Les réactions de précipitation en milieu gélosé

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1 1 ETSL Les réactions de précipitation en milieu gélosé TP 3 GABIN-GAUTHIER 22/03/2010 I. PRINCIPE DES REACTIONS DE PRECIPITATION... 2 II. REACTIONS DE PRECIPITATION EN MILIEU GELIFIE GELS UTILISES LA TECHNIQUE D OUCHTERLONY : DIFFUSION DOUBLE LA TECHNIQUE DE MANCINI : DIFFUSION SIMPLE... 6 III. MODE OPERATOIRE ETUDE D UNE PROTEINE DETERMINATION DE LA CONCENTRATION D UNE PROTEINE Méthode Méthode IV. FEUILLE DE RESULTATS... 11

2 2 LES REACTIONS DE PRECIPITATION EN MILIEU GELOSE TP 3 I. Principe des réactions de précipitation Ce sont des réactions spécifiques Ag-Ac formant un édifice multimoléculaire (complexe immun) visible à l œil nu de l expérimentateur. Ces réactions mettent en jeu : 1 Ag soluble, de nature protéique ou poly-osidique, qui doit être multivalent (posséder plusieurs copies du même épitope ou différents épitopes réagissant avec différents Ac présents dans un sérum polyclonal) 1 Ac spécifique soluble, dit «précipitant» Ces réactions peuvent avoir lieu en milieu liquide ou en milieu gélifié! Dans tous les cas, il existe des conditions optimales de précipitation : la zone d équivalence. En effet, la taille donc la précipitation et la visibilité des complexes immuns dépend des proportions relatives entre Ag et Ac. On peut ainsi représenter sur un graphe les quantités de précipités obtenues en fonction de la quantité d Ag ajoutée, pour une quantité fixe d Ac (Fig 1 et 2). Les graphes obtenus pourront être du type «Lapin» (Fig 3) ou du type «Cheval» (Fig 4). Figure 1 : Pour une quantité constante d Ac, on établit dans différents tubes, une gamme avec des quantités croissantes d Ag. Figure 2 : Observation des précipités dans les tubes.

3 3 Figure 3 : Courbe de type «Lapin» et son interprétation. Lorsque les concentrations en Ag ajoutées sont faibles, on observe un excès d Ac, les complexes immuns sont de petite taille (donc solubles), car ils sont saturés par des Ac qui ne peuvent se lier à d autres épitopes. Lorsque la quantité d Ag ajoutée augmente, des épitopes libres apparaissent et les Ac peuvent établir des «pontages» entre Ag, formant ainsi de gros complexes immuns qui, ne pouvant être maintenus en solution précipitent. C est la «zone d équivalence», dans laquelle tous les Ac et les Ag sont inclus dans l édifice multimoléculaire. Lorsqu on ajoute un excès d Ag, il reste des épitopes libres, la taille des complexes immuns diminue de nouveau et ils redeviennent solubles. Dans certains cas, la courbe observée est de type «Cheval». Elle est nommé ainsi, car elle a été observée au départ avec des sérums obtenus chez des chevaux, qui contenaient des Ac beaucoup plus hydrophiles que ceux obtenus chez le lapin. Pour cette raison, on observait une «pré-zone», dans laquelle aucun précipité n apparaissait, car les complexes immuns obtenus étaient maintenus en solution en raison du caractère fortement hydrophile des Ac. Figure 4 : Courbe de type «Cheval».

4 4 Attention, ces réactions sont lentes (24 heures et plus) et beaucoup moins sensibles que les réactions d agglutination (30 à 700 fois moins, seuil de sensibilité : 10 à 200 µg d Ac.mL -1 contre environ 0,3 µg d Ac.mL -1 pour les réactions d agglutination directes). II. Réactions de précipitation en milieu gélifié 1. Gels ut ilis és On utilise comme support un gel d agar pur, mélange de 2 polyosides : l agaropectine et l agarose, à une concentration de 0,5 à 1%, à partir d algues marines rouges. Les molécules d agar sont visqueuses à 50 C et elles ont la propriété de polymériser et de former un gel en refroidissant après avoir été portées à ébullition en présence d eau. Le gel formé est un milieu semi-solide comportant une phase liquide dispersée entre les mailles d une phase solide ce qui permet la diffusion des molécules d Ag et d Ac que l on y introduit. Les gels sont en général préparés dans un tampon phosphate, PBS (Phosphate Buffered Saline), ph7,4 de composition suivante : 8 g NaCl 0.2 g KCl 1.44 g Na 2 HPO g KH 2 PO 4 QSP 800 ml of distilled H 2 O. Ajuster le ph à 7.4 avec HCl. Compléter à 1L avec de l eau distillée. Stériliser éventuellement par autoclavage pour augmenter la durée de conservation. Les réactifs peuvent être : introduits dans des puits creusés dans le gel, et vont alors diffuser de manière radiale selon un gradient de concentration décroissante (plus on s éloignera du point de dépôt, plus la concentration du réactif va diminuer). Introduits dans le gel en surfusion à 50 C, et ainsi présenter une concentration homogène tout en n étant pas dénaturés. 2. La technique d Ouch terlony : d iffusion doub le Le gel utilisé est dit «neutre». Les deux réactifs, Ag et Ac sont introduits dans des puits situés en regard l un de l autre et vont donc diffuser l un vers l autre en établissant un gradient de concentration chacun. Un arc de précipitation se forme dans la zone d équivalence.

5 5 La technique d Ouchterlony peut être qualitative ou semi-quantitative. En effet, le nombre d arcs de précipitation permet d indiquer le nombre minimum de systèmes Ag-Ac en présence dans le cas d un sérum complexe. De plus, on peut également en fonction de la forme des arcs de précipitation établir des parentés antigéniques entre différents Ag. Une ligne continue indique que les Ag A et B possèdent des épitopes identiques. Deux arcs indépendants qui se croisent indiquent que les Ag A et B n ont pas d épitopes en commun. Deux lignes se croisant en «éperon» que les Ag A et B ont des épitopes communs mais également des épitopes différents.

6 6 L épaisseur de l arc de précipitation et sa distance par rapport au puits de dépôt de l Ac sont également variables en fonction de la concentration en Ag. On peut ainsi, en réalisant des dilutions croissantes d 1 Ag, que l on dépose en regard d 1 ligne d Ac de concentration constante, estimer la concentration d 1 Ag (le résultat est à une dilution près). 3. La technique d e Mancini : d iffusion s imple Le gel n est plus neutre! L un des réactifs, en général l Ac est incorporé au gel d agar lorsqu il est encore en surfusion. Sa concentration est donc homogène. Différentes dilutions connues de l Ag sont introduites dans des puits creusés dans la gélose refroidie. Les Ag vont donc diffuser de manière radiale et former des anneaux de précipitation dans la zone d équivalence. La surface de l anneau est proportionnelle à la concentration en Ag. Pour plus de simplicité, on peut représenter le (diamètre) 2 de l anneau de précipitation en fonction de la [Ag] et on aura une relation linéaire du type : (diamètre) 2 = b + a[ag] avec b 0. Il s agit donc d une technique quantitative utilisée par exemple pour doser des molécules antigéniques. III. Mode opératoire 1. Etude d u ne p roté ine Après fractionnement des protéines d'un plasma (albumine, globulines), un technicien a omis d'étiqueter les tubes récupérés. La manipulation consiste à déterminer la nature et la pureté de la fraction distribuée (étiquetée fraction inconnue).

7 7 Vous disposez des réactifs suivants : Agar Tampon PBS Plasma de lapin (10µL/binôme) albumine de lapin à 4 % (10µL/binôme) γ globulines de lapin à 12g/L (10µL/binôme) fraction inconnue : (10µL/binôme) antisérum de lapin total (20µL/binôme) Quelle technique allez-vous utiliser? Pourquoi? (répondre sur la feuille de résultats) Mode opératoire : Préparer 25 ml de gélose à 1% dans du PBS. Couler 2 boîtes Ø 55mm (10 ml/boîte, avec une pipette plastique à usage unique); laisser prendre en masse à température ambiante ; attendre au moins 30 min. Attention, se placer sur une partie horizontale!!!!! Réaliser un gabarit à l échelle sur votre feuille de carnet de laboratoire, de manière à disposer et creuser les réservoirs avec des emporte-pièces de manière adéquate pour identifier votre protéine inconnue (Ø puits central 5 à 6 mm; Ø puits périphériques 3 mm). La nature des échantillons à déposer dans les puits sera repérée par des traits au marqueur réalisés sur la tranche de la boîte. La distance entre les puits d Ac et d Ag sera comprise entre 1,2 et 1,5cm. Faites valider votre gabarit par le professeur. placer la boîte au-dessus du gabarit et repérer la position des réservoirs par transparence ; enfoncer l'emporte-pièces jusqu'au fond, puis le retirer, le tout verticalement; si le cylindre de gélose n'est pas enlevé, l'aspirer avec une pipette Pasteur effilée reliée à une trompe à vide. Rq : Les réservoirs doivent avoir une forme cylindrique parfaite et ne pas être fendillés. Utilisez une des deux boîtes pour calculer le volume maximal à déposer dans les puits afin d éviter les débordements. Placer la boîte en chambre humide (disque de papier filtre imbibé d eau distillée placé dans le couvercle) à température ambiante, pendant au moins 48 h. Lire les résultats (schéma à faire sur carnet de laboratoire). 2. Détermi nation d e la concentration d u ne p rotéine Vous déterminerez la concentration d une solution de protéines : la SAB (sérum albumine bovine) par 2 méthodes de précipitation en milieu gélosé. Pour cela, vous disposez des réactifs suivants : Agar Tampon PBS SAB à 10g.L -1 Sérum anti SAB (110µL/binôme) SAB de concentration inconnue (150µL/binôme)

8 Méthode 1. Préparer 30 ml de gélose à 1% dans du PBS. Couler 6 lames avec au moins 5mL de gélose chacune (pipette plastique de 10mL). Laisser prendre en masse à température ambiante ; attendre au moins 20 min. Attention, se placer sur une partie horizontale!!!!! Réaliser un gabarit à l échelle sur votre feuille de carnet de laboratoire, de manière à disposer et creuser 3 lignes de 10 puits avec des emporte-pièces de manière régulière (Ø puits de 3 mm, espacement Ag-Ac minimal de 0,8cm). La lame sera orientée par un point au marqueur réalisés sur le coin haut gauche. Faites valider votre gabarit par le professeur. placer la boîte au-dessus du gabarit et repérer la position des réservoirs par transparence ; enfoncer l'emporte-pièce jusqu'au fond, puis le retirer, le tout verticalement; si le cylindre de gélose n'est pas enlevé, l'aspirer avec une pipette Pasteur effilée reliée à une trompe à vide. Dans 10 eppendorfs réaliser 1 série de dilutions en cascade de la SAB étalon à 10g/L dans du PBS de raison 2 de 1/2 à 1/1024 (tenir compte du volume de SAB à votre disposition). Etablir et faire valider le tableau de dilutions sur la feuille de résultats. Procéder de même pour votre SAB de concentration inconnue. Déposer sans déborder (7µL, à tester.) : la solution étalon en commençant par la dilution la plus grande pour éviter les changements de cônes inutiles. La solution d Ac La solution inconnue en commençant par la dilution la plus grande pour éviter les changements de cônes inutiles. Placer la lame en chambre humide (boîte de Petri Ø 90mm avec disque de papier filtre imbibé d eau distillée) à température ambiante, pendant au moins 48 h. Lire les résultats (schéma à faire sur carnet de laboratoire). Relever la dernière dilution présentant encore un arc de précipitation pour la SAB étalon et inconnue. Calculer l écart de concentration ainsi observé. En déduire la concentration de votre solution Méthode 2. Préparer 10 ml de gélose à 1% dans du PBS. Laisser refroidir à C puis ajouter 100µL d Ac anti SAB. Homogénéiser immédiatement et couler dans une boîte de Petri Ø 90mm. Laisser prendre en masse à température ambiante ; attendre au moins 30 min. Attention, se placer sur une partie horizontale!!!!! Réaliser un gabarit à l échelle sur votre feuille de carnet de laboratoire, de manière à disposer 7 puits avec des emporte-pièces de manière régulière (Ø puits de 3 mm). Les puits seront repérés par des traits au marqueur réalisés sur la tranche. Faites valider votre gabarit par le professeur. placer la boîte au-dessus du gabarit et repérer la position des réservoirs par transparence ; enfoncer l'emporte-pièce jusqu'au fond, puis le retirer, le tout verticalement; si le cylindre de gélose n'est pas enlevé, l'aspirer avec une pipette Pasteur effilée reliée à une trompe à vide. Devant l enseignant, réaliser dans 1 eppendorf 1 dilution au 1/10 de la SAB étalon à 10g.L -1 dans du PBS (volume final 1 000µL). Feuille de résultats à compléter et à faire valider.

9 9 Etablir et faire valider un tableau de dilutions sur la feuille de résultats, afin d obtenir 5 concentrations étalon de SAB : 1g.L -1 ; 0,8g.L -1 ; 0,6g.L -1 ; 0,4g.L -1 ; 0,2g.L -1 (Pipetman à utiliser P200). Déposer sans déborder (4 à 5 µl.) Placer la boîte en chambre humide (disque de papier filtre imbibé d eau distillée placé dans le couvercle) à température ambiante, pendant au moins 48 h. Lire les résultats (schéma à faire sur carnet de laboratoire). Calculer la concentration de votre solution.

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11 11 IV. Feuille de résultats Etude d une protéine Quelle technique allez-vous utiliser? Pourquoi? Parenté antigénique de la solution inconnue : Nature et pureté de la solution inconnue : Nombre de systèmes Ag-Ac possibles :

12 12 Détermination de la concentration d une protéine Méthode 1 Nom de la méthode (avec justifications) : Tableau de dilution pour la méthode 1 : N tube Vol PBS (µl) A redistribuer (µl) Dilution 1/2 1/4 Que remarquez-vous sur la position et/ou l épaisseur des arcs de précipitation pour la ligne étalon? Dernière dilution positive SAB étalon : Dernière dilution positive SAB inconnue : Ecart de concentration : [SAB] =

13 13 Détermination de la concentration d une protéine Méthode 2 Nom de la méthode (avec justifications) : Dilution de la SAB étalon à 1g/L -1 : Tableau de dilution pour la méthode 2 : N tube Vol PBS (µl) Vol SAB à 1 g.l -1 (µl) [SAB] en g.l ,8 0,6 0,4 0,2 Tableau de résultats pour la méthode 2 : [SAB] en 0,2 0,4 0,6 0,8 1 X1 X2 g.l -1 D = Diamètre anneau précipitation (mm) D 2 (mm 2= )