Diagnostic Biologique des Infections Virales. A. Allardet-Servent A. Dubois

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1 Diagnostic Biologique des Infections Virales A. Allardet-Servent A. Dubois

2 Constitution d un virus 2 ou 3 éléments 1) génome = ARN ou ADN 2) capside Virus nus 3) + ou - enveloppe Virus enveloppés 2

3 Diagnostic biologique d une infection virale 2 Types de méthode de diagnostic Mise en évidence du virus ou de ses constituants dans un prélèvement Diagnostic virologique (direct) Mise en évidence d une réponse anticorps vis à vis d un virus Diagnostic sérologique (indirect) 3

4 Diagnostic Virologique Mise en évidence dans le prélèvement: de particules virales de virus infectieux Virus nus Virus enveloppés de composants viraux Protéines virales (antigènes) Acide nucléique ARN ou ADN (génome) 4

5 Diagnostic sérologique Définit le statut immunitaire du patient Significations différentes en fonction: Du type de virus impliqué De la situation clinique du patient (immunodéprimé, femme enceinte) 5

6 Diagnostic Sérologique Quizz La séropositivité envers le virus de la rubéole, de la varicelle protège la femme enceinte ou l immunodéprimé. Vrai ou faux? Une séronégativité pour le VIH est requise pour le don d organe Vrai ou faux? Des anticorps pour le VIH ou l Hépatite C signifient que l on est protégé.. Vrai ou faux? 6

7 Diagnostic Sérologique Quizz La séropositivité envers le virus de la rubéole, de la varicelle protège la femme enceinte ou l immunodéprimé. Vrai ou faux? Une séronégativité pour le VIH est requise pour le don d organe Vrai ou faux? Des anticorps pour le VIH ou l Hépatite C signifient que l on est protégé.. Vrai ou faux? 7

8 Signification du statut immunitaire 1er cas de figure Séropositivité = Protection Séronégativité = risque d infection Femme enceinte Rubéole CMV Varicelle Transplantation d organe CMV 8

9 Signification du statut immunitaire 2ème cas de figure Séropositivité = risque de transmission Donneurs de sang et d organe VIH Hépatites B, C HTLV CMV EBV 9

10 Signification du statut immunitaire 3ème cas de figure Séropositivité = Maladie évolutive VIH Hépatite C (80%) 10

11 Prélèvement: étape préanalytique

12 Prélèvement: étape préanalytique La Qualité de l étape pré-analytique conditionne la qualité du résultat. Personnel qualifié pour le prélèvement Prélever l échantillon adéquat Dans le contenant adapté (stérilité, anticoagulant ) Fiche de renseignements: date, heure, identité prescripteur, renseignements cliniques. Conditions de transport (temps, T ) 12

13 Diagnostic au laboratoire des principales infections virales

14 Les Infections Respiratoires

15 Diagnostic biologique d une grippe Quizz Myxovirus influenza est l agent responsable de la grippe. Vrai ou faux? La recherche des virus s effectue sur un prélèvement nasopharyngé. Vrai ou faux? Il existe des tests rapides et spécifiques. Vrai ou faux? Il existe des porteurs «sains» de virus de la grippe. Vrai ou faux? 15

16 Diagnostic biologique d une grippe Quizz Myxovirus influenza est l agent responsable de la grippe. Vrai ou faux? La recherche des virus s effectue sur un prélèvement nasopharyngé. Vrai ou faux? Il existe des tests rapides et spécifiques. Vrai ou faux? Il existe des porteurs «sains» de virus de la grippe. Vrai ou faux? 16

17 Diagnostic Infections respiratoires Virus responsables VRS* Grippe * Metapneumovirus Virus parainfluenzae * Adénovirus * Rhinovirus Entérovirus Coronavirus Bocavirus CMV * HSV * VZV Immunodéprimés *Virus recherchés en pratique courante 17

18 Diagnostic Infections respiratoires Prélèvements Aspirations naso-pharyngées Ecouvillonnage nasal Sécrétions bronchiques L.B.A 18

19 Diagnostic Infections respiratoires Techniques Immunofluorescence VRS, grippe, Parainfluenzae, Adénovirus, CMV, HSV, VZV Immunochromatographie VRS, Grippe PCR (pas en pratique courante, sauf grippe) Autres virus: Métapneumovirus, Rhinovirus, Entérovirus, Coronavirus, Bocavirus Culture cellulaire (en voie d abandon) Virus «cultivables»: VRS, grippe, Adénovirus, CMV, HSV 19

20 Immunofluorescence Immunofluorescence: mise en évidence d antigènes viraux dans les cellules du prélèvement Utilise des Anticorps Monoclonaux. Prélèvements respiratoires (grippe, VRS, etc ) VRS Grippe 20

21 Immunochromatographie Technique rapide 21

22 Nécessitent une structure lourde Beaucoup de virus ne se multiplient pas en culture cellulaire Plusieurs jours à plusieurs semaines pour obtenir un résultat Technique en voie d abandon pour le diagnostic virologique Culture cellulaire 22

23 Culture cellulaire, Effet cytopathogène Effet cytopathogène du CMV Cellules MRC5 non Infectées. 23

24 Gastro-entérites

25 Diagnostic Gastro-entérite Virus responsables Rotavirus (nourrissons)* Adénovirus 40/41* Astrovirus Norovirus/Sapovirus * virus recherchés en pratique courante Directement sur les Selles 25

26 Diagnostic Gastro-entérite Techniques Mise en évidence d Ag viraux Immunochromatographie* Test au latex* Techniques rapides, diagnostic de routine pour rotavirus et adénovirus PCR (Norovirus) 26

27 Les Infections cutanéomuqueuses

28 Diagnostic Lésions cutanéo-muqueuses Lésions vésiculeuses (+++) Herpès Varicelle Zona Lésions pustuleuses Monkeypox Nodule du trayeur Molluscum contagiosum 28

29 Diagnostic Lésions cutanéo-muqueuses Virus responsables Lésions vésiculeuses HSV VZV Entérovirus (plus rarement) Lésions pustuleuses Poxvirus (rare) 29

30 Diagnostic Lésions cutanéo-muqueuses Techniques Immunofluorescence HSV, VZV PCR HSV, VZV, Entérovirus Culture cellulaire HSV (+++), VZV Microcopie électronique (très rarement réalisé) Poxvirus 30

31 Microscopie électronique Technique lourde Peu sensible N est plus utilisé pour le diagnostic en pratique courante 31

32 Diagnostic Lésions cutanéo-muqueuses Eruptions maculo-papuleuses Rougeole Rubéole Roséole (Exanthème subit du nourrisson) Mégalérythème épidémique 32

33 Diagnostic Lésions cutanéo-muqueuses Eruptions maculo-papuleuses Fièvres éruptives Pas de virus détectable au niveau cutané Diagnostic clinique+++ Confirmation biologique: Sérodiagnostic (IgM+) Rougeole Rubéole Parvovirus B19 33

34 Diagnostic sérologique: mise en évidence d une infection récente Cinétique des anticorps spécifiques d un virus Signes cliniques IgG IgM 1er 2ème Mois 34

35 Diagnostic sérologique: mise en évidence d une infection récente Diagnostic d infection récente basé Sur la séroconversion (2 sérums) Sur la présence d IgM Mais ne permet pas d affirmer qu il s agit d une primoinfection (réinfections, faux positifs ) Sur un indice d avidité peu élevé 35

36 Diagnostic sérologique: mise en Evidence d un infection récente Avidité des IgG Les anticorps (IgG) initialement produits en réponse à une primo-infection ont une faible avidité pour l antigène L avidité de ces anticorps augmente progressivement au cours des semaines qui suivent la primo-infection 36

37 Diagnostic sérologique: mise en Evidence d un infection récente 37

38 Diagnostic sérologique: mise en Evidence d un infection récente Avidité des IgG: Les anticorps de faible avidité sont facilement décrochés de l antigène par l urée 8M. Seule l avidité élevée permet d exclure une infection récente (l inverse n est pas vrai) Titre A Sans Urée Titre B Urée 8M A/B = Indice d avidité Avidité faible (Indice < 0.2) Avidité intermédiaire (Indice ~ 0.5) Avidité élevée (Indice > 0,8) 38

39 Les syndromes méningés

40 Diagnostic des virus responsables de méningites Quizz Le diagnostic biologique d une méningite virale est le plus souvent réalisé par la culture. Vrai ou faux? L élévation du taux d IFN évoque une infection virale. Vrai ou faux? Une PCR positive est suffisante pour affirmer le diagnostic. Vrai ou faux? 40

41 Diagnostic des virus responsables de méningites Quizz Le diagnostic biologique d une méningite virale est le plus souvent réalisé par la culture. Vrai ou faux? L élévation du taux d IFN évoque une infection virale. Vrai ou faux? Une PCR positive est suffisante pour affirmer le diagnostic. Vrai ou faux? 41

42 Diagnostic Méningites / Encéphalites virales Méningites Virales Virus responsables Entérovirus +++ (oreillons, HSV-2, CML ) Encéphalites Virales Encéphalites «réplicatives» HSV-1 (+++) CMV, VZV, JC (immunodéprimés) «Arbovirus»: Encéphalite à tiques, West-Nile, Encéphalite japonaise. (contexte épidémio.) Encéphalites post-infectieuses Rougeole, rubéole, varicelle, EBV 42

43 Diagnostic Méningites / Encéphalites virales Techniques méningites et encéphalites réplicatives PCR sur le LCR: PCR HSV et Entéro en 1ere intention Interféron α encéphalites post-infectieuses Rapport taux d anticorps LCR/Sérum * Interféron α dans le LCR: marqueur indirect de la réplication d un virus dans le SNC. 43

44 PCR Qualitative PCR Qualitative Sensibilité +++ Théoriquement applicable à tous les virus connus Nombreuses applications Analyse des amplicons en gel d agarose Hybridation des amplicons avec une sonde 44

45 Réalisées actuellement par les techniques en temps réel PCR Qualitative 45

46 Les Hépatites

47 Diagnostic des virus responsables d hépatites Quizz Il y a 5 virus d hépatites : A, B, C, D, E Vrai ou faux? Tous les virus des hépatites sont transmis par voie sexuelle. Vrai ou faux? Les virus B, C, D sont responsables d hépatites chroniques. Vrai ou faux? Il existe des vaccins contre tous ces virus Vrai ou faux? 47

48 Diagnostic des virus responsables d hépatites Quizz Il y a 5 virus d hépatites : A, B, C, D, E Vrai ou faux? Tous les virus des hépatites sont transmis par voie sexuelle. Vrai ou faux? Les virus B, C, D sont responsables d hépatites chroniques. Vrai ou faux? Il existe des vaccins contre tous ces virus Vrai ou faux? 48

49 Diagnostic Hépatite aiguë Virus responsables Virus hépatite A (HAV) Virus hépatite B (HBV) Virus delta (hépatite D) (HDV) Virus hépatite C (HCV) Virus hépatite E (HEV) Autres: CMV, EBV, 49

50 Diagnostic Hépatite virale aiguë Techniques: Sérologie sur sérum. HAV Anticorps anti-hav IgM HBV Antigène HBS + Anticorps anti-hbc HDV (uniquement dans le contexte HBV) Anticorps anti-hdv HCV Anticorps anti-hcv ARN HCV par PCR(en 2ème intention) HEV Anticorps anti-hev (en 2ème intention) 50

51 Diagnostic et suivi Hépatite virale chronique Virus responsables HBV HDV (dans le contexte HBV) HCV Prélèvement Sérum Techniques HBV: Ag HBs, Ag HBe, Ac Anti-HBe, ADN par PCR HDV: ARN par PCR HCV: ARN par PCR 51

52 Diagnostic biologique d une infection virale Diagnostic Sérologique IgG IgM Mois 52

53 Diagnostic sérologique Techniques ELISA et techniques apparentées Immunoblot (western-blot) analyse de la réponse anticorps contre les différents antigènes viraux Test de confirmation (VIH, VHC) 53

54 Technique ELISA Techniques immunoenzymatiques: mise en evidence d antigènes viraux 54

55 Western-blot 55

56 L Infection par le VIH

57 Diagnostic Infection VIH Quizz Il n y a qu un virus responsable de l infection. Vrai ou faux? Les virus sont transmis seulement par voie sexuelle. Vrai ou faux? Le diagnostic repose sur la mise en évidence d anticorps. Vrai ou faux? Un seul sérum suffit pour affirmer le diagnostic. Vrai ou faux? 57

58 Diagnostic Infection VIH Quizz Il n y a qu un virus responsable de l infection. Vrai ou faux? Les virus sont transmis seulement par voie sexuelle. Vrai ou faux? Le diagnostic repose sur la mise en évidence d anticorps. Vrai ou faux? Un seul sérum suffit pour affirmer le diagnostic. Vrai ou faux? 58

59 Diagnostic et suivi Infection VIH Dépistage Anticorps anti-vih Confirmation Anticorps anti-vih par Western-blot Suivi ARN VIH (charge virale) Mutations de résistance aux antiviraux 59

60 ARN HIV: Charge virale Fluorescence émise (UA) PCR quantitative Quantification virale: charge virale Courbe d étalonnage Conversion des Ct en log. Rapidité des techniques en temps réel Ct Nombre de cycles 10 1 Le nombre de cycles nécessaires pour atteindre une fluorescence donnée 60 (phase log-linéaire) est fonction du nombre d ADN cibles initialement présents Nombre de copies (log) Log N = -0,26 Ct + 10,85 1 R 2 = 0, Cycle seuil - Ct

61 61

62 Mutation de résistance aux Antirétroviraux Mise en évidence de mutations conférant une résistance aux antiviraux (séquençage) Principales applications: VIH HBV CMV Etc 62

63 Mutation de résistance aux Amplification d une séquence d un gène viral par PCR Séquençage du fragment amplifié (séquenceur automatique) Séquence nucléotidique Séquence peptidique Identification de mutations sur le gène Antirétroviraux 63

64 Séquençage des gènes viraux 64

65 Séquençage des gènes viraux 65

66 Infection à CMV

67 Diagnostic Infection CMV Sujets Immunocompétents: Contexte: fièvre, syndr. mononucléosique Sérodiagnostic (IgM) Sujets immunodéprimés Contexte: Transplantation, SIDA Quantification virus dans le sang Antigénémie ou PCR 67

68 PCR quantitative Valeur pronostique Adaptée à la surveillance du traitement antiviral (HBV, HCV, CMV, EBV, ) Antigénémie: antigène pp65 du CMV dans leucocytes Faible grossissement Fort grossissement 68

69 Infection à EBV

70 Diagnostic Infection EBV Sujets Immunocompétents: Contexte: fièvre, syndr. mononucléosique Sérodiagnostic: Anticorps hétérophiles Anticorps spécifiques: IgM Sujets immunodéprimés Contexte: Détection précoce des lymphomes associés à EBV Quantification du virus dans le sang par PCR 70

71 Diagnostic prénatal

72 Diagnostic prénatal des infections virales Virus responsables CMV Parvovirus B19 VZV (rarement) Rubéole (rarement à l heure actuelle) Techniques PCR Pour le virus de la rubéole: IgM spécifiques dans le sang fœtal (méthode de référence) Prélèvements Liquide amniotique +++ Sang fœtal (éventuellement) 72

73 Les infections par papillomavirus

74 Papillomavirus Transmission par voie sexuelle Risque: Cancer col utérus, condylome (16, 18, 31,35) Prélèvement: au niveau du col utérin Mise en évidence: technique d hybridation directe de sonde sur l ADN viral du prélèvement 74