cobas KRAS Mutation Test KRAS

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1 cobas KRAS Mutation Test DESTINÉ AU DIAGNOSTIC IN VITRO. cobas DNA Sample Preparation Kit DNA SP 24 Tests P/N: cobas KRAS Mutation Test KRAS 24 Tests P/N: AVIS : L achat de ce produit permet à l acheteur de l utiliser pour l amplification et la détection de séquences d acide nucléique par réaction en chaîne par polymérase (PCR) et des processus connexes pour les diagnostics humains in vitro. Aucun brevet général ni aucune licence de quelque sorte que ce soit en dehors de ce droit précis d utilisation concédé par l achat n est accordé. USAGE PRÉVU Le test de mutation cobas KRAS est un test de PCR en temps réel utilisé pour l'identification qualitative des mutations dans les codons 12, 13 et 61 du gène KRAS dans l'adn extrait de tissus de cancer colorectal humain (CCR) fixés à la formaline et enrobés de paraffine (FFPE). Le test vise à contribuer à l'identification des patients atteints de CCR au stade avancé peu susceptibles de tirer des bienfaits du traitement par anticorps monoclonal anti-egfr. Les échantillons sont traités à l'aide de la trousse de préparation des échantillons d'adn cobas pour la préparation manuelle des échantillons et à l'aide de l'analyseur cobas z 480 pour l'amplification et la détection automatisées. RÉSUMÉ ET EXPLICATION DU TEST Protéine KRAS : La protéine KRAS est un membre de la superfamille des petites protéines G. KRAS agit comme un commutateur régulé par GDP/GTP pour acheminer des signaux extracellulaires qui influencent la prolifération cellulaire, l'apoptose et le remodelage du cytosquelette d'actine. Les mutations touchant les acides aminés 12, 13 ou 61, qui ont lieu dans une variété de cancers humains, y compris le CCR, bloquent l'enzyme dans sa forme activée liée à la GTP, ce qui entraîne une signalisation constitutive et, par conséquent, contribue au processus oncogène 1. CCR : On observe des mutations KRAS dans 24 à 43 % des tumeurs colorectales 2-3. Bien que plus de mutations ponctuelles du gène KRAS aient été identifiées, la plupart ont lieu dans les codons 12 ou 13 (~82 % dans le codon 12 et ~17 % dans le codon 13); les mutations du gène KRAS dans d'autres codons (p. ex., codon 61) sont plus rares (1 à 4 % des mutations). Bien que les mutations du codon 61 soient rares, il a été montré qu'elles entraînaient l'activation constitutive du gène KRAS, tout comme le font les mutations des codons 12 et 13 4, et les données publiées indiquent que les mutations du codon 61 permettent de prédire l'absence de réponse au traitement par anticorps monoclonal anti-egfr 5-6. Le cetuximab et le panitumumab sont des anticorps monoclonaux qui ciblent l'egfr et dont l'utilisation est approuvée chez les patients atteints de cancer colorectal métastatique. Bien que 50 à 80 % des tumeurs colorectales surexpriment l'egfr, l'expression de la protéine et l'amplification du gène EGFR n'ont qu'une valeur prédictive limitée pour déterminer la probabilité de réponse au cetuximab ou au panitumumab 7. Toutefois, il existe désormais des données démontrant clairement que la présence de mutations du gène KRAS est en corrélation avec l'absence de réponse au traitement par anticorps anti-egfr chez les patients atteints de cancer colorectal métastatique et que, dans certaines situations, le recours au traitement par anticorps anti-egfr dans ce sous-groupe de patients peut être nocif 8-9. Les données à l'appui de ces constatations proviennent de : Analyses rétrospectives d'études à un seul groupe Analyses rétrospectives d'études randomisées Études randomisées prospectives 14 Du fait de ces études, les principales organisations d'oncologie aux États-Unis (ASCO, NCCN) et en Europe (ESMO) recommandent des tests de détection des mutations du gène KRAS pour la sélection des patients devant recevoir un traitement par anticorps anti-egfr 17. En outre, les organismes de réglementation des États-Unis et d'europe ont restreint l'utilisation de ces agents aux patients présentant une tumeur exprimant le gène KRAS de type sauvage Test de mutation cobas KRAS : Le test de mutation cobas KRAS est un dosage par PCR conçu pour détecter la présence de mutations somatiques liées aux codons 12, 13 et 61 du proto-oncogène KRAS et, ainsi, à identifier les patients atteints de CCR au stade avancé qui sont peu susceptibles de retirer des bienfaits du traitement par anticorps monoclonal anti-egfr FRC 1 Doc Rev. 4.0

2 PRINCIPES DE LA PROCÉDURE Le test de mutation cobas KRAS repose sur deux procédures principales : (1) préparation manuelle des échantillons pour obtenir de l'adn génomique à partir de tissu FFPE (fixés à la formaline, enrobés de paraffine); et (2) amplification par PCR de l'adn cible à l'aide de paires d'amorces complémentaires et de deux sondes oligonucléotidiques marquées par un fluorophore. Une sonde est conçue pour déceler la séquence des codons 12/13 de KRAS dans l'exon 2, tandis que la deuxième sonde sert à déceler la séquence du codon 61 de KRAS dans l'exon 3 du gène KRAS. Les mutations sont détectées par analyse de la courbe de fusion par l'analyseur cobas z 480. Chaque cycle contient un témoin mutant, un témoin négatif et un calibrateur pour confirmer la validité du cycle. Préparation des échantillons Les échantillons de tissu FFPE sont traités et l'adn génomique est isolé à l'aide de la trousse de préparation des échantillons d'adn cobas, une préparation manuelle standard reposant sur la liaison de l acide nucléique à des fibres de verre. Une coupe déparaffinée de 5 µm de tissu FFPE est lysée par incubation à température élevée à l'aide d'un tampon de liaison/lyse chaotrope et protéatique qui libère les acides nucléiques et protège l'adn génomique libéré contre des DNases. Ensuite, on ajoute de l isopropanol au mélange de lyse, qui est centrifugé dans une colonne contenant un filtre en fibres de verre. Au cours de la centrifugation, l'adn génomique se lie à la surface du filtre en fibres de verre. Les substances non liées, comme les sels, les protéines et autres impuretés cellulaires, sont retirées par centrifugation. Les acides nucléiques absorbés sont lavés puis élués dans une solution aqueuse. La quantité d'adn génomique est déterminée par spectrophotomètre et ajustée à une concentration fixe devant être ajoutée au mélange d'amplification/détection. L'ADN cible est ensuite amplifié et détecté sur l'analyseur cobas z 480 à l aide des réactifs d amplification et de détection fournis dans la trousse de test de mutation cobas KRAS. Amplification par PCR Sélection des cibles La trousse de test de mutation cobas KRAS utilise des amorces qui définissent une séquence de 85 paires de bases pour l'exon 2 contenant les codons 12 et 13 du proto-oncogène KRAS et une séquence de 75 paires de base pour l'exon 3 contenant le codon 61 du proto-oncogène KRAS dans de l'adn génomique humain. L'amplification n'a lieu que dans les régions du gène KRAS situées entre les amorces. Le gène KRAS n'est pas entièrement amplifié. Amplification des cibles Un dérivé de l'adn polymérase Thermus species Z05 est utilisé pour l'amplification de la cible. Le mélange réactionnel de PCR est d'abord chauffé afin de dénaturer l'adn génomique et d'exposer les séquences cibles aux amorces. À mesure que le mélange refroidit, les amorces en amont et en aval s hybrident avec les séquences d ADN cible. L'ADN polymérase Z05, en présence d'ion métallique divalent et de dntp en excès, allonge chaque amorce hybridée, synthétisant ainsi un deuxième brin d'adn. Le premier cycle de PCR est alors achevé, produisant une copie d'adn bicaténaire comprenant les régions cibles de 85 et de 75 paires de bases du gène KRAS. Ce processus est répété pendant un certain nombre de cycles, chaque cycle doublant effectivement la quantité d'adn d'amplicon. L'amplification n'a lieu que dans les régions du gène KRAS situées entre les paires d'amorces. Le gène KRAS n'est pas entièrement amplifié. Détection de mutation automatisée en temps réel L'analyseur cobas z 480 est capable de mesurer en temps réel la quantité de fluorescence générée par certains produits de PCR. Après l'amplification, chaque amplicon généré avec le test de mutation cobas KRAS est soumis à un programme de fusion dans lequel la température est augmentée progressivement de 40 à 95 C (TaqMelt). À basse température, la sonde spécifique de type sauvage est liée à l'amplicon de type sauvage et à l'amplicon mutant. À l'état lié, le fluorophore rapporteur marqué à la fluoroscéine à l'extrémité 5' de la sonde est suffisamment loin du fluorophore quencher à l'extrémité 3', ce qui permet au fluorophore d'émettre une longueur d'onde de lumière spécifique. À mesure que la température augmente, la sonde se dissocie de l'amplicon, ce qui permet au fluorophore quencher de se rapprocher du fluorophore rapporteur, ce qui réduit la quantité de fluorescence mesurable. L'amplicon correspondant parfaitement à la sonde (type sauvage) fond à une température plus élevée que l'amplicon ayant un ou plusieurs mésappariements (mutant). On mesure la quantité de fluorescence à chaque tranche d'augmentation de la température et on calcule la ou les températures de fusion. La présence d'une séquence de KRAS mutant dans les codons 12 et 13 de l'exon 2 et dans le codon 61 de l'exon 3 peut être décelée lorsque les températures de fusion se situent dans des plages précises. Pour éviter la détection des mutations silencieuses dans les codons 12 et 13 (pas de changement d'acide aminé), une base modifiée sert de base universelle et produit une température de fusion se situant dans la plage du type sauvage. Amplification sélective L'amplification sélective des acides nucléiques cibles à partir des échantillons est réalisée avec le test de mutation cobas KRAS au moyen de l'enzyme AmpErase (uracil-n-glycosylase) et du désoxyuridine triphosphate (dutp) 20. L enzyme AmpErase reconnaît les brins d ADN contenant de la désoxyuridine et en catalyse la destruction, mais pas celle de l ADN contenant de la thymidine. L'ADN naturel ne contient pas de désoxyuridine, alors que l'amplicon en contient toujours en raison de l'utilisation de dutp au lieu du triphosphate de thymidine comme un des nucléotides triphosphates du mélange réactionnel. Ainsi, seul l'amplicon contient de la désoxyuridine. La désoxyuridine rend les amplicons contaminants susceptibles d être détruits par l enzyme AmpErase avant l amplification de l ADN cible. L'enzyme AmpErase, contenue dans le mélange réactionnel, catalyse le clivage de l'adn contenant de la désoxyuridine au niveau des résidus de désoxyuridine, en ouvrant la chaîne de désoxyribose en position C1. Lorsqu'elle est chauffée au cours de la première étape du thermocyclage, à un ph alcalin, la chaîne d'adn de l'amplicon se scinde à la position de la désoxyuridine, rendant ainsi l'adn non amplifiable. L'enzyme AmpErase est inactive à une température supérieure à 55 C (c'est-à-dire pendant toutes les étapes du cycle thermique) et ne détruit donc pas l'amplicon cible. Il a été démontré que le test de mutation cobas KRAS désactivait par PCR au moins 10 3 copies de l'amplicon de KRAS mutant contenant de la désoxyuridine FRC 2 Doc Rev. 4.0

3 RÉACTIFS cobas DNA Sample Preparation Kit Trousse de préparation des échantillons d'adn cobas (P/N : ) DNA TLB (Tampon de lyse de tissu d'adn) Tampon Tris-HCl Chlorure de potassium 0,04 % d'edta 0,1 % de triton X-100 0,09 % d'azoture de sodium PK (Protéinase K) Protéinase K (lyophilisée) DNA PBB (Tampon de liaison de l'adn à la paraffine) Tampon Tris-HCl 49,6 % de chlorhydrate de guanidine 0,05 % d'urée 17,3 % de triton X-100 WB I (Tampon de lavage I de l'adn) Tampon Tris-HCl 64 % de chlorhydrate de guanidine WB II (Tampon de lavage II de l'adn) Tampon Tris-HCl Chlorure de sodium DNA EB (Tampon d'élution de l'adn) Tampon Tris-HCl 0,09 % d'azoture de sodium FT (Tubes de filtration avec bouchons) CT (Tubes de prélèvement) DNA SP 24 tests 1 x 10 ml 1 x 100 mg 1 x 10 ml 1 x 25 ml 1 x 12,5 ml 1 x 6 ml 1 x 25 unités 3 x 25 unités FRC 3 Doc Rev. 4.0

4 cobas KRAS Mutation Test (P/N : ) KRAS 24 tests KRAS MIX (mélange réactionnel de KRAS) Tampon tricine Acétate de potassium Hydroxyde de potassium Glycérol 4,76 % de diméthylsulfoxyde 0,1 % d'agent de conservation ProClin 300 < 0,9 % de dntp < 0,1 % d'adn polymérase Z05 (d'origine microbienne) < 0,1 % d'enzyme AmpErase (uracile-n-glycosylase) (d'origine microbienne) MGAC (Acétate de magnésium) Acétate de magnésium 0,09 % d'azoture de sodium KRAS OM1 (Mélange oligo KRAS 1) Tampon Tris-HCl EDTA ARN poly-ra (synthétique) 0,1 % d'agent de conservation ProClin 300 < 0,01 % des amorces KRAS d'amont et d'aval < 0,01 % de sonde KRAS marquée par colorant fluorescent KRAS OM2 (Mélange oligo KRAS 2) Tampon Tris-HCl EDTA ARN poly-ra (synthétique) 0,1 % d'agent de conservation ProClin 300 < 0,01 % des amorces KRAS d'amont et d'aval < 0,01 % de sonde KRAS marquée par colorant fluorescent KRAS MC (Témoin mutant KRAS) Tampon Tris-HCl EDTA ARN poly-ra (synthétique) 0,05 % d'azoture de sodium < 0,001 % d'adn plasmidique contenant les séquences KRAS de l'exon 2 et 3 (microbien) < 0,001 % d'adn de KRAS de type sauvage (culture cellulaire) KRAS CAL (calibrateur KRAS) Tampon Tris-HCl EDTA ARN poly-ra (synthétique) 0,05 % d'azoture de sodium < 0,001 % d'adn de KRAS de type sauvage (culture cellulaire) DNA SD (Diluant d'échantillon d'adn) Tampon Tris-HCl 0,09 % d'azoture de sodium 4 x 0,3 ml 4 x 0,2 ml 2 x 0,3 ml 2 x 0,3 ml 4 x 0,1 ml 4 x 0,1 ml 2 x 3,5 ml FRC 4 Doc Rev. 4.0

5 MISES EN GARDE ET PRÉCAUTIONS A. DESTINÉ AU DIAGNOSTIC IN VITRO. B. Ce test est destiné à être utilisé avec des échantillons de tissus de cancer colorectal fixés à la formaline et enrobés de paraffine. C. Ne pas pipetter à la bouche. D. Ne pas manger, boire ni fumer dans les zones de travail de laboratoire. E. Éviter la contamination des réactifs par des microbes et par l ADN. F. Éliminer les réactifs non utilisés et les déchets conformément à la réglementation nationale, fédérale, provinciale et locale. G. Ne pas utiliser les trousses après leur date de péremption. H. Ne pas mélanger de réactifs provenant de trousses ou de lots différents. I. Porter des gants et en changer entre la manipulation des échantillons et celle des réactifs pour éviter toute contamination. J. Pour éviter toute contamination du mélange réactionnel actif (MMX actif) avec les échantillons d'adn, l'amplification et la détection doivent être effectuées dans une zone séparée de celle de l'isolement de l'adn. La zone de travail d'amplification et de détection doit être soigneusement nettoyée avant d'effectuer la préparation du MMX actif. Pour un nettoyage adéquat, toutes les surfaces, y compris les portoirs et les pipetteurs, doivent être essuyées avec une solution d'hypochlorite de sodium à 0,5 %*, puis essuyés avec une solution d'éthanol à 70 %. K. Les solutions DNA PBB et WB I contiennent du chlorhydrate de guanidine. Si du liquide contenant ce tampon est renversé, nettoyer avec un détergent de laboratoire adéquat et de l'eau. En cas de déversement de liquide contenant des agents potentiellement infectieux, nettoyer la zone affectée d'abord avec du détergent de laboratoire et de l'eau, puis avec de l'hypochlorite de sodium à 0,5 %*. En cas de déversement de liquide sur l'analyseur cobas z 480, suivre les instructions du manuel de l'analyseur cobas z 480. * l'eau de Javel liquide vendue dans le commerce contient de l'hypochlorite de sodium à une concentration de 5,25 %. Une dilution de l'eau de Javel selon un rapport de 1:10 donnera une solution d'hypochlorite de sodium à 0,5 %. L. Les échantillons doivent être manipulés comme s'il s'agissait d'agents infectieux, en appliquant les procédures de laboratoire décrites dans le document Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 21 et dans le document M29-A3 22 du CLSI. M. DNA PBB contient du Triton X-100, irritant pour les membranes muqueuses. Éviter tout contact avec les yeux, la peau et les membranes muqueuses. N. DNA TLB, DNA EB, MGAC, KRAS MC, KRAS CAL et DNA SD contiennent de l'azoture de sodium. L azoture de sodium peut réagir avec la tuyauterie en plomb et en cuivre et former des azotures métalliques très explosifs. Lors de l élimination des solutions contenant de l azoture de sodium dans les lavabos de laboratoire, rincer les drains à grande eau froide pour éviter l accumulation d azotures. O. Le xylène est un produit chimique dangereux et doit être utilisé dans une hotte chimique. Mettre au rebut avec les déchets chimiques conformément aux réglementations fédérale, provinciale, territoriale et locale. P. Porter des lunettes de protection, une blouse de laboratoire et des gants jetables lors de la manipulation de tout réactif. Éviter le contact de ces matériaux avec la peau, les yeux ou les muqueuses. En cas de contact, rincer immédiatement à grande eau. Des brûlures peuvent apparaître en l absence de traitement. En cas de déversement, diluer avec de l eau avant d essuyer. Q. Tous les articles jetables sont à usage unique. Ne pas les réutiliser. R. Ne pas utiliser les articles jetables au-delà de leur date de péremption. S. Ne pas utiliser de solution d'hypochlorite de sodium (eau de Javel) pour nettoyer l'analyseur cobas z 480. Nettoyer l'analyseur cobas z 480 en suivant les procédures détaillées dans le manuel de l'analyseur cobas z 480. T. Pour plus d'information sur les mises en garde, précautions et procédures visant à réduire le risque de contamination pour l'analyseur cobas z 480, consulter le manuel de l'analyseur cobas z 480. U. Il est recommandé d'utiliser des pipettes stériles jetables et des embouts de pipetteur sans DNase FRC 5 Doc Rev. 4.0

6 CONSERVATION ET MANIPULATION A. Conserver DNA TLB, DNA PBB, WB I, WB II, DNA EB, PK, FT et CT à une température située entre 15 et 30 C. Une fois ouverts, DNA TLB, DNA PBB, WB I, WB II, DNA EB et PK restent stables pendant 8 utilisations, pendant 90 jours ou jusqu'à la date de péremption, selon la première éventualité. B. Après ajout d'eau stérile sans nucléase à PK, conserver la solution PK reconstituée non utilisée par aliquotes de 450 µl à -20 C. Une fois reconstituée, la solution PK doit être utilisée dans les 90 jours ou avant la date d expiration, selon la première éventualité. C. Après l'ajout d'éthanol absolu, conserver WB I et WB II à une température comprise entre 15 et 30 C. Ces solutions actives restent stables pendant 90 jours ou jusqu'à la date de péremption, selon la première éventualité. D. Conserver KRAS MIX, MGAC, KRAS OM1, KRAS OM2, KRAS MC, KRAS CAL et DNA SD à une température comprise entre -25 et -15 C. Après ouverture du flacon, ces réactifs restent stables pour 4 utilisations, pendant 60 jours ou jusqu'à la date de péremption, selon la première éventualité. E. Laisser tous les réactifs décongeler à une température comprise entre 15 et 30 C pendant au moins 1 heure avant l'utilisation. Une fois les réactifs décongelés, ils doivent être utilisés dans un délai d'une heure. Tout réactif non utilisé doit être replacé à une température de -25 à -15 C dans un délai d'une heure. Une fois ouvert, chaque flacon de réactif, à l'exception du flacon de DNA SD, peut être utilisé pour pipetter un maximum de 4 aliquotes, pendant 60 jours ou jusqu'à la date de péremption, selon la première éventualité. F. KRAS OM1, KRAS OM2 et le MMX actif (préparé en ajoutant KRAS OM1 ou KRAS OM2 et MGAC à KRAS MIX) doivent être protégés d'une exposition prolongée à la lumière. G. Une fois préparé, le MMX actif doit être conservé à une température de 2 à 8 C dans l'obscurité. Les échantillons et témoins préparés doivent être ajoutés dans l'heure qui suit la préparation du MMX actif. H. Les échantillons traités (ADN extrait) restent stables pendant un maximum de 24 heures à une température comprise entre 15 et 30 C, un maximum de 14 jours entre 2 et 8 C ou un maximum de 60 jours entre -15 et -25 C après avoir subi 3 cycles de congélation/décongélation avec conservation à une température de -15 à -25 C. L'ADN extrait doit être amplifié au cours des périodes recommandées de conservation ou avant la date de péremption indiquée sur la trousse de préparation des échantillons d'adn cobas pour extraire l'adn, selon la première éventualité. I. L'amplification doit être démarrée au maximum 1 heure après l'ajout des échantillons et des témoins traités au MMX actif (préparé par l'ajout de KRAS OM1 ou de KRAS OM2 et de MGAC à KRAS MIX). MATÉRIEL FOURNI A. cobas DNA Sample Preparation Kit DNA SP 24 tests Trousse de préparation des échantillons d'adn cobas (P/N : ) DNA TLB (Tampon de lyse de tissu d'adn) PK (Protéinase K) DNA PBB (Tampon de liaison à la paraffine de l'adn) WB I (Tampon de lavage I de l'adn) WB II (Tampon de lavage II de l'adn) DNA EB (Tampon d élution de l'adn) FT (Tubes de filtration avec bouchons) CT (Tubes de prélèvement) FRC 6 Doc Rev. 4.0

7 B. cobas KRAS Mutation Test KRAS 24 tests (P/N : ) KRAS MIX (Mélange réactionnel) (bouchon avec bouton de couleur naturelle) MGAC (Acétate de magnésium) (bouchon avec bouton jaune) KRAS OM1 (Mélange oligo KRAS 1) (bouchon avec bouton blanc) KRAS OM2 (Mélange oligo KRAS 2) (bouchon avec bouton doré) KRAS MC (Témoin mutant KRAS) (bouchon avec bouton rouge) KRAS CAL (calibrateur KRAS) (bouchon avec bouton violet) DNA SD (Diluant d'échantillon d'adn) MATÉRIEL NÉCESSAIRE MAIS NON FOURNI Xylène (Sigma, n de réf ou Fisher Scientific, n de réf. X5-4) Éthanol absolu (Sigma, n de réf. E7023 ou Fisher Scientific, n de réf. BP ) Isopropanol (Sigma, n de réf ou Fisher Scientific, n de réf. A451-1) Eau stérile sans nucléase (eau de qualité PCR Applied Biosystems, n de réf. AM9937 ou eau de qualité pour biologie moléculaire Thermo Scientific Molecular, n de réf. SH ) Pipettes sérologiques stériles et jetables : 5 ml et 25 ml Plaque à micropuits (plaque AD) et film scelleur (Roche P/N ) du système cobas 4800 Applicateur de film scelleur cobas 4800 (Roche P/N ) Pipetteurs multi-canaux* (capacité 10 µl, 20 µl, 200 µl et µl) avec embouts de protection contre les aérosols ou à déplacement positif, exempts de DNase Dispositif d'aide au pipetage (Drummond P/N : ou équivalent) Microcentrifugeuse de table standard avec capacité de x g et de à x g (Eppendorf 5417C ou équivalent)** Deux (2) blocs à chaleur sèche avec capacité de chauffage de tubes de microcentrifugeuse à 56 C et 90 C** Tubes de microcentrifugeuse Safe-Lock de 1,5 ml, stériles, sans RNase/DNase, de qualité PCR (Eppendorf, n de réf ) Spectrophotomètre UV-Vis Nanodrop (Thermo Scientific ND-1000 ou ND-2000)** Mélangeur vortex** Portoirs pour tubes de microcentrifugeuse Gants jetables, non poudrés Thermomètres étalonnés pour bloc à chaleur sèche** Bain-marie** pouvant maintenir une température de 37 C Lame à tranchant unique ou similaire Congélateur permettant un stockage à une température comprise entre -15 C et -25 C * Les pipetteurs doivent être entretenus conformément aux instructions du fabricant et leur précision ne doit pas différer de plus de 3 % du volume déclaré. Utiliser des embouts à filtre (protection contre les aérosols) ou à déplacement positif et exempts de DNase chaque fois que cela est spécifié afin d'éviter toute dégradation de l'échantillon et toute contamination croisée. ** Tout le matériel doit être entretenu correctement, conformément aux instructions du fabricant FRC 7 Doc Rev. 4.0

8 Instruments et logiciel Analyseur cobas z 480 Unité de contrôle du système cobas 4800 SR2 avec image Windows XP Logiciel du système cobas 4800 SR2, version 2.0 ou ultérieure Logiciel d'analyse KRAS, version 1.0 ou ultérieure Lecteur de codes-barres ext. USB Imprimante PRÉLÈVEMENT, TRANSPORT ET CONSERVATION DES ÉCHANTILLONS manipuler tous les échantillons comme s ils étaient capables de transmettre des agents infectieux. A. Prélèvement des échantillons Les échantillons de tissu FFPE de cancer colorectal ont été validés pour une utilisation avec le test de mutation cobas KRAS. B. Transport des échantillons Les échantillons de tissu FFPE peuvent être transportés à une température comprise entre 15 C et 30 C. Le transport des échantillons de tissu FFPE doit satisfaire aux normes fédérales, provinciales, territoriales et locales pour le transport d'agents étiologiques 23. C. Conservation des échantillons Les échantillons de tissu FFPE peuvent être conservés à une température comprise entre 15 C et 30 C pendant 12 mois après la date de prélèvement du tissu. Les sections de 5 µm montées sur lames peuvent être conservées à une température comprise entre 15 et 30 C pendant 60 jours. MODE D EMPLOI seules des sections de tissu FFPE de 5 µm d'épaisseur ayant un contenu tumoral inférieur à 10 % peuvent être utilisées dans le test de mutation cobas KRAS. Tout échantillon ayant un contenu tumoral inférieur à 10 % devra subir une macro-dissection avant l'extraction de l'adn. se référer au manuel de l'analyseur cobas z 480 pour des instructions d'utilisation détaillées concernant l'analyseur cobas z 480. les blocs à chaleur sèche permettant de chauffer les tubes de centrifugeuse doivent être allumés et réglés à 56 C et 90 C. Taille des cycles Un unique cycle d'analyse peut comprendre de 1 à 45 échantillons (plus les témoins et le calibrateur) par plaque à 96 micropuits. Lors d'un cycle contenant plus de 24 échantillons, plusieurs trousses de test de mutation cobas KRAS d'un même lot seront nécessaires. Le test de mutation cobas KRAS contient suffisamment de réactifs pour 8 cycles de 3 échantillons (plus les témoins et le calibrateur) pour un maximum de 24 échantillons par trousse. Procédure de travail Le test de mutation cobas KRAS consiste en une préparation manuelle des échantillons à l'aide de la trousse de préparation des échantillons d'adn cobas suivie de l'amplification/la détection sur l'analyseur cobas z 480 à l'aide de la trousse de test de mutation cobas KRAS FRC 8 Doc Rev. 4.0

9 Préparation des réactifs 1. Reconstituer la protéinase K (PK) en ajoutant 4,5 ml d'eau stérile sans nucléase (de qualité PCR) au flacon à l'aide d'une pipette sérologique jetable et stérile de 5 ml. Mélanger en retournant le flacon 5 à 10 fois. Aliquoter 450 µl de PK reconstituée dans des tubes Safe-Lock de microcentrifugeuse de 1,5 ml et conserver à -20 C. Si la protéinase K a déjà été reconstituée et congelée, décongeler un nombre suffisant d'aliquotes pour traiter le nombre d'échantillons à analyser avant le déparaffinage (il faut 70 µl de PK reconstituée pour chaque échantillon). 2. Toutes les solutions conservées entre 15 et 30 C doivent être claires. En présence d'un précipité dans l'un des réactifs, chauffer la solution dans un bain-marie à 37 C jusqu'à dissolution du précipité. Ne pas utiliser tant que tous les précipités ne sont pas dissous. 3. Préparer le Tampon de lavage I de l'adn (WB I) actif en ajoutant 15 ml d'éthanol absolu au flacon de WB I. Mélanger en retournant le flacon 5 à 10 fois. Noter sur le flacon que l'éthanol a été ajouté, avec la date. Conserver le tampon WB I actif à une température comprise entre 15 et 30 C. 4. Préparer le Tampon de lavage II de l'adn (WB II) actif en ajoutant 50 ml d'éthanol absolu au flacon de WB II. Mélanger en retournant le flacon 5 à 10 fois. Noter sur le flacon que l'éthanol a été ajouté, avec la date. Conserver le tampon WB II actif à une température comprise entre 15 et 30 C. Déparaffinage des sections de tissu FFPE montées sur lames si l'échantillon a un contenu tumoral inférieur à 10 %, la section doit être montée sur une lame pour macrodissection. le xylène est un produit chimique dangereux. Toutes les étapes du déparaffinage doivent être effectuées sous une hotte chimique. Voir «Mises en garde et précautions». A. Ajouter une lame sur laquelle est montée une section de tissu FFPE de 5 µm dans un récipient contenant une quantité suffisante de xylène pour recouvrir le tissu; laisser tremper pendant 5 minutes. B. Transférer la lame vers le récipient avec une quantité d'éthanol absolu suffisante pour recouvrir le tissu; laisser tremper pendant 5 minutes. C. Retirer la lame de l'éthanol et laisser la section sécher complètement à l'air (5 à 10 minutes). D. Effectuer une macro-dissection si l'échantillon a un contenu tumoral inférieur à 10 %. E. Étiqueter un tube Safe-Lock de microcentrifugeuse de 1,5 ml pour chaque échantillon, avec l'information d'identification de l'échantillon. F. Ajouter 180 µl de DNA TLB dans le tube Safe-Lock de microcentrifugeuse de 1,5 ml. G. Ajouter 70 µl de PK reconstituée dans le tube Safe-Lock contenant du DNA TLB. H. Racler le tissu pour le retirer de la lame et le placer dans le tube Safe-Lock. Immerger le tissu dans le mélange DNA TLB/PK. I. Continuer avec l'étape A de la procédure Isolation de l'adn. Déparaffinage des sections de tissu FFPE non montées sur lames le xylène est un produit chimique dangereux. Toutes les étapes du déparaffinage doivent être effectuées sous une hotte chimique. Voir «Mises en garde et précautions». A. Placer une section de tissu FFPE de 5 µm dans un tube Safe-Lock de microcentrifugeuse de 1,5 ml étiqueté avec l'information d'identification d'échantillon pour chaque échantillon. B. Ajouter 500 µl de xylène au tube Safe-Lock contenant la section de tissu FFPE. C. Bien mélanger au vortex pendant 10 secondes. D. Laisser le tube reposer pendant 5 minutes à une température comprise entre 15 et 30 C. E. Ajouter 500 µl d'éthanol absolu et mélanger au vortex pendant 10 secondes. F. Laisser le tube reposer pendant 5 minutes à une température comprise entre 15 et 30 C. G. Centrifuger les unités entre x g et x g pendant 2 minutes. Retirer le surnageant sans disperser le culot. Mettre le surnageant au rebut avec les déchets chimiques FRC 9 Doc Rev. 4.0

10 H. Ajouter 1 ml d'éthanol absolu et passer au vortex pendant 10 secondes. I. Centrifuger les unités entre x g et x g pendant 2 minutes. Retirer le surnageant sans disperser le culot. Mettre le surnageant au rebut avec les déchets chimiques. si le culot flotte dans le surnageant restant, centrifuger à nouveau pendant 1 minute entre x g et x g. Retirer tout surnageant restant. J. Sécher le culot tissulaire pendant 10 minutes à 56 C dans un bloc chauffant, le tube étant ouvert. s'assurer que l'éthanol s'est complètement évaporé et que le culot est sec avant de passer à l'étape suivante. si nécessaire, les culots séchés peuvent être conservés 24 heures à une température comprise entre 2 et 8 C. K. Remettre le culot tissulaire en suspension dans 180 µl de Tampon de lyse de tissu d'adn (DNA TLB). L. Ajouter 70 µl de PK reconstituée. M. Continuer avec l'étape A de la procédure Isolation de l'adn. PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS Procédure d'isolation de l'adn traiter un témoin négatif en même temps que le ou les échantillons. Préparer le témoin négatif en combinant 180 µl de tampon de lyse de tissu d'adn (DNA TLB) et 70 µl de solution PK dans un tube pour microcentrifugeuse Safe-Lock de 1,5 ml étiqueté NEG CT. Le témoin négatif doit être traité en suivant la même procédure que pour les échantillons. A. Passer au vortex les tubes contenant le mélange échantillon/dna TLB/PK et le mélange de témoin négatif (NEG CT) pendant 30 secondes. le tissu doit être totalement immergé dans le mélange DNA TLB/PK. B. Placer les tubes dans le bloc chauffant à sec à 56 C et incuber pendant 60 minutes. C. Passer les tubes au vortex pendant 10 secondes. le tissu doit être totalement immergé dans le mélange DNA TLB/PK. D. Placer les tubes dans le bloc chauffant à sec à 90 C et incuber pendant 60 minutes. pendant l'incubation, préparer le nombre nécessaire de tubes de filtration (FT) avec bouchon à charnière en les plaçant sur un tube de prélèvement (CT) en étiquetant chaque bouchon FT avec les renseignements d'identification corrects de l'échantillon ou du témoin. chaque échantillon nécessite 1 FT, 3 CT et 1 tube d'élution (tube de microcentrifugeuse d'1,5 ml). pendant l'incubation, étiqueter le nombre nécessaire de tubes d'élution (tube de centrifugeuse de 1,5 ml) avec les renseignements d'identification corrects de l'échantillon ou du témoin. E. Laisser les tubes refroidir à une température comprise entre 15 et 30 C. Après refroidissement, centrifuger par à-coups pour recueillir le liquide provenant du bouchon. F. Ajouter 200 µl de DNA PBB à chaque tube et mélanger en pipettant et en rejetant 3 fois. G. Incuber les tubes à une température comprise entre 15 et 30 C pendant 10 minutes. H. Ajouter 100 µl d'isopropanol à chaque tube; mélanger le lysat en pipettant et en rejetant 3 fois. I. Transférer chaque lysat dans l'unité FT/CT correctement étiquetée. J. Centrifuger les unités FT/CT à x g pendant 1 minute. K. Placer chaque FT sur un nouveau CT. Jeter la fraction contenue dans l'ancien CT avec les déchets chimiques et mettre au rebut le CT utilisé de façon appropriée FRC 10 Doc Rev. 4.0

11 L. Ajouter 500 µl de WB I actif à chaque FT. la préparation du WB I actif est décrite à la section «Préparation des réactifs». M. Centrifuger les unités FT/CT à x g pendant 1 minute. N. Jeter la fraction contenue dans chaque CT avec les déchets chimiques. Replacer le FT sur le même CT. O. Ajouter 500 µl de WB II actif à chaque FT. la préparation du WB II actif est décrite à la section «Préparation des réactifs». P. Centrifuger les unités FT/CT à x g pendant 1 minute. Q. Placer chaque FT sur un nouveau CT. Jeter la fraction contenue dans l'ancien CT avec les déchets chimiques et mettre au rebut le CT utilisé de façon appropriée. R. Centrifuger les unités FT/CT entre x g et x g pendant 1 minute afin de sécher les membranes des filtres. S. Placer chaque FT dans un tube d'élution (tube de centrifugeuse de 1,5 ml) pré-étiqueté avec les renseignements d'identification de l'échantillon ou du témoin. Jeter la fraction contenue dans l'ancien CT avec les déchets chimiques et mettre au rebut le CT utilisé de façon appropriée. T. Ajouter 100 µl de DNA EB au centre de la membrane de chaque FT sans toucher la membrane du FT. U. Incuber le FT avec le tube d'élution à une température comprise entre 15 et 30 C pendant 5 minutes. V. Centrifuger le FT avec le tube d'élution à x g pendant 1 minute pour recueillir l'éluat dans le tube d'élution. Mettre au rebut le FT utilisé de façon appropriée. W. Fermer le bouchon du tube d'élution. Le tube d'élution contient le stock d'adn. Passer à l'étape A de la section Quantification de l'adn. Quantification de l'adn la mesure de la concentration de l'adn doit être effectuée immédiatement après la procédure d'isolation de l'adn et avant conservation. A. Mélanger chaque stock d'adn en le passant au vortex pendant 5 secondes. B. Quantifier l'adn à l'aide d'un spectrophotomètre UV-Vis Nanodrop (ND-1000 ou ND-2000) conformément au protocole indiqué par le fabricant. Utiliser DNA EB comme blanc pour l'instrument. Il est en moyenne nécessaire d'effectuer deux lectures cohérentes. Les deux mesures ne doivent pas différer de plus de ± 10 % l'une par rapport à l'autre lorsque les lectures de concentration d'adn sont 20,0 ng/µl. Pour des lectures de concentration d'adn < 20,0 ng/µl, les deux mesures ne doivent pas différer de plus de ± 2 ng/µl. Si les deux mesures diffèrent de +/- 10 % l'une par rapport à l'autre lorsque les lectures de la concentration d'adn sont 20,0 ng/µl ou de +/- 2 ng/µl lorsque les lectures de la concentration d'adn sont < 20,0 ng/µl, effectuer deux lectures supplémentaires jusqu'à ce que les conditions soient remplies. La moyenne de ces deux nouvelles mesures doit ensuite être calculée. le stock d'adn du témoin négatif traité (NEG CT) n'a pas à être mesuré. C. La concentration du stock d'adn des échantillons doit être 4 ng/µl pour effectuer le test de mutation cobas KRAS. Deux amplifications/détections sont effectuées par échantillon, en utilisant 25 µl d'une dilution à 2 ng/µl du stock d'adn (au total 50 ng d'adn) pour chaque amplification/détection. chaque stock d'adn doit avoir une concentration minimale de 4 ng/µl pour effectuer le test de mutation cobas KRAS. Si la concentration du stock d'adn est < 4 ng/µl, répéter les procédures de déparaffinage, d'isolation de l'adn et de quantification de l'adn pour cet échantillon à l'aide de deux sections de tissu FFPE de 5 µm. Pour les échantillons montés, après le déparaffinage, combiner le tissu des deux sections dans un tube, immerger le tissu dans le mélange DNA TLB + PK et réaliser l'isolation et la quantification de l'adn comme décrit plus haut. Pour les échantillons non montés, combiner deux sections dans un tube, immerger le tissu dans le mélange DNA TLB + PK et réaliser l'isolation et la quantification de l'adn comme décrit plus haut. Si le stock d'adn est toujours inférieur à 4 ng/µl, demander un autre échantillon FFPE. les échantillons traités (ADN extrait) restent stables pendant un maximum de 24 heures à une température comprise entre 15 et 30 C, un maximum de 14 jours entre 2 et 8 C ou un maximum de 60 jours entre -15 et -25 C après avoir subi 3 cycles de congélation/décongélation avec conservation à une température de -15 à -25 C. L'ADN extrait doit être amplifié au cours des périodes recommandées de conservation ou avant la date de péremption indiquée sur la trousse de préparation des échantillons d'adn cobas pour extraire l'adn, selon la première éventualité FRC 11 Doc Rev. 4.0

12 AMPLIFICATION ET DÉTECTION Préparation de l'instrument pour éviter toute contamination du MMX actif avec les échantillons d'adn, l'amplification et la détection doivent être effectuées dans une zone séparée de celle de l'isolation de l'adn. La zone de travail d'amplification et de détection doit être soigneusement nettoyée avant d'effectuer la préparation du MMX actif. Pour un nettoyage adéquat, toutes les surfaces, y compris les portoirs et les pipetteurs, doivent être essuyées avec une solution d'hypochlorite de sodium à 0,5 %, puis essuyés avec une solution d'éthanol à 70 %. L'eau de Javel liquide vendue dans le commerce contient de l'hypochlorite de sodium à une concentration de 5,25 %. Une dilution de l'eau de Javel selon un rapport de 1:10 donnera une solution d'hypochlorite de sodium à 0,5 %. Se référer au manuel de l'analyseur cobas z 480 pour des instructions détaillées concernant l'installation de l'appareil cobas z 480. Préparation de l'ordre de test Se reporter au manuel d'utilisation du système cobas 4800 pour obtenir des instructions détaillées sur les étapes de la procédure de travail KRAS sur le test de mutation cobas KRAS (manuel d'utilisation du test de mutation cobas KRAS). Calcul de la dilution du stock d'adn de l'échantillon Calcul de la dilution du stock d'adn à des concentrations comprises entre 4 ng/µl et 28 ng/µl les stocks d'adn des échantillons doivent être dilués immédiatement avant l'amplification et la détection. deux (2) amplifications/détections sont réalisées pour chaque échantillon, exigeant un volume total de 50 µl (25 µl chacun pour MMX 1 et MMX 2) d'une dilution de stock d'adn de 2 ng/µl (total de 100 ng d'adn). A. Pour chaque échantillon, calculer le volume (µl) de stock d'adn nécessaire : µl de stock d'adn = (70 µl x 2 ng/µl) concentration du stock d'adn [ng/µl] B. Pour chaque échantillon, calculer le volume (µl) de diluant d'échantillon d'adn (DNA SD) nécessaire : µl de DNA SD = 70 µl µl de stock d'adn Exemple : Concentration du stock d'adn = 6,5 ng/µl A. µl de stock d'adn = (70 µl x 2 ng/µl) 6,5 ng/µl = 21,5 µl B. µl de DNA SD = (70 µl 21,5 µl) = 48,5 µl Calcul de la dilution du stock d'adn à des concentrations > 28 ng/µl les stocks d'adn des échantillons doivent être dilués immédiatement avant l'amplification et la détection. deux (2) amplifications/détections sont réalisées pour chaque échantillon, exigeant un volume total de 50 µl (25 µl chacun pour MMX 1 et MMX 2) d'une dilution de stock d'adn de 2 ng/µl (total de 100 ng d'adn). A. Si la concentration du stock d'adn est > 28 ng/µl, utiliser la formule suivante pour calculer la quantité de diluant d'échantillon d'adn (DNA SD) nécessaire pour préparer au moins 70 µl de stock d'adn dilué. Cela permet d'assurer que chaque échantillon utilise un minimum de 5 µl de stock d'adn. B. Pour chaque échantillon, calculer le volume (µl) de DNA SD nécessaire pour diluer 5 µl de stock d'adn à 2 ng/µl : Exemple : Vol. de DNA SD nécessaire en µl = [(5 µl de stock d'adn x concentration du stock d'adn en ng/µl) / 2 ng/µl] 5 µl Concentration du stock d'adn = 31,7 ng/µl A. Vol. de DNA SD nécessaire en µl = [(5 µl x 31,7 ng/µl) / 2 ng/µl] 5 µl = 74,3 µl B. Utiliser le volume calculé de DNA SD pour diluer 5 µl de stock d'adn FRC 12 Doc Rev. 4.0

13 Dilution de l'échantillon retirer le diluant d'échantillon (DNA SD) de son lieu de conservation à une température comprise entre -15 et -25 C et le laisser décongeler entre 15 et 30 C pendant au moins 1 heure avant la dilution de l'adn. Passer chaque réactif au vortex pendant 5 secondes et recueillir le liquide au fond du tube avant utilisation. A. Préparer le nombre approprié de tubes Safe-Lock de microcentrifugeuse de 1,5 ml pour les dilutions de l'adn en les étiquetant avec les renseignements d'identification d'échantillon appropriés. B. À l'aide d'un pipetteur doté d'embouts avec filtre de protection contre les aérosols, pipetter les volumes calculés de DNA SD dans les tubes respectivement étiquetés. Pipetter 35 µl de DNA SD dans un tube Safe-Lock étiqueté NEG CT. C. Passer au vortex chaque stock d'adn et le témoin négatif pendant 5 à 10 secondes. D. À l'aide d'un pipetteur doté d'embouts avec filtre de protection contre les aérosols (nouvel embout pour chaque pipetage), pipetter délicatement le volume calculé de chaque stock d'adn dans le tube respectif contenant le DNA SD. Pipetter 35 µl de témoin négatif (éluat extrait) dans le tube NEG CT. E. Fermer les tubes et passer chacun au vortex pendant 5 à 10 secondes. F. Changer de gants. Préparation des mélanges réactionnels (MMX 1 et MMX 2) KRAS OM1, KRAS OM2 et le MMX actif sont sensibles à la lumière et doivent être protégés d'une exposition prolongée à la lumière. en raison de la viscosité du KRAS MIX et du MMX actif, pipetter lentement pour s'assurer que tout le mélange est complètement sorti de l'embout. KRAS MIX, KRAS OM1 et KRAS OM2 peuvent avoir une couleur de claire à jaune. Cela n'influe pas sur la performance du réactif. Préparer deux MMX actifs en vrac, un contenant KRAS OM1 et l'autre KRAS OM2, dans des tubes Safe-Lock distincts pour microcentrifugeuse de 1,5 ml. A. Calculer le volume de KRAS MIX nécessaire pour chaque MMX actif avec la formule suivante : Volume de KRAS MIX nécessaire = (nombre d'échantillons + 2 témoins + 1 calibrateur + 1) x 10 µl B. Calculer le volume de KRAS OM1 ou de KRAS OM2 nécessaire pour chaque MMX actif avec la formule suivante : Volume de KRAS OM1 ou KRAS OM2 nécessaire = (nombre d'échantillons + 2 témoins + 1 calibrateur + 1) x 10 µl C. Calculer le volume de MGAC nécessaire pour chaque MMX actif avec la formule suivante : Volume de MGAC nécessaire = (nombre d'échantillons + 2 témoins + 1 calibrateur + 1) x 6 µl Utiliser le tableau 1 pour déterminer le volume de chaque réactif nécessaire pour la préparation du MMX actif en fonction du nombre d'échantillons inclus dans le cycle d'analyse. Tableau 1 Volumes de réactifs nécessaires pour les mélanges réactionnels actifs MMX 1 et MMX 2 Volumes de réactifs nécessaires pour le MMX actif Nombre d'échantillons* KRAS Mix 10 µl KRAS OM1 ou OM2 10 µl MGAC 6 µl Volume total (µl) * Comprend des volumes suffisants pour 1 tube par échantillon, 2 tubes de témoin, 1 tube de calibrateur et un 1 tube supplémentaire FRC 13 Doc Rev. 4.0

14 D. Retirer le nombre approprié de flacons de KRAS MIX, de KRAS OM1, de KRAS OM2 et de MGAC conservés à une température comprise entre -25 et -15 C. Laisser tous les réactifs décongeler à une température comprise entre 15 et 30 C pendant au moins 1 heure avant l'utilisation. Passer chaque réactif au vortex pendant 5 secondes et recueillir le liquide au fond du tube avant utilisation. Étiqueter un tube pour microcentrifugeuse stérile pour le MMX 1 actif et le MMX 2 actif. les MMX actifs doivent être préparés dans un délai d'une heure une fois les réactifs décongelés. Une fois décongelés, remettre tous les réactifs restants non utilisés à une température comprise entre -25 et -15 C dans un délai d'une heure après l'utilisation. E. Ajouter le volume calculé de KRAS MIX aux tubes de MMX actif. F. Ajouter le volume calculé de KRAS OM1 ou de KRAS OM2 à leur tube de MMX actif respectif. G. Ajouter le volume calculé de MGAC aux tubes de MMX actif. H. Passer les tubes au vortex pendant 3 à 5 secondes afin d'assurer un mélange adéquat. les échantillons, les témoins et le calibrateur doivent être ajoutés à la plaque à micropuits dans un délai d'1 heure après la préparation des MMX actifs. utiliser uniquement les plaques à micropuits (plaque AD) et le film scelleur (Roche P/N ) du système cobas Figure 1 Disposition de la plaque d'échantillons A KRAS MC KRAS MC Échant. 6 Échant. 6 Échant. 14 Échant. 14 Échant. 22 Échant. 22 B KRAS NC KRAS NC Échant. 7 Échant. 7 Échant. 15 Échant. 15 Échant. 23 Échant. 23 C KRAS CAL KRAS CAL Échant. 8 Échant. 8 Échant. 16 Échant. 16 Échant. 24 Échant. 24 D Échant. 1 Échant. 1 Échant. 9 Échant. 9 Échant. 17 Échant. 17 E Échant. 2 Échant. 2 Échant. 10 Échant. 10 Échant. 18 Échant. 18 F Échant. 3 Échant. 3 Échant. 11 Échant. 11 Échant. 19 Échant. 19 G Échant. 4 Échant. 4 Échant. 12 Échant. 12 Échant. 20 Échant. 20 H Échant. 5 Échant. 5 Échant. 13 Échant. 13 Échant. 21 Échant. 21 Préparation de la PCR A. Pipetter 25 µl de MMX actif dans chaque puits réactionnel de la plaque à micropuits (plaque AD) nécessaire pour le cycle d'analyse. Ne pas toucher la plaque à l'extérieur du puits avec l'embout du pipetteur. Ajouter le MMX 1 actif (contenant KRAS OM1) dans les puits de la plaque à micropuits (plaque AD) dans les colonnes impaires (1, 3, 5, etc.) Ajouter le MMX 2 actif (contenant KRAS OM2) dans les puits de la plaque à micropuits (plaque AD) dans les colonnes paires (2, 4, 6, etc.) B. Pipetter 25 µl de KRAS MC dans les puits A1 et A2 de la plaque à micropuits (plaque AD); et bien mélanger à l'aide de la pipette en aspirant puis en distribuant le liquide dans le puits au moins deux fois. C. En utilisant un nouvel embout de pipetteur, pipetter 25 µl de NEG CT dans les puits B1 et B2 de la plaque à micropuits (plaque AD); bien mélanger à l'aide de la pipette en aspirant puis en distribuant le liquide dans le puits au moins deux fois. D. En utilisant un nouvel embout de pipetteur, pipetter 25 µl de KRAS CAL dans les puits C1 et C2 de la plaque à micropuits (plaque AD); bien mélanger à l'aide de la pipette en aspirant puis en distribuant le liquide dans le puits au moins deux fois. chaque cycle doit contenir un témoin positif (KRAS MC) dans les puits A1 et A2, un témoin négatif (NEG CT) dans les puits B1 et B2 et un calibrateur (KRAS CAL) dans les puits C1 et C2, sinon le cycle sera invalidé FRC 14 Doc Rev. 4.0

15 changer de gants selon les besoins afin d'éviter toute contamination entre les échantillons ainsi qu'une contamination via la face externe des tubes de réaction de PCR. E. En utilisant un nouvel embout de pipetteur pour chaque ADN d'échantillon dilué, ajouter 25 µl d'adn du premier échantillon dans les puits D1 et D2 de la plaque à micropuits (plaque AD); bien mélanger à l'aide de la pipette en aspirant puis en distribuant le liquide dans le puits au moins deux fois. Répéter cette procédure pour l'adn dilué du deuxième échantillon (puits E1 et E2). Suivre le modèle de la figure 1 jusqu'à ce que toutes les dilutions d'adn des échantillons aient été chargées sur la plaque à micropuits (plaque AD). S'assurer que tout le liquide est au fond des puits. F. Couvrir la plaque à micropuits (plaque AD) à l'aide du film scelleur (fourni avec les plaques). Utiliser l'applicateur de film scelleur afin de s'assurer que le film adhère bien à la plaque à micropuits (plaque AD). G. Vérifier que tout le liquide est dans le fond de chaque puits avant de démarrer la PCR. l'amplification et la détection doivent être démarrées dans un délai d'1 heure après l'ajout de la dilution d'adn du premier échantillon au MMX actif. Démarrage de la PCR Se reporter au manuel d'utilisation du test de mutation cobas KRAS pour obtenir des instructions détaillées sur les étapes de la procédure de travail KRAS. INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS l'ensemble des validations de cycle d'analyse et d'échantillon est effectué par le logiciel cobas un cycle d analyse valide peut comporter des résultats d échantillon valides et invalides. Si le cycle est valide, interpréter les résultats des échantillons comme le montre le tableau 2. Tableau 2 Interprétation des résultats du test de mutation cobas KRAS Résultat du test Résultat de la mutation Interprétation Mutation Detected Codon 12/13 ou codon 61 (les deux peuvent être présents) Mutation Not Detected* ou No Mutation Detected s.o. Mutation détectée dans le codon KRAS 12/13 ou 61, ou les deux. Mutation non détectée dans les codons 12/13 et 61 du KRAS. Invalid s.o. Résultat pour l'échantillon non valide. Répéter l'analyse des échantillons présentant des résultats invalides en suivant les instructions mentionnées à la section «Réanalyse des échantillons présentant des résultats invalides» ci-dessous. Failed s.o. Échec du cycle d'analyse en raison d'un problème matériel ou logiciel. Communiquer avec votre distributeur local Roche pour obtenir une assistance technique. * Un résultat «Mutation Not Detected» ou «No Mutation Detected» n'exclut pas la présence d'une mutation dans les sites des codons 12/13 ou 61 du KRAS, car les résultats dépendent du pourcentage de séquences mutantes, de l'intégrité des échantillons, de l'absence d'inhibiteurs et d'une quantité suffisante d'adn détectée. Réanalyse des échantillons présentant des résultats invalides A. Répéter la dilution du stock d'adn de l'échantillon invalide en démarrant à partir des procédures «Calcul de la dilution du stock d'adn de l'échantillon» et «Dilution de l'échantillon» de la section «AMPLIFICATION ET DÉTECTION». B. Après avoir effectué la dilution du stock d'adn à 2 ng/µl décrite à la section «Dilution de l'échantillon», continuer en effectuant la «Préparation des mélanges réactionnels (MMX 1 et MMX 2)» et le reste de la procédure d'amplification et de détection. si l'échantillon est toujours invalide après la réanalyse ou qu'il n'y a pas suffisamment de stock d'adn pour préparer une autre dilution à l'étape A de la «Réanalyse des échantillons présentant des résultats invalides», répéter toute la procédure d'analyse pour cet échantillon, en commençant par le déparaffinage et l'isolation de l'adn avec une nouvelle section de tissu FFPE de 5 µm FRC 15 Doc Rev. 4.0

16 CONTRÔLE DE QUALITÉ Chaque cycle d'analyse comprend un jeu de témoin mutant du test de mutation cobas KRAS (KRAS MC), un témoin négatif (NEG CT) et un calibrateur de KRAS (KRAS CAL) pour les mélanges réactionnels actifs MMX 1 et MMX 2. Un cycle d'analyse n'est valide que si les puits du témoin de KRAS mutant (KRAS MC) (A1 et A2), les puits du témoin négatif (NEG CT) (B1 et B2) et les puits du calibrateur KRAS (KRAS CAL) (C1 et C2) sont valides. Si le témoin de KRAS mutant (KRAS MC), le témoin négatif (NEG CT) ou le calibrateur de KRAS (KRAS CAL) pour les mélanges réactionnels actifs MMX 1 ou MMX 2 sont invalides, tout le cycle d'analyse est invalide et doit être répété. Préparer une nouvelle dilution du stock d'adn d'échantillon précédemment isolé afin de réaliser une nouvelle plaque à micropuits (plaque AD) avec les témoins adéquats pour effectuer une procédure d'amplification et de détection. Témoin positif Le résultat du témoin de KRAS mutant (KRAS MC) doit être «Valid» pour les deux mélanges réactionnels actifs MMX 1 et MMX 2. Si les résultats du témoin KRAS MC sont systématiquement non valides, communiquer avec le bureau local de Roche pour obtenir une assistance technique. Témoin négatif Le résultat du témoin négatif (NEG CT) doit être «Valid» pour les deux mélanges réactionnels actifs MMX 1 et MMX 2. Si les résultats du témoin NEG CT sont systématiquement non valides, communiquer avec le bureau local de Roche pour obtenir une assistance technique. Calibrateur Le résultat du calibrateur de KRAS (KRAS CAL) doit être «Valid» pour les deux mélanges réactionnels actifs MMX 1 et MMX 2. Si les résultats du témoin KRAS CAL sont systématiquement non valides, communiquer avec le bureau local de Roche pour obtenir une assistance technique. PRÉCAUTIONS RELATIVES À LA PROCÉDURE Comme pour le déroulement de tout test, de bonnes pratiques de laboratoire sont indispensables pour assurer la qualité de cette analyse. En raison de la sensibilité analytique élevée de ce test, il convient de porter une attention toute particulière pour éviter la contamination des réactifs et des mélanges d amplification. LIMITES DE LA PROCÉDURE 1. Ne tester que les types d échantillon indiqués. Le test de mutation cobas KRAS n'a été validé que pour une utilisation sur des échantillons de tissu FFPE de cancer colorectal. 2. Le test de mutation cobas KRAS n'a été validé que pour une utilisation avec la trousse de préparation des échantillons d'adn cobas (Roche P/N : ). 3. La détection d'une mutation dépend du nombre de copies présentes dans l'échantillon et peut être affectée par l'intégrité de l'échantillon, la quantité d'adn isolé, ainsi que par la présence de substances interférentes. 4. Pour que les résultats obtenus soient fiables, il faut que les échantillons aient été fixés, transportés, conservés et traités de façon appropriée. Suivre les procédures indiquées dans la présente notice et dans le manuel d'utilisation du test de mutation cobas KRAS. 5. L ajout de l enzyme AmpErase dans le mélange réactionnel du test de mutation cobas KRAS permet l amplification sélective de l ADN cible; toutefois, de bonnes pratiques de laboratoire et le respect strict des procédures décrites dans la présente notice sont nécessaires pour éviter la contamination des réactifs. 6. L utilisation de ce produit doit être limitée au personnel ayant reçu une formation sur les techniques de PCR et l utilisation du système cobas Seul l'analyseur cobas z 480 a été validé pour une utilisation avec ce produit. Aucun autre thermocycleur avec détection optique en temps réel ne peut être utilisé avec ce produit. 8. Étant donné les différences inhérentes entre les technologies, il est recommandé aux utilisateurs de réaliser des études de corrélation entre les méthodes dans leur laboratoire avant de passer d une technologie à une autre afin de caractériser les différences de technologie. 9. Les effets des autres variables potentielles, comme les variables relatives à la fixation de l'échantillon, n'ont pas été évalués. 10. Bien qu'il s'agisse d'un cas rare, des mutations à l'intérieur des régions de l'adn génomique du gène KRAS couvert par les amorces et/ou les sondes du test de mutation cobas KRAS peuvent entraîner l'échec de la détection de la présence d'une mutation. 11. La présence d inhibiteurs de la PCR peut entraîner des faux négatifs ou des résultats non valides FRC 16 Doc Rev. 4.0

17 12. Bien que cela se produise rarement (< 0,2 % 24 ), le test de mutation cobas KRAS indique qu'il n'a pas détecté de mutations (résultats «Mutation Not Detected») pour certaines mutations complexes et multiples du codon 12/13 et du codon 61, et affiche un résultat de réactivité croisée limitée pour les mutations à proximité du codon 12/13 sur l'exon 2 et du codon 61 sur l'exon 3, y compris le codon 59. Dans le cas d'un échantillon présentant une mutation dans les régions avoisinantes, il se peut que le test indique un résultat «Mutation Detected». 13 Le test de mutation cobas KRAS a été vérifié pour une utilisation avec 50 ng d'adn par puits réactionnel. Des quantités d'adn inférieures à 50 ng par puits réactionnel ne sont pas recommandées. 14. La procédure décrite ci-dessus doit être suivie pour détecter 5 % de séquences mutantes dans un bruit de fond d'adn de type sauvage pour les mutations KRAS 24 apparaissant au tableau 3. Tableau 3 Mutations détectées par le test de mutation cobas KRAS Mutation Changement AA ID COSMIC c.34g>t 12C 516 c.34g>a 12S 517 c.34g>c 12R 518 c.35g>t 12V 520 c.35g>a 12D 521 c.35g>c 12A 522 c.37g>t 13C 527 c.37g>a 13S 528 c.37g>c 13R 529 c.38g>a 13D 532 c.38g>c 13A 533 c.38g>t 13V 534 c.181c>a 61K 549 c.181c>g 61E 550 c.182a>c 61P 551 c.182a>g 61R 552 c.182a>t 61L 553 c.183a>c 61H (CAC) 554 c.183a>t 61H (CAT) 555 Gras = testé pour les plasmides ÉVALUATION DE LA PERFORMANCE NON CLINIQUE Sensibilité analytique La sensibilité analytique du test de mutation cobas KRAS a été étudiée à l'aide de panels de dilution préparés à partir de quatre types d'échantillons : Mélange de lignées cellulaires préparées en mélangeant des stocks d'adn obtenus à partir de lignées cellulaires de mutant KRAS et de lignées cellulaires KRAS de type sauvage. Mélange de plasmides préparés en mélangeant un plasmide contenant le KRAS mutant et des stocks d'adn tirés d'une lignée cellulaire KRAS de type sauvage. Mélanges d'échantillons préparés en mélangeant des stocks d'adn obtenus à partir d'échantillons de tissu FFPE de mutant KRAS et d'échantillons de tissu FFPE de KRAS de type sauvage. Stock d'adn extrait d'un échantillon de tissu FFPE individuel. Tous les échantillons utilisés dans cette étude ont été séquencés au moyen du séquenceur de génome FLX Titanium 454 (séquençage 454) afin de déterminer le pourcentage de mutation de chaque échantillon FRC 17 Doc Rev. 4.0

18 Sensibilité analytique du test de mutation cobas KRAS sur des mélanges de lignées cellulaires ou de plasmides L'ADN de lignées cellulaires colorectales contenant une mutation dans le codon 12 ou 13 de l'exon 2 du gène KRAS a été extrait puis mélangé avec des extraits d'adn d'une lignée cellulaire KRAS de type sauvage pour obtenir un échantillon à ~5 % de mutation, vérifié par séquençage 454. Trois panels de dilution distincts contenaient les dilutions suivantes : 50,0; 25,0; 12,5; 6,3; 3,1; 1,6; 0,8 et 0,4 ng/25 µl. Vingt-quatre (24) réplicats de chaque membre du panel ont été testés, à l'aide de chacun des 3 lots de trousse de test de mutation cobas KRAS (72 réplicats au total). La sensibilité a été déterminée par la plus faible quantité d'adn ayant donné un taux d'au moins 95 % de résultat KRAS «Mutation Detected», apparaissant au tableau 4. Tableau 4 Sensibilité du test de mutation cobas KRAS sur un mélange de lignées cellulaires de CCR ou de plasmides Mutation de KRAS Codon 12 (Exon 2) Codon 13 (Exon 2) Codon 61 (Exon 3) Type d'échantillon Mélange de lignées cellulaires Mélange de lignées cellulaires Mélange de plasmides Pourcentage de mutation* * Pourcentage moyen de mutation par séquençage 454 Quantité d'adn dans le membre du panel (ng/25 µl) pour atteindre un taux de «Mutation Detected» 95 % (n = 72 réplicats) 5,3 % 0,8 4,9 % 1,6 5,8 % 6,3 Le test a donné un taux de «Mutation Detected» de 95 % à 0,8 ng/25 µl, à 1,6 ng/25 µl et à 6,3 ng/25 µl (dilutions à 1:64, 1:32 et 1:8 de la concentration d'adn recommandée de 50 ng/25 µl) pour les mutations de KRAS dans les codons 12, 13 et 61, respectivement. Cela semble indiquer que le test permettra de détecter les mutations de KRAS testées lorsque ~87 % de l'adn est dégradé ou non amplifiable en raison du processus de fixation, en supposant que l'adn de la lignée cellulaire et du plasmide était à 100 % intact et amplifiable. Sensibilité analytique sur des échantillons de tissu FFPE et des mélanges d'échantillons Des extraits d'adn d'échantillons de tissu FFPE porteurs de mutations dans les codons 12, 13 et 61 de KRAS ont été mélangés avec des extraits d'échantillons de tissu FFPE de KRAS de type sauvage pour obtenir des échantillons à un niveau de mutation de ~5 %. Un échantillon naturel a été utilisé pour tester la mutation dans le codon 12 de KRAS. Les taux de mutation finaux pour tous les échantillons ont été vérifiés par séquençage 454. Chacun des échantillons/mélanges d'échantillons a été dilué pour produire les membres du panels (50,0; 25,0; 12,5; 6,3; 3,1; 1,6; 0,8 et 0,4 ng/25 µl). Le membre du panel de 50 ng/25 µl n'a pas été testé pour le mélange 2 pour le codon 61 de l'exon 3. Huit (8) réplicats de chaque membre du panel ont été analysés sur chacun des 3 lots de trousse de test de mutation cobas KRAS (n = 24/membre du panel). Le tableau 5 montre la sensibilité de chaque échantillon, déterminée par la plus faible quantité d'adn ayant donné un taux d'au moins 95 % de résultat KRAS «Mutation Detected». Tableau 5 Sensibilité du test de mutation cobas KRAS sur des échantillons et mélanges d'échantillons de CCR Mutation de KRAS Codon 12 (Exon 2) Codon 13 (Exon 2) Codon 61 (Exon 3) Type d'échantillon Pourcentage de mutation Quantité d'adn dans le membre du panel (ng/25 µl) pour atteindre un taux de «Mutation Detected» 95 % (n = 24 réplicats) Échantillon de tissu FFPE 4,3 % 3,1 Mélange de tissu FFPE 4,2 % 3,1 Mélange de tissu FFPE 4,7 % 3,1 Mélange de tissu FFPE 5,0 % 3,1 Mélange de tissu FFPE 4,6 % 1,6 Mélange de tissu FFPE 7,2 % 1,6 Mélange de tissu FFPE 4,4 % 3,1 Mélange de tissu FFPE 5,5 % 3,1 Mélange de tissu FFPE 3,8 % 6,3 Cette étude démontre que le test de mutation cobas KRAS peut détecter les mutations dans les codons 12, 13 et 61 de KRAS au taux de mutation ~5 % avec une concentration standard de 50 ng/25 µl. La capacité du test à détecter la mutation à des concentrations d'adn inférieures démontre que les échantillons peuvent contenir de l'adn dégradé ou non amplifiable provenant du processus de fixation, sans pour autant empêcher la détection FRC 18 Doc Rev. 4.0

19 Corrélation avec une méthode de référence Cent quatre-vingt-huit (188) échantillons de tissu FFPE de cancer colorectal ont été testés à l'aide de 2 lots de trousses de test de mutation cobas KRAS. Les tests de comparaison par séquençage bidirectionnel Sanger (2X) ont été effectués sur tous les échantillons. Les résultats discordants entre le test de mutation cobas KRAS et le test de séquençage bidirectionnel Sanger (2X) ont été résolus par un séquençage 454. Résultats du test de mutation cobas KRAS et du séquençage bidirectionnel Sanger (2X) L'information sur les échantillons et les résultats du séquençage bidirectionnel Sanger (2X) pour les 188 échantillons sont résumés au tableau 6. Sur les 188 échantillons, 81 présentaient une mutation dans le codon 12/13 de KRAS et 7 présentaient une mutation dans le codon 61 de KRAS, tandis que 107 des échantillons contenaient le gène KRAS de type sauvage ou présentaient une mutation dans un codon autre que le 12/13 de KRAS au séquençage Sanger, et 181 échantillons contenaient le gène KRAS de type sauvage ou présentaient une mutation dans un codon autre que le 61 de KRAS. Stade tumoral Tableau 6 Stade tumoral en fonction du séquençage Sanger Résultats du séquençage bidirectionnel Sanger (2X) Codon 12 Codon 13 Codon 61 Type sauvage Total % du total Stade I ,8 % Stade II ,4 % Stade III ,0 % Stade IV 17* 3* ,8 % Stade inconnu ,1 % Total ,0 % * Un des 81 échantillons mutants dans le codon 12/13 contenait des mutations à la fois dans les codons 12 et 13. Les résultats obtenus lors des tests des 188 échantillons de tumeur colorectale avec deux lots de réactifs du test de mutation cobas KRAS comparativement aux résultats obtenus avec le séquençage bidirectionnel Sanger 2X pour les mutations dans le codon 12/13 de l'exon 2 de KRAS et dans le codon 61 de l'exon 3 de KRAS apparaissent aux tableaux 7 et 8. Tableau 7 Comparaison du test de mutation cobas KRAS (lot 1) et du séquençage bidirectionnel Sanger (2X) cobas KRAS lot 1 Corrélation positive : 96,6 % (IC à 95 % : 90,3 à 98,8 %) Corrélation négative : 93,0 % (IC à 95 % : 86,3 à 96,6 %) Corrélation totale : 94,7 % (IC à 95 % : 90,4 à 97,1 %) MT : Mutant WT : Type sauvage * Un échantillon n'a pas été analysé avec le lot 1. Séquençage bidirectionnel Sanger (2X) MT Codon 12/13 MT Codon 61 WT Totaux MT Codon 12/ MT Codon WT Totaux * FRC 19 Doc Rev. 4.0

20 Tableau 8 Comparaison du test de mutation cobas KRAS (lot 2) et du séquençage bidirectionnel Sanger (2X) cobas KRAS lot 2 Corrélation positive : 96,6 % (IC à 95 % : 90,5 à 98,8 %) Corrélation négative : 93,0 % (IC à 95 % : 86,3 à 96,6 %) Corrélation totale : 94,7 % (IC à 95 % : 90,5 à 97,1 %) MT : Mutant WT : Type sauvage Séquençage bidirectionnel Sanger (2X) MT Codon 12/13 MT Codon 61 WT Totaux MT Codon 12/ MT Codon WT Totaux La concordance globale entre le test de mutation cobas KRAS et le séquençage bidirectionnel Sanger (2X) pour les mutations dans le codon 12/13 et le codon 61 de KRAS était de 94,7 % (total de 10 résultats discordants pour chaque lot) pour les deux lots de réactifs du test de mutation cobas KRAS. Analyse des échantillons discordants par séquençage 454 Les résultats discordants entre le test de mutation cobas KRAS et le séquençage bidirectionnel Sanger (2X) pour les lots 1 et 2 ont été résolus à l'aide du séquençage 454 et apparaissent aux tableaux 9 et 10. cobas KRAS lot 1 Tableau 9 Résultats du test de mutation cobas KRAS (lot 1) par rapport au séquençage bidirectionnel Sanger (2X) résolu par séquençage 454 Séquençage bidirectionnel Sanger (2X), résolu par séquençage 454 MT Codon 12/13 MT Codon 61 WT Totaux MT Codon 12/ Corrélation positive : 100,0 % (IC à 95 % : 95,9 à 100,0 %) Corrélation négative : 99,0 % (IC à 95 % : 94,4 à 99,8 %) Corrélation totale : 99,5 % (IC à 95 % : 97,0 à 99,9 %) MT : Mutant WT : Type sauvage * Un échantillon n'a pas été analysé avec le lot 1. MT Codon WT Totaux * Tableau 10 Comparaison du test de mutation cobas KRAS (lot 2) et du séquençage bidirectionnel Sanger (2X) cobas KRAS lot 2 Séquençage bidirectionnel Sanger (2X), résolu par séquençage 454 MT Codon 12/13 MT Codon 61 WT Totaux MT Codon 12/ Corrélation positive : 100,0 % (IC à 95 % : 95,9 à 100,0 %) Corrélation négative : 99,0 % (IC à 95 % : 94,4 à 99,8 %) Corrélation totale : 99,5 % (IC à 95 % : 97,0 à 99,9 %) MT : Mutant WT : Type sauvage MT Codon WT Totaux Après résolution, à l'aide du séquençage 454, des résultats discordants entre le test de mutation cobas KRAS et le séquençage bidirectionnel Sanger (2X), la concordance globale était de 99,5 % pour le premier et le deuxième lots de réactifs du test de mutation cobas KRAS FRC 20 Doc Rev. 4.0

21 Spécificité La spécificité du test de mutation cobas KRAS a été déterminée en testant 188 échantillons de tissu FFPE de cancer colorectal en conjonction avec l'étude de corrélation avec une méthode de référence. Séquençage Sanger La spécificité du test de mutation cobas KRAS a été calculée en déterminant le pourcentage d'échantillons de tissu FFPE identifiés en tant que KRAS de type sauvage par le séquençage bidirectionnel Sanger (2X) et correctement identifiés en tant que KRAS de type sauvage par le test de mutation cobas KRAS (pourcentage de corrélation négative). La spécificité (pourcentage de corrélation négative) obtenue entre le test de mutation cobas KRAS et le séquençage bidirectionnel Sanger (2X) pour les mutations dans le codon 12/13 et le codon 61 de KRAS, lors de l'analyse de 188 échantillons de tumeur, était de 93 % (tableaux 6 et 7) pour le premier et le deuxième lots de réactifs du test de mutation cobas KRAS. Analyse des échantillons discordants par séquençage 454 La spécificité s'est améliorée en passant à 99,0 % pour le premier et le deuxième lots (tableaux 8 et 9) de réactifs du test de mutation cobas KRAS après le séquençage 454 pour résoudre les résultats discordants entre le test de mutation cobas KRAS et le séquençage de l'adn bidirectionnel Sanger (2X) pour les tests de mutation dans le codon 12/13 et le codon 61 de KRAS. L'amélioration de la spécificité du test de mutation cobas KRAS après la résolution par séquençage 454 était principalement due à la capacité du séquençage 454 à détecter les mutations KRAS n'ayant pas été détectées par le séquençage Sanger en raison de la plus faible sensibilité du séquençage Sanger par rapport au séquençage 454. Réactivité croisée La réactivité croisée du test de mutation cobas KRAS a été évaluée par les études suivantes : Tests des plasmides des mutations silencieuses de KRAS Tests des plasmides homologues de KRAS Analyse de microorganismes liés au côlon La réactivité croisée a également été évaluée en déterminant si la présence de plasmides des mutations silencieuses de KRAS, de plasmides homologues de KRAS ou de microorganismes liés au côlon interférait dans la détection des mutations dans les codons 12, 13 et 61 de KRAS. Plasmides des mutations silencieuses de KRAS Des échantillons de plasmides dans un bruit de fond d'adn de lignée cellulaire de type sauvage ont été préparés et testés pour les trois mutations silencieuses dans le codon 12 de l'exon 2 de KRAS : GGA, GGC et GGG; trois mutations silencieuses dans le codon 13 de l'exon 2 de KRAS : GGA, GGT et GGG. Aucune réactivité croisée n'a été observée avec les plasmides pour les mutations silencieuses dans les codons 12 ou 13 de l'exon 2 de KRAS. Les mélanges de plasmides du codon 12 ou 13 de KRAS à 5 % de mutation dans un bruit de fond d'adn de lignée cellulaire de type sauvage ont été préparés et testés en présence de leurs plasmides des mutations silencieuses respectifs, et aucune interférence des plasmides des mutations silencieuses n'a été décelée. Plasmides homologues de KRAS Des échantillons contenant chacun des six plasmides homologues de KRAS (pseudogène de KRAS dans le codon 12/13, pseudogène dans le codon 61, N-RAS exon 2, N-RAS exon 3, H-RAS exon 2 et H-RAS exon 3) dans un bruit de fond d'adn de lignée cellulaire de type sauvage ont été préparés et testés en triple au moyen du test de mutation cobas KRAS. Aucune réactivité croisée n'a été observée avec les échantillons de plasmides. Les mélanges de plasmides des codons 12, 13 ou 61 de KRAS à 5 % de mutation dans un bruit de fond d'adn de lignée cellulaire de type sauvage ont été préparés et testés en présence de leurs plasmides homologues respectifs, et aucune interférence des plasmides homologues n'a été décelée. Microorganismes liés au côlon Les microorganismes liés au côlon suivants n'ont pas entraîné de réaction croisée dans le test de mutation cobas KRAS lorsqu'ils étaient ajoutés à 5 échantillons de type sauvage dans les codons 12, 13 et 61 de KRAS à 1 x 10 6 unités formatrices de colonies au cours de l'étape de lyse tissulaire : 1. Bacteroides caccae 2. Prevotella intermedia 3. Escherichia coli (E. coli) Les microorganismes testés n'ont pas non plus présenté d'interférence avec la détection des mutations dans le codon 12 (2 échantillons), dans le codon 13 (1 échantillon) ou dans le codon 61 (2 échantillons) de KRAS lorsque 1 x 10 6 unités formatrices de colonies étaient ajoutées au cours de l'étape de lyse tissulaire d'un échantillon contenant une mutation de KRAS aux taux indiqués au tableau FRC 21 Doc Rev. 4.0

22 Tableau 11 Pourcentage de mutation des échantillons testés pour lesquels l'interférence de microorganismes liés au côlon a été testée Interférence Numéro d'échantillon État de la mutation Pourcentage de mutation par séquençage Codon 12 15,9 2 Codon 12 16,1 3 Codon 13 42,8 4 Codon 61 17,0 5 Codon 61 19,8 Les triglycérides ( 37 mm, concentration élevée recommandée par le CLSI 25 ), l'hémoglobine ( 2 mg/ml, concentration élevée recommandée par le CLSI 25 ) et les tissus nécrotiques 50 % n'ont pas entraîné d'interférence avec le test de mutation cobas KRAS lorsque la substance potentiellement interférente était ajoutée à l'étape de lyse de la procédure de préparation des échantillons. Robustesse La robustesse du test de mutation cobas KRAS a été déterminée à l'aide d'un échantillon de tissu FFPE de cancer colorectal contenant une mutation dans le codon 12 de l'exon 2 de KRAS et un échantillon contenant une mutation dans le codon 61 de l'exon 3 de KRAS à un pourcentage de mutation de 13,1 % et de 17 %, respectivement. Chaque échantillon était sectionné en 100 sections de 5 µm pour l'analyse. L'ADN génomique a été extrait de chaque section à l'aide de la trousse de préparation des échantillons d'adn cobas. Un unique réplicat de l'adn génomique extrait a été testé pour chacune des 100 sections de chacun des deux échantillons. Dix cycles distincts ont été effectués avec 20 sections analysées par cycle à l'aide du test de mutation cobas KRAS. Cent pour cent (100 %) des réplicats ont rapporté des résultats «Mutation Detected» par le test de mutation cobas KRAS pour les échantillons de KRAS mutant dans le codon 12 et les échantillons de KRAS mutant dans le codon 61, soit un taux de faux négatifs de 0 %. Répétabilité La répétabilité du test de mutation cobas KRAS a été évaluée au moyen de huit échantillons de tissu FFPE de cancer colorectal. Les caractéristiques des échantillons sont décrites au tableau 12. Les échantillons ont été testés en double par deux opérateurs, à l'aide de deux lots de réactifs différents et de quatre analyseurs cobas z 480 sur 4 jours (n = 32/échantillon). Numéro de l'échantillon Tableau 12 Répétabilité des résultats du test de mutation cobas KRAS État de la mutation KRAS % mutation Mutation Detected (n = 32) Mutation Not Detected Pourcentage d'accord 1 Codon 12 16,4 % % 2 Codon 12 20,6 % % 3 Codon 13 16,7 % % 4 Codon 13 10,3 % % 5 Codon 61 28,1 % % 6 Codon 61 31,5 % % 7 Type sauvage % 8 Type sauvage % Le test de mutation cobas KRAS a montré une exactitude de résultat de 100 % (256/256) sur la combinaison de jours, d'échantillons, de réplicats, d'opérateurs et de lots de réactifs FRC 22 Doc Rev. 4.0

23 BIBLIOGRAPHIE 1. Shankaran V, Obel J, Benson III AB. Predicting response to EGFR inhibitors in metastatic colorectal cancer: current practice and future directions. The Oncologist : Samowitz WS, Curtin K, Schaffer D, et al. Relationship of Ki-ras mutations in colon cancers to tumor location, stage, and survival: a population-based study. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2000 Nov 9(11): Andreyev HJ, Norman AR, Cunningham D, et al. Kirsten ras mutations in patients with colorectal cancer: the 'RASCAL II' study. Br J Cancer 2001 Sep 1;85(5): Der CJ, Finkel T, Cooper GM. Biological and biochemical properties of human ras H genes mutated at codon 61. Cell 1986 Jan 17; 44: Loupakis F, Ruzzo A, Cremolini C, et al. KRAS codon 61, 146 and BRAF mutations predict resistance to cetuximab plus irinotecan in KRAS codon 12 and 13 wild-type metastatic colorectal cancer. Br J Cancer 2009 Aug 18;101(4): De Roock W, Claes B, Bernasconi D. et al. Effects of KRAS, BRAF, NRAS, and PIK3CA mutations on the efficacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer: a retrospective consortium analysis. Lancet Oncology, 2010 Aug 11(8): Siena S, Sartore-Bianchi A, Di Nicolantonio F, et al. Biomarkers predicting clinical outcome of epidermal growth factor receptortargeted therapy in metastatic colorectal cancer. J Natl Cancer Inst 2009 Oct 7;101(19): Bokemeyer C, Bondarenko I, Makhson A, et al. Fluorouracil, leucovorin, and oxaliplatin with and without cetuximab in the first-line treatment of metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol 2009 Feb 10;27(5): Tol J, Koopman M, Cats A, et al. Chemotherapy, bevacizumab, and cetuximab in metastatic colorectal cancer. N Engl J Med 2009 Feb 5;360(6): Lièvre A, Bachet JB, Le Corre D, et al. KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res 2006 Apr 15;66(8): Benvenuti S, Sartore-Bianchi A, Di Nicolantonio F, et al. Oncogenic activation of the RAS/RAF signaling pathway impairs the response of metastatic colorectal cancers to anti-epidermal growth factor receptor antibody therapies. Cancer Res 2007 Mar 15;67(6): Amado RG, Wolf M, Peeters M, et al. Wild-type KRAS is required for panitumumab efficacy in patients with metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol 2008 Apr 1;26(10): Karapetis CS, Khambata-Ford S, Jonker DJ, et al. K-ras mutations and benefit from cetuximab in advanced colorectal cancer. N Engl J Med 2008 Oct 23;359(17): Douillard J-Y, Siena S, Cassidy J et al. randomized, Phase III trial of panitumumab with infusional fluorouracil, leucovin, and Oxaliplatin (FOXFOX4) versus FOLFOX4 alone as first-line treatment in patients with previously untreated metastatic colorectal cancer: The PRIME Study. J Clin Oncol : Allegra CJ, Jessup JM, Somerfield MR, et al. American Society of Clinical Oncology provisional clinical opinion: testing for KRAS gene mutations in patients with metastatic colorectal carcinoma to predict response to anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody therapy. J Clin Oncol 2009 Apr 20;27(12): National Comprehensive Cancer Network. NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology. Colon cancer, 2010, v Van Cutsem E, Oliveira J; ESMO Guidelines Working Group. Advanced colorectal cancer: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol 2009 May;20 Suppl 4: Food and Drug Administration. Class labeling changes to anti-egfr monoclonal antibodies, cetuximab (Erbitux) and panitumumab (Vectibix): KRAS mutations. CDER/ucml htm. 19. European Medicines Agency: Committee for Medicinal Products for Human Use post-authorisation summary of positive opinion for Erbitux. Erbitux_ en.pdf. 20 Longo, M.C., Berninger, M.S. and Hartley, J.L Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene. 93: Chosewood, L.C. and Wilson, D.E. Biosafety and Microbiological and Biomedical Laboratories. HHS Publication Fifth # edition.(cdc) Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protection of Laboratory Workers from Occupationally Acquired Infections. Approved Guideline-Third Edition. CLSI Document M29-A3 Villanova, PA:CLSI, International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 52nd Edition Catalogue of Somatic Mutations in Cancer (COSMIC), 2011, v.51, Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) EP7-A2, Interference Testing in Clinical Chemistry; Approved Guidelines Second Edition, Appendix D FRC 23 Doc Rev. 4.0

24 Information sur les révisions apportées au document Doc Rev /2014 Doc Rev /2014 Doc Rev /2014 Doc Rev /2015 Première publication. La section 12 du paragraphe LIMITES DE LA PROCÉDURE a été mise à jour, avec comme nouvel énoncé : Bien que cela se produise rarement (< 0,2 % 24 ), le test de mutation cobas KRAS indique qu'il n'a pas détecté de mutations (résultats «Mutation Not Detected») pour certaines mutations complexes et multiples du codon 12/13 et du codon 61, et affiche un résultat de réactivité croisée limitée pour les mutations à proximité du codon 12/13 sur l'exon 2 et du codon 61 sur l'exon 3, y compris le codon 59. Dans le cas d'un échantillon présentant une mutation dans les régions avoisinantes, il se peut que le test indique un résultat «Mutation Detected». La section «Marques commerciales et brevets» a été mise à jour de manière à référencer les ressources en ligne uniquement. Mise à jour de l adresse du fabricant légal. Mise à jour de la section relative à l'usage prévu en tenant compte des commentaires de Santé Canada. Veuillez communiquer avec le représentant de Roche de votre région si vous avez d autres questions. Mise à jour des noms de mélanges Oligo afin de respecter la convention d'appellation de kit actuelle. Ajout du symbole GTIN et de la description à la page des symboles harmonisée. Veuillez communiquer avec le représentant de Roche de votre région si vous avez d autres questions. Mise à jour de la terminologie des mélanges Oligo dans l'ensemble du document. Suppression des symboles de danger et des mentions et codes d'avertissement de la section RÉACTIFS. Veuillez communiquer avec le représentant de Roche de votre région si vous avez d autres questions FRC 24 Doc Rev. 4.0

25 Fabriqué aux États-Unis Roche Diagnostics GmbH Sandhofer Strasse Mannheim, Germany Distributed by Roche Diagnostics 201, boulevard Armand-Frappier H7V 4A2 Laval, Québec, Canada (For Technical Assistance call: Pour toute assistance technique, appeler le: ) Marques commerciales et brevets Voir Roche Molecular Systems, Inc. 04/ Doc Rev FRC 25 Doc Rev. 4.0

26 Les symboles suivants sont en usage pour l étiquetage des produits diagnostiques par PCR de Roche. Logiciel auxiliaire Dispositif médical de diagnostic in vitro Mandataire dans la Communauté européenne Pour évaluation de performance IVD uniquement Fiche technique à codes-barres Limite inférieure de la plage assignée Code du lot Fabricant Risques biologiques Conserver dans un endroit sombre Référence du catalogue Limite de température Consulter les instructions d utilisation Fichier de définition de tests Suffisant pour <n> tests Limite supérieure de la plage assignée Contenu de la trousse Utiliser jusque Distributeur Code article international Ce produit répond aux exigences de la Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic in vitro. US Customer Technical Support FRC 26 Doc Rev. 4.0