Les bases de la PCR et RT- PCR

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1 Lieu : Laboratoire de Virologie et de Biotechnologie Végétale / Plateforme de Biologie Moléculaire du LMI Patho-Bios Centre INERA /CREAF KAMBOINSE Organisateurs : LMI PATHO-BIOS avec le soutien du programme d enseignement et de formatio ooscitic financé par Agropolis fondation ( Animatrices : Séverine Lacombe (Chargée de recherche IRD), Martine Bangratz (Ingénieur d étud D) et Fatoumata Gnacko (Volontaire internationale IRD) Objectif de la formation : Former d un point de vue pratique des étudiants en biologie moléculaire ec une application ciblée sur (1) l identification de gènes (2) l expression de gènes et (3) la présence bsence d un pathogène (virus à ARN) ette formation en Biologie Moléculaire était exclusivement destinée à des étudiants en Master 1 de Université de Ouagadougou 1 (Resp Master Romaric Nanema) : - Master 1 SELCOSE Sélection et conservation des semences (10 étudiants) - Master 1 SVRPG Sélection et valorisation des ressources phytogénétiques (12 étudiants) éanmoins, 4 étudiants en stage au laboratoire ont également pu bénéficier de cette formation (1 udiant en Master 2 SELCOSE et 3 étudiants d école d ingénieur de Matroukou). groupes de 7, 9, et 10 étudiants ont été formés selon leurs disponibilités. haque session de formation a duré 4 jours (sauf la première qui n a duré que 3 jours). n alternance, des cours théoriques (1/3) et pratiques (2/3) ont été dispensés. ogramme de la formation : ur 1 ur 2 ur 3 1. Notion d Hygiène et Sécurité «Travailler en sécurité dans un laboratoire de recherche» 2. Théorie : «Comment utiliser les micropipettes?» 3. Théorie : «L ADN + extraction» 4. Pratique : Utilisation des micropipettes 5. Pratique : Extraction d ADN de feuilles de riz et visualisation sur gel des ADN 1. Théorie : La PCR 2. Pratique «Application de la PCR» : Amplification d un gène du riz (gène eif) à partir de l ADN et visualisation des produits de la PCR 3. Théorie : l ARN et ses précautions (film) 1. Théorie : La RT-PCR 2. Pratique 1 ère partie «Application de la RT-PCR» : détection du virus de la panachure jaune du riz et étude de l expression d un gène de riz (gène eif) Extraction d ARN de feuilles de riz / Visualisation sur gel d agarose des ARN Réalisation des RT avec une amorce spécifique (détection du virus) et des oligo dt (expression des gènes du riz)

2 ur 4 1. Pratique 2 ème partie «Application de la RT-PCR» : détection du virus de la panachure jaune du riz et étude de l expression d un gène (gène eif) Amplification PCR sur les RT / Visualisation sur gel 2. Pratique : «Préparation de solutions» avec calculs des concentrations/volumes.. 3. Discussions 4. Evaluation des étudiants et de la formation utes les présentations et les protocoles ont été remis aux participants, de même que le compte-rendu des travaux pratiques mme suit : Exemple de Compte- rendu des TRAVAUX PARTIQUES remis à chaque étudiant FORMATION EN BIOLOGIE MOLECULAIRE Septembre 2016 (3ième groupe) OUR 1 : EXTRACTION d ADN et VISUALISATION sur gel d agarose Broyage des échantillons par binôme : hantillons 1 et 2 : feuilles de riz non infectées par le virus RYMV hantillon 3-4-5: feuilles de riz infectées par le virus RYMV hantillon 6 : ADN de feuilles de riz extrait auparavant : non infecté infecté Extraction d ADN de feuille de riz selon le protocole Culot repris dans 100 µl d H20 Préparation du gel d agarose Dépôt des ADN : 10 µl ADN + 4 µl bleu de charge dilué Migration 15 min à 100 volts Visualisation sous UV des ADN pôt sur gel Attention : Problèmes de dépôts pour les échantillons 5 et 6 OUR 2 : REACTION PCR

3 éparation de 2 mix PCR : - un mix pour les échantillons non dilués - un mix pour les échantillons dilué 5X hantillons : - Numéro Contrôle positif (ADN extrait auparavant) - Contrôle négatif (ADN de patate douce) - Contrôle de contaminations : H20+Mix Pour 1 échantillon DN 3 mpon Go Taq 5X 4 TP 10 mm 0,5 morce eif F 10 µm 1 morce eif R 10 µm 1 q Promega 0, ,42 Distribution de 17 µl de Mix /échantillon Programme PCR 95 C pendant 5 min 95 C pendant 30 sec 58 C pendant 30 sec 72 C pendant 30 sec 72 C pendant 7 min 4 C 30 cycles Préparation du gel d agarose à 1% Dépôt de 15 µl de produits PCR, dans l ordre : marqueur de taille, ADN de feuilles non infectées (1-2), ADN de feuilles infectées (3-4-5), ADN de feuilles de riz extrait paravant, ADN de feuilles de patates douces (PT), Eau Migration 25 min à 100 volts Visualisation sous UV des ADN pôts sur gel d agarose C+ PT eau

4 FORMATION EN BIOLOGIE MOLECULAIRE Les bases de la PCR et RT- PCR PCR sur ADN dilué 5X C+ PT eau Résultats : bonne amplification!! JOUR 3 : EXTRACTION D ARN Broyage de : 2 échantillons de feuilles de riz non infectées : A et B 3 échantillons de feuilles de riz infectées par le C, D et E Extraction d ARN selon le protocole ARN trizol «maison» Préparation du gel d agarose «RNase Free» Dépôt des ARN (5 µl ARN + 5 µl H µl FDE) Migration 15 min à 100 volts Visualisation sous UV des ARN A B C D E RT - PCR Traitement à la Dnase de l ARN ARN Tampon Dnase 10X Dnase 1U/µl Volume H2O qsp 20 µl Volume final 10 µl 2 µl 6 µl 2 µl 20 µl 37 C pendant 30 min 1 µl d EDTA 50 mm 65 C pendant 10 min RT avec - amorce spécifique du virus pour détecter le RYMV - amorce polydt pour voir si le gène eif s exprime.

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