Dimensions des structures biologiques

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1 Dimensions des structures biologiques 0.1 nm (nanomètre 10-9 m) diamètre d une atome d hydrogène 2 nm diamètre d une double hélice d ADN 10 nm Petite protéine globulaire (hémoglobine) 10 nm épaisseur membrane cellulaire 30 nm Ribosome 25 nm Microtubule Lysosomes, Péroxisomes 200 nm (200 to 500 nm) 2!m E.coli - une bactérie 3!m Mitochondrie, 5!m chloroplaste 6!m (3-10 micromètres) Noyau !m Cellule µm Fibre musculaire squelettique 100 µm Diamètre racine plantule Arabidopsis Limite de résolution de la microscopie optique : ~0,25 µm TEM : 0,2 nm SEM : 2 nm Tunnel : 0,1 pm Photorécepteur des humains Fréquence (Couleurs) et Amplitude (Intensité) entre 400 et 700 nm 120 millions de bâtonnets («rods»,intensité seulement) 6 millions de cônes (couleurs) Limite de résolution 0,1 0,2 mm Paramètre enregistré : fréquence des photons absorbés

2 LUMIERE(S) VISIBLES(S) RADIATION ELECTROMAGNETIQUE

3 Faisceaux lumineux du microscopiste (=«EN PHASE») TRAIN D ONDE ( terminologie anglaise = française) INTERACTIONS AVEC LA MATIERE ABSORPTION, FLUORESCENCE, et : (photons) Changements dans la DIRECTION, POLARITE, PHASE,VITESSE DES TRAINS D ONDE : INVISIBLES POUR NOUS

4 REFRACTION n=c/v (>1, varie en fonction de ") La lumière se propage différemment selon les milieux traversés Le milieu est caractérisé par son indice de réfraction ( n ), c. a. d. par une vitesse ( v) de propagation de la lumière Lorsque la lumière traverse l interface entre deux milieux d indices différents, elle peut être déviée de sa trajectoire initiale CHANGEMENTS DE DIRECTION, VITESSE, POLARITE n 1 sin! 1 = n 2 sin! 2 FILTRES POLARISANTS

5 CHANGEMENTS DE POLARITE énantiomères «L» et «R», des isomères de configuration symétriques par rapport à un plan interposé IMAGES DE DIFFRACTION Lumière et gouttelettes d eau Rayons X et lysozyme

6 DIFFRACTION ET INTERFERENCE (positive et négative) ( Théoreme de Babinet ) TRADUIRE POUR L ŒIL HUMAIN Faisceaux : changements de COHERENCE et de POLARITE, introduction de DIVERGENCE Changements dans les phénomènes d INTERFERENCE après focalisation par le système optique CHANGEMENTS D AMPLITUDE : VISIBLES!

7 Fond clair Fond noir MICROSCOPIES OPTIQUES Un cône de lumière est focalisé par l objectif sur l échantillon qui est illuminé de façon homogène. L image observée est le résultat de différences de transmission et de réflexion. Contraste interférentiel Nomarski (D.I.C.) La lumière polarisée est divisée en deux ondes orthogonales (prisme de Wollaston). Ces deux ondes sont déviées latéralement par l objet en fonction de son épaisseur. En se recombinant après être repassées par le prisme et objectif, les ondes forment des interférences. Contraste de phase Introduction d une différence de phase entre la lumière directe et la lumière diffractée par l objet. Le contraste de phase converti des «objets de phase» (cellules vivantes) en «objets d amplitude», ce qui permet de voir des détails sur des échantillons non marqués La portion centrale du cône de lumière est bloquée. La limière réfléchie est diffusée par les aspéritées irrégulières de la surface de l échantillon, telles que les bordures franches, et les particules très fines (microtubules mais aussi poussières) Fluorescence

8 CHANGEMENTS DE PHASE MICROSCOPE A CONTRASTE DE PHASE NEG FOND CLAIR CONTRASTE DE PHASE Anneau de phase au niveau du condenseur plaque de phase au niveau du plan focal arrière de l objectif Zone noire: matériel qui retarde les trains déviés par le passage dans l échantillon

9 DIC ou contraste interférentiel Nomarski épaisseur Un faisceau polarisé est divisé en deux rayons polarisés orthogonalement et séparés spatialement d une distance très courte (une fraction de ", inférieure à la limite de résolution du microscope), par un prisme Wollaston (assemblage particulier de deux cristaux biréfringents). Si les milieux traversés par ces deux rayons différent dans leur indice de réfraction ou épaisseur, ceux-ci subissent un déphasage différent. Après collection par l objectif, les deux rayons sont recombinés par un second prisme de Wollaston, qui produit des trains d onde partiellement dépolarisés, dont certains pourront traverser le filtre polariseur (analyseur), orienté de façon telle à bloquer les trains encore polarisés dans le plain initial. Clair, non? Contraste de phase - possibilité d artéfacts (halo) - adapté pour des échantillons très fins - la pleine ouverture numérique de l objectif (et du condenseur) n est pas utilisée, ce qui entraîne une perte de résolution spatiale DIC - Nomarski - utilise toute l ouverture numérique - augmentation de la résolution spatiale particulièrement le long de l axe optique - possibilité d observation d échantillon épais - possibilité de réaliser des coupes optiques

10 MICROSCOPIE A FLUORESCENCE Énergie AbsorptionNon radiatif Fluorescence

11 MICROSCOPIE CONFOCALE Microscopie plein champs L objet est illuminé en entier de façon uniforme Microscopie confocale Seul un tout petit volume de l objet est illuminé (volume focal) L illumination totale de l objet Se fait par balayage Système de balayage et zoom électronique Scan driver Laser Scanner

12 Pile d images confocales correspondant à l acquisition de plusieurs images 2D (coupes x,y) en se déplaçant le long de l axe optique (z)

13 Limite de résolution d un système optique : distance minimale entre 2 points pour les visualiser comme distincts #r

14 Même pour un système optique parfait, il existe une valeur minimale théorique dépendant des lois de diffraction : déviation des trains d onde autour d obstacles LA LIMITE DE RESOLUTION THEORIQUE EST PROPORTIONNELLE A LA LONGUEUR D ONDE Point Tache de diffraction ( disque d Airy ) #r #r = 0,61 " / NA NA : Ouverture numérique de l objectif ( 0<NA<1,5 ) Résolution verticale : dictée par la profondeur de champ

15 MICROSCOPIE ELECTRONIQUE Des électrons accélérés par un potentiel de 100keV correspondent à une " de nm MICROSCOPE ELECTRONIQUE A TRANSMISSION

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17 MICROSCOPIE ELECTRONIQUE A BALAYAGE

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