rouges = coefficient d'anisocytose IDC Normal < 15,5% IDC Elevé 18 % IDC très Elevé 35 %

20 Numération des Plaquettes Electrode interne Vide régulé Electrode externe Comptage et mesure du volume à partir d'une suspension cellulaire Zone sensible Flux de diluant Flux de balayage Les particules de volumes compris entre 2 et 20 fl sont comptées en tant que plaquette Le flux de balayage chasse les GR qui pourraient créer des impulsions parasites dans la zone sensible

21 Analyse plaquettaire : 4 paramètres VMP Mesures de 2 à 20 fl réparties en 64 canaux

22 interférences Les seuils sont variables, il y a toujours un risque d interférence

23 Numération leucocytaire Numération leucocytaire suspension où les érythrocytes ont été lysés dilution au 1/250 seuil de mesure 30 fl ( population décomptée à partir de 35fL) Remarque : le dosage de l hémoglobine sur la dilution des leucocytes méthode de Drabkin par spectrophotométrie

24 Lyse différentielle ou Cytolyse des leucocytes La membrane devient semiperméable Le cytoplasme est libéré La membrane se rétracte autour du noyau et des granulations Le volume final dépend de la taille du noyau, de sa lobularité et des granulations

25 La mesure de l impédance sur cytolyse permet d obtenir une formule «3 populations»

26 Bilan 1- Numération des GR/plaquettes et discrimination par seuil volumétrique 2- Numération des GB après lyse des GR 3- Dosage de l hémoglobine par méthode colorimétrique 4- Calculs : hématocrite, CCMH, TCMH Altération des de la morphologie des GB fl WBC,LY,MO,GR fl RBC,HGB,HCT,MCV,MCH, MCHC,RDC 2-20 fl PLT,PCT,MPV,PDW

27 2 Analyse cytométrique tridimensionnelle Détermination de la formule complète

28 Principe de la mesure optique Les cellules sont analysées les unes à la suite des autres grâce à un «gainage fluidique» (cytométrie de flux ) La cellule de mesure du cytomètre de flux comprend un banc optique devant lequel passent les cellules La lumière diffractée est analysée pour donner des informations sur la taille et la densité intracellulaire

29 La mesure optique Diluant Diluant Cellule photoélectrique SOURCE Diffraction lumineuse Diluant Echantillon Diluant La cellule passe individuellement devant un faisceau lumineux conventionnel (lampe halogène à vapeur de Hg ou de Xe) ou LASER (Argon, Kryton-Argon, Helium-Neon )

30 Diffraction lumineuse Grands angles = Densité intracellulaire (8-20 ) Faisceau laser Petits angles = Taille (1-6 ) Petits angles = Taille Grands angles = Densité intracellulaire

31 les différents paramètres utilisés pour l hémogramme automatisé Volume ou taille cellulaire Principe Coulter pour le volume ou mesure optique pour la taille Diffraction lumineuse Diffraction de la lumière par la cellule Conductivité ou Radio Fréquence (RF) Structure de la cellule par un courant haute fréquence Cytolyse Lyse différentielle des cellules Cytochimie Coloration de la cellule Marquage Marquage par des anticorps monoclonaux et fluorochromes

32 Impédance/Conductivité/Diffraction Coulter

33 1- le volume mesure par impédance 2- la diffraction laser 3- la conductivité Conductivité: analyse du noyau et de la composition chimique du cytoplasme en enregistrant les modifications subies par un courant haute fréquence traversant la cellules Simultanéité des mesures

34 3 mesures physiques pour la formule complète V o l u m e Diffraction : Surface,granulations Conductivité noyau

35 Exploration réalisée sur plus de 8000 cellules Analyse en 3D

36 Analyse en 256 canaux ( 16 millions de positions unitaires)

37 Le scattergramme DF1 (Abbott)

38 Taille/Cytolyse/Cytochimie (Activité peroxydasique) Bayer

39 Combinaison cytochimique Recherche de l activité myéloperoxydasique in situ (MPO) les lymphocytes sans peroxydase ne sont pas colorés (-) les monocytes sont faiblement colorés (+) les granulocytes neutrophiles sont fortement colorés (+++)

40 Petit angle 2/3 = Taille Taille/Cytolyse/Cytochimie (Peroxydase) Diffraction lumineuse enregistrée sous deux angles différents (Bayer) Lentille Miroir semitransparent Matrice PEROX Lentille Grand angle 5/15 = Activité Peroxydasique Miroir semitransparent Cellule photoélectrique Traitement des cellules ; révélation de l'activité peroxydasique

41 Analyse des Globules blancs large unstained cells débris cellulaires neutrophiles lymphocytes monocytes éosinophiles LUC: grandes cellules sans peroxydase ( GL stimulés ou blastes agranuleux des LA ou GLHB des MNI) Formule sur 7000 cellules

42 LUC N Mo L débris E

43 Petit angle 2/3 = Taille Taille/Cytolyse/Cytochimie (Peroxydase) Lentille Canal basophiles Miroir semitransparent Histogramme Basophiles Lentille Laser Grand angle 5/15 = Densité chromatinienne Cellule photoélectr ique Miroir semitransparent Traitement des cellules ; Lyse de tous les blancs sauf des Basophiles

44 Diagramme PEROX diagramme BASO TAILLE TAILLE LUC Mo Neutrophiles BASOS L y Débris Eosinophiles Noyaux monolobés Noyaux Polylobés DENSITE/SEGMENTATION

45 Taille/Cytolyse/Cytochimie (Coloration des Eo) Abx Horiba

46 Volume Absorbance Bruit de fond Ly Mo+Ba Ne Eo LyA GCI GCI Basophiles Noyaux GB Volume Nombre Histogramme Ba Matrice LMNE

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48 3 Le marquage spécifique - ADN: noyau - ARN : réticulocytes /plaquettes réticulées - Récepteurs membranaires : CD4/CD8

49 Diffraction lumineuse + Marquage ADN/ARN Abbott

50 Marquage de l ADN à l'iodure de propidium Lobularité Granulations Eosinophiles PMT2 90 Pol PMT1 90 Dépol Laser ARGON PMT3 Viabilité Blcs Erythroblastes 7 0 Complexité Numération Taille

51 Analyse de la fluorescence: Marquage des noyaux accessibles Leucocytes viables Leucocytes non viables Noyaux nus Les noyaux nus des cellules lysées et les noyaux des cellules mortes sont marqués par l'iodure de propidium

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53 Marquage fluorescent sur ARN Laser ARGON Réticulocytes PMT1 Filtre FL1 auto commutable PMT2 PMT3 7 0 Complexité Numération Taille

54 Réticulocytes Fluorescence vs Complexité

55 Réticulocytes : coloration au bleu de méthylène

56 Mesure des réticulocytes Pré-traitement: coloration au BCB et décoloration de l hémoglobine Réticulocytes en % réticulocytes en nombre absolu volume moyen indice de maturation

57 Diffraction lumineuse /Fluorescence Sysmex

58 cytolyse différentielle des cellules nucléées autres que les polynucléaires basophiles Comptage des PB par diffraction optique Lyse des globules rouges et des plaquettes les membranes des globules blancs sont rendues perméables au fluorochrome Fixation du fluorochrome sur l ARN et l ADN cellulaires Comptage par diffraction à petit angle, grand angle et intensité de fluorescence (3D)

59 4- Bilan Français Anglais Unités Nb érythrocytes Erc RBC 10 3 /mm 3 ou /L Concentration en Hb HGB g/dl Hémoglobine Hématocrite Ht HCT L/L VGM VMC MCV fl TCMH TCMH MCH pg CCMH CCMH MCHC L/dl de GR Indice de distribution IDC RDW % érythrocytaire IDR Nb plaquettes plt PLT 10 9 /L Volume plaquettaire moyen VMP MPV fl Thrombocrite TCT PCT L/L Indice de distribution IDP PDW % plaquettaire Nb de leucocytes Lkc WBC 10 9 /L Nb de neutrophiles Ne Ne 10 9 /L Nb de lymphocytes Ly Ly 10 9 /L Nb de monocytes Mo Mo 10 9 /L Nb d éosinophiles Eo Eo 10 9 /L Nb de basophiles Ba Ba 10 9 /L

60 Les alarmes Les messages quantitatifs anomalies par rapport à des valeurs seuils Les messages globaux ex: données erronées les messages de suspicion anomalies morphologiques, cellules immatures, blastes, poïkilocytose, agrégats plaquettaires, plaquettes géantes

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