TRAVAUX PRATIQUES DE BIOCHIMIE L1S1

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1 UNIVERSITÉ PARIS XII-VAL DE MARNE TRAVAUX PRATIQUES DE BIOCHIMIE L1S1 Année Les glucides p 1 Tamis moléculaire p 3 QUELQUES RECOMMANDATIONS IMPORTANTES Le port de la blouse est OBLIGATOIRE. Son oubli ainsi qu un retard non justifié seront sanctionnés par une diminution la note de TP. L étudiant doit IMPÉRATIVEMENT respecter son groupe. IL N Y A PAS DE SÉANCE DE RATTRAPAGE. Il vous est demandé d apporter du papier millimétré, une calculatrice à chaque séance et un double-décimètre. Le compte-rendu doit être remis OBLIGATOIREMENT à la fin de la séance. Le compte-rendu, doit être rédigé à l encre (pas au crayon à papier) sur la feuille de résultats préimprimée. Le mode opératoire détaillé dans le polycopié ne doit pas être recopié. À propos des graphes expérimentaux : Ce type de graphe n est pas exclusivement réservé à votre usage : il doit être lu facilement par les correcteurs (et, plus tard, les collaborateurs). Les échelles doivent être faciles à lire et les axes bien normés (avec ) Quand on trace une droite expérimentale à partir de points qui ne sont pas parfaitement alignés (ce qui est en général le cas), il faut autant de points au-dessus que de points en dessous de la droite. Il faut toujours un titre explicatif à un résultat présenté sous forme de figure. Quand on lit une absorbance, il faut toujours rappeler à quelle longueur d onde on s est placé pour faire la lecture. C. LACOMBE C. MORIN M.C. TOURNAIRE

2 LES GLUCIDES DOSAGE SPECTROPHOTOMÉTRIQUE DU GLUCOSE 1 I - PRINCIPE ET BUT DE LA MANIPULATION 1) Principe L oxydation du glucose, catalysée par la glucose-oxydase, libère de l eau oxygénée. L eau oxygénée, en présence de peroxydase oxyde par hydroxylation le chromogène réduit incolore en un dérivé oxydé coloré (rose). On peut simplifier l ensemble de ces réactions ainsi : Glucose + chromogène réduit acide gluconique + chromogène oxydé (incolore) (coloré) CH 2 H, O H Glucose oxydase + peroxydase L intensité de la coloration, proportionnelle à la concentration en glucose, peut être mesurée au spectrophotomètre. 2) But Nous devons déterminer la concentration d une solution de glucose par spectrophotométrie à l aide d une solution de glucose de concentration connue. Pour cela, nous commencerons par faire une étude spectrale du chromogène oxydé. II - RAPPELS : LOI DE BEER-LAMBERT Soit un rayon lumineux traversant une solution absorbante de concentration c et de trajet optique égal à. Si I O est l intensité du rayon lumineux à l entrée de la solution et I son intensité à la sortie : CH 2 O alors, A = log (I O /I) =..c I O I où A représente l absorbance le coefficient d absorbance caractéristique de la substance étudiée à une longueur l d onde donnée en L.mol -1.cm -1 longueur du trajet optique (= épaisseur de la cuve) en cm. Pour une solution d une substance absorbante donnée, à une concentration donnée, on peut tracer l Absorbance en fonction de la longueur d onde. Le spectre ainsi obtenu présente un maximum d absorption à une longueur d onde M que l on choisira de préférence pour les mesures. III - ÉTUDE SPECTRALE : Détermination de la longueur d onde maximale chromogène oxydé M d absorption du 1 ) Réactif utilisé (Glycemag) Le réactif de travail contient, dans un tampon phosphate, les enzymes et le chromogène. Sous cette forme, il peut être conservé un mois à +4 C, mais doit être amené à température ambiante avant son utilisation.

3 2 2 ) Manipulation * Préparer dans une fiole jaugée de 100 ml une solution-mère de glucose de 1 g.l -1 dans de l eau. * À partir de cette solution-mère, préparer une solution de glucose à 0,05 g.l -1 dans une fiole jaugée de 20 ml. * Prendre 2 tubes à essai. Mettre dans le premier 2 ml d eau et, dans le second, 2 ml de solution de glucose à 0,05 g.l -1. * Ajouter dans chacun d eux 5 ml de réactif donné (qui contient la glucose oxydase, la peroxydase et le chromogène réduit). * Homogénéiser. * Mettre au bain-marie à 37 C pendant 30 min. * Mesurer l absorbance de la solution en fonction de la longueur d onde en faisant varier cette longueur d onde tous les 10 nm de 430 à 620 nm. Remarque : IL EST IMPÉRATIF DE RÉGLER LE ZERO DU SPECTROPHOTOMÈTRE SUR LE TUBE NE CONTENANT PAS DE GLUCOSE ET DE LE RÉGLER POUR CHAQUE LONGUEUR D ONDE. IV DÉTERMINATION DE LA CONCENTRATION D UNE SOLUTION DE GLUCOSE But : Établir une gamme d'étalonnage à partir d'une solution dont on connaît la concentration en glucose pour déterminer la concentration d'une solution de concentration inconnue. Manipulation : Chaque binôme dispose : * d une solution-mère de glucose à une concentration d 1 g.l -1 * d une solution de glucose de concentration à déterminer, proche des conditions biologiques sanguines (concentration comprise dans la gamme 0,5 à 1,5 g.l -1 ). Remarque : Le protocole expérimental qui suit sera réalisé SIMULTANÉMENT pour la gamme d étalonnage (1 ) et pour la solution inconnue (2 ). S agissant d une réaction enzymatique, il est naturellement indispensable que les conditions opératoires soient identiques dans les deux cas. 1 ) Construction de la gamme d étalonnage * Prendre cinq tubes à essai N tube Glucose 0,05 g.l -1 (ml) 0 0,5 1 1,5 2 H 2 0 (ml) 2 1,5 1 0,5 0 Réactif (ml) * Homogénéiser et immédiatement, * Mettre au bain-marie à 37 C pendant 30 minutes environ. * Mesurer l absorbance à la longueur d onde M déterminée précédemment. 2 ) Solution inconnue A TRAITER EN MEME TEMPS La concentration de la solution à doser doit se situer, pour une bonne détermination, dans la zone centrale de la gamme d étalonnage. Il est donc nécessaire de réaliser une dilution préalable de la solution inconnue (Ne pas oublier de tenir compte de cette dilution dans le résultat final). N tube Solution inconnue diluée (ml) 0,5 1 1,5 H 2 0 (ml) 1,5 1 0,5 Réactif (ml) * Poursuivre le protocole comme pour les tubes de la gamme étalon.

4 3 CHROMATOGRAPHIE D EXCLUSION Avertissement : IL EST INDISPENSABLE D AVOIR PRÉPARÉ LES CALCULS DE DILUTIONS ET DE CONCENTRATIONS AVANT DE VENIR EN séance de Travaux Pratiques I) BUT Étude de la séparation par tamis moléculaire (ou chromatographie d exclusion) d un mélange de deux protéines : l hémoglobine et le cytochrome C. II PRINCIPE 1 ) La chromatographie d exclusion (= tamis moléculaire, gel filtration, perméation de gel) La séparation s'effectue en fonction de la taille des molécules. On utilise des supports sphériques troués de pores dans lesquels les solutés pénétreront ou non, selon leur taille : les molécules sont d'autant plus retenues qu'elles sont petites. Le support solide est constitué de polymères, dont les chaînes sont plus ou moins pontées pour varier la taille des pores, et qui gonflent en se remplissant d'eau. Nous utiliserons du dextrane (sous son nom commercial de Sephadex). Le principe de cette chromatographie est que le solvant enfermé dans les pores sert de phase fixe, où les molécules de taille inférieure à celle des pores peuvent se dissoudre presque librement, tandis que les molécules plus grosses ne rentrent pas dans la phase fixe. Ces dernières sont donc éluées dans le volume mort de la colonne. On baptise souvent ce type de chromatographie de gel d'exclusion, car le support forme un gel et qu'il exclut les grosses molécules. Les molécules sortent donc en fonction inverse de leur taille : les plus grosses d'abord (et singulièrement celles qui sont exclues, dans le volume mort) et les plus petites ensuite. 2 ) Principe du dosage des protéines. Le dosage des protéines se fait habituellement par la méthode de LOWRY (ou une de ses variantes) qui utilise simultanément les réactions mettant en jeu les propriétés des liaisons peptidiques et les propriétés spécifiques des radicaux R des acides aminés, la totalité des produits colorés obtenus alors étant déterminée par absorptiométrie. Pour notre expérience, nous avons choisi deux protéines colorées : l hémoglobine et le cytochrome C. Cette particularité présente deux avantages : d une part, nous pourrons suivre facilement l élution et la séparation des deux protéines au cours de la chromatographie et, d autre part, nous pourrons doser directement les protéines en mesurant leur absorption après avoir déterminé leur maximum d absorption. III MANIPULATION Séparation et collecte des éluats Vous disposez d une colonne de Séphadex G50 déjà préparée. * Rincer 3 fois la colonne avec le tampon d élution. * Faire couler l excédent de tampon au-dessus du gel en retirant le bouchon. Uniformiser, si nécessaire, la partie supérieure du gel à l aide d une baguette de verre. S assurer que la surface supérieure du gel est bien horizontale. * Fermer le robinet (délicatement, c est fragile), pour arrêter l écoulement, lorsque le ménisque frôle la surface supérieure du gel.

5 4 La colonne est prête à recevoir le dépôt du mélange à séparer. Composition du mélange : 5 mg d Hb + 5 mg de cyt C dans 1 ml de tampon Tris-HCl 10-2 M ph 7,5 * Déposer 0, 2 ml du mélange. Ce dépôt doit être réalisé avec précision et délicatesse, goutte-à-goutte, au centre de la surface supérieure de la colonne, sans troubler le gel, à l aide d une pipette automatique, en présence d un enseignant. * Le dépôt réalisé, ouvrir le robinet (et à partir de ce moment, ne le refermer qu une fois les 2 protéines sorties) pour faire pénétrer le mélange à l intérieur du gel. * Éluer avec le tampon Tris-HCl en utilisant un compte-goutte. Au début de l élution, ne verser que quelques gouttes de tampon afin de ne pas diluer le mélange déposé. Puis, continuer l élution en remplissant la colonne de tampon en évitant toujours de perturber la surface du gel. Remarque : NE JAMAIS LAISSER LA COLONNE À SEC * Dès le dépôt, recueillir dans une éprouvette de 10 ml tout le volume mort de la colonne. Ce volume correspond au volume occupé par la seule phase mobile (tampon) dans une colonne. La fin de ce volume mort est atteinte lorsque la première protéine arrive au trait noté sur la colonne. Dans ce volume mort sortent les molécules qui ne sont pas du tout retenues par la colonne. Noter ce volume. *Commencer la collecte des 30 éluats dans 30 tubes à essai, préalablement numérotés, par fraction de 0,5 ml (repérer le trait correspondant sur les tubes). * La collecte terminée, faire passer 1 ml de NaCl 2M sur la colonne, puis rincer la colonne en utilisant tout le contenu du flacon de rinçage. 3 ) Dosage de l Hb et du Cyt C Pour chacune des protéines, la densité optique de la gamme d étalonnage et des éluats doit être mesurée sur le même spectrophotomètre et dans le même temps. * Préparation des gammes d étalonnage Nous disposons de deux solutions-mères : une solution Hb = 0,25 mg/ml une solution de cyt C = 0,25 mg/ml Le mode opératoire est le même pour l obtention des 2 courbes d étalonnage : * Prendre 7 tubes à essai et y mettre les volumes suivants soit d Hb, soit de cyt C : 0 ml 0,1 ml 0,2 ml 0,4 ml 0,6 ml 0,8 ml 1 ml * Compléter à 2 ml avec du tampon Tris-HCl Le tube sans protéine servira à régler le zéro du spectrophotomètre. * Préparation des éluats * En premier lieu, décider dans quels tubes vous doserez l hémoglobine et dans quels tubes vous doserez le cytochrome. * Compléter les tubes contenant 0,5 ml d éluat à 2 ml avec du tampon Tris-HCl c Mesurer alors les absorbances des différents tubes à 410 nm pour le cytochrome C à 405 nm pour l hémoglobine Remarque : Il est impératif de travailler proprement. La totalité des 2 ml est nécessaire pour la lecture au spectrophotomètre. APRÈS CHAQUE LECTURE, REMETTRE LA SOLUTION DANS LE TUBE CORRESPONDANT ET NE JETER LE CONTENU DES TUBES QU APRÈS AVOIR TRACÉ TOUTES LES COURBES.