Cinétique enzymatique

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1 Travaux Pratiques Chimie Physique I Semestre d automne 2007 Cinétique enzymatique ABEGG Daniel SURRIABRE Pedro Université de Genève Science II, Laboratoire octobre 2007

2 Table des matières 1 Cinétique enzymatique But de l expérience Partie théorique Mécanisme de la réaction Partie pratique Manipulations Résultats Calculs d erreurs Discussion et conclusion Sources bibliographiques Exercice

3 Chapitre 1 Cinétique enzymatique 1.1 But de l expérience L objectif de cette expérience est d étudier la cinétique de la réaction de décomposition du N-benzoyl-aginine-p-nitroaniline en mesurant la variation de l absorbance du produit de la réaction (p-nitroaniline) en fonction du temps et à différentes concentrations du réactif. Finalement on veut déterminer la vitesse initiale, la vitesse maximale et la constante de Michaelisi-Menten correspondantes à cette réaction. 1.2 Partie théorique Pour la réaction de décomposition que nous allons étudier pendant ce TP, on suit le mécanisme de Michaelis-Menten qui propose l équation suivante : Où : V 0 = vitesse initial de la réaction V max = vitesse maximal de la réaction [S] = concentration du substrat K M = constante de Michaelis-Menten V 0 = V max [S] K M + [S] Cependant, nous allons utiliser une forme différente de cette équation qui va nous permettre de déterminer les différentes constantes de la réaction : 1 V 0 = K M V max [S] + 1 V max Néanmoins, pendant cette expérience, ce qu on va calculer directement est la variation 3

4 de l absorbance par rapport au temps et non la vitesse de la réaction. On va avoir besoin d une relation entre cette variation de l absorbance en fonction du temps et la vitesse de réaction : A = c l ǫ da dt = dc dt l ǫ = V 0 l ǫ da/dt est la variation de l absorbance en fonction du temps V 0 est la vitesse de la réaction l est la longueur de la cuvette = 1cm ǫ est le coefficient d extinction molaire de la p-nitroaniline = 10 4 M -1 cm -1 Ainsi on trouve une relation entre la variation de l absorbance et la vitesse de réaction Mécanisme de la réaction H O H O NO 2 O N N N Trypsin ( CH 2 ) 3 H O ( CH 2 ) 3 H 2 O NH NH OH + NH 2 H 2 N NH H 2 N NH N benzoyl arginine p nitroanilide (BAPNA) p nitroaniline (jaune) 1.3 Partie pratique Solution mère de BAPNA m BAPNA dans 40ml de DMSO = c V MM = 0.06 mol/lt 0.04 Lt g/mol = g 4

5 Prépartion des solutions Les solutions suivantes sont préparées à partir de la solution mère Manipulations Solutions Concentration[M] V BAPNA [ml] V DMSO [ml] A B C D E F G H La solution mère de BAPNA, de l enzyme, du DMSO et du tampon (ph=8) ont été préparé par l assistante. Nous avons 2 séries de 8 cuvettes qui seront pour la première, de blanc et la deuxième, la solution à mesurer (absobance). Dans les cuvettes à blanc, il y a 2.5ml du Tampon et 0.5ml d une des 8 solutions cidessus. Dans les autres 8 cuvettes il y a 2.5ml d enzyme et 0.5ml d une des 8 solutions. Les cuvettes sont secouées une à une au fur et à mesure avec du parafilm car une fois la solution ajoutée dans l enzyme la réaction commence. L absorbance est mesurée par ordre croissant de concentration. Pour mesurer l absorbance (400 nm) il faut d abord calibrer le spectromètre avec une solution à blanc puis insérer la solution à mesurer, qui possède la même concentration. Les mesures se font sur une période de 5 minutes. 5

6 1.4 Résultats Solutions [BAPNA] [mol/l] [S] [mol/l] Pente [Abs/min] V 0(exp) 10 6 [mol/min] A B C D E F G H /[S] /V 0(exp) Lineweaver - Burk plot /V0 [min/mol] f(x) = x R 2 = /K M 0 1/V max /[S] [L/mol] V max = [mol/min] K M = [mol/l] K M = [mol/l] 6

7 Solutions [S] [mol/l] V 0(exp) 10 6 [mol/min] V 0(th) 10 6 [mol/min] A B C D E F G H e 05 V max 7e 05 V0 (th) [mol/min] 6e 05 5e 05 4e 05 V max /2 f(x) = ln(x) R 2 = e 05 2e 05 K M 1e [S] [mol/l] V max = [mol/min] K M = [mol/l] K M = [mol/l] 7

8 1.5 Calculs d erreurs Concentrations des solutions Objet Volume [ml] erreur [ml] Seringue Pipette Pipette Pipette Pipette Fiole C i V i = C sol V sol C sol = C i V i V sol ( ) Ci V i ln(c sol ) = ln = ln(c i ) + ln(v i ) ln(v sol ) V sol dc sol C sol = dc i C i + dv i V i dv sol V sol V sol = V i + V DMSO C sol C sol = C i C i + V i V i V i + V DMSO V i + V DMSO Concentrations des solutions dans les cuvettes C cuv C cuv = C sol C sol + V sol V sol V sol + V ajouté V sol + V ajouté Erreurs Solutions C sol [mol/l] C cuv [mol/l] A B C D E F G H

9 K M = moyenne( C cuv ) = [mol/l] Pour l erreur de K M du log plot, il faut multipiler l erreur des C cuv par leurs propres [S], faire la moyenne et multiplier par le K M trouvé. Donc : K Mlog = [mol/l] 1.6 Discussion et conclusion Nous observons comme attendu que plus la solution est concentrée en BAPNA plus la couleur devient jaune et donc la pente de l absorbance augmente. Les valeurs de constantes V max et K M ne sont pas trop différentes entre les 2 graphiques mais les valeurs du lineweaver plot sont probablement plus correcte car pour la rérgésion logarithmique, la courbe n est pas très bien superposée aux erreurs calculées. 1.7 Sources bibliographiques Protocole des travaux pratiques de chimie physique I 1.8 Exercice Dans une cocotte-minute, la pression peut monter jusqu à 2 bar. Sous cette pression, l au bout à 121 C. Si l on observe que les pommes de terre sont cuites deux fois plus rapidement qu à pression normale (1 bar), estimer l énergie d activation pour la réaction de la cuisson des pommes de terre. On pose d abord l équation d Arrhenius : ln( k k ) = Ea R ( 1 T 1 ) T Où : k et k sont des constantes de vitesse à une température donnée Ea est l énergie d?activation R est la constante universelle des gaz T et T sont les températures correspondantes aux constantes de vitesse. 9

10 Dans le problème on nous dit que la vitesse de cuisson est 2 fois plus vite à 121 C qu à 100 C, donc on va considérer que le rapport des constantes de vitesse est égal à 2 : ln( k k ) = ln(2) T = 100 C = 373 K T = 121 C = 394 K Ea = R ln(2) ( 1 T 1 T ) = kj/mol On obtient bien une valeur positive qui indique qu il faut fournir de la chaleur au système pour pouvoir cuire les pommes de terre. 10