Préparation des bactéries compétentes.

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1 première semaine : lundi Préparation des bactéries compétentes. Cette manipulation est faîtes deux fois. Par nous le dimanche qui précède votre arrivée et par vous le prmier lundi E. coli 1 MRAP II / Glycérol 2. Solution de maltose à 20% p: 2 3. Solution de MgSO 4 1M p: Tubes avec 5 ml de LB 2 medium stérile 5. Bac de glace (pour conserver les échantillons à environ 4 C. 1. Décongeler le microtube contenant les bactéries (E. coli MRAP II) 2. Agiter la suspension de bactéries et la conserver sur la glace. 3. Ajouter stérilement aux 2 tubes contenant le LB medium, du maltose à 20% pour obtenir une concentration finale de 0,2% et du MgSO 4 1M pour obtenir une concentration finale de 10 mm (faîtes et notez le calcul). 4. Ajouter stérilement 5 µl de bactéries au tube n 1 et 10 µl au tube n Le tube n 3 ne reçoit que 5 µl de bactéries. 6. Mettre les tubes à 37 C pour la nuit. n du tube [ ] finale LB medium 5 ml 5 ml 5 ml Vol de MgSO4 1M... µl... µl - 10 mm Vol de Maltose à 20%... µl... µl - 0,20% E. coli MRAP II 5 µl 5 µl 5 µl (le tube numéro 3 est destiné mardi à la conservation de bactéries) 1 E. Coli: Escherichia coli 2 LB : Luria-Bertani

2 Préparation des solutions Maltose à 20% Maltose monohydraté (ref Merck: 5910) Stériliser une bouteille vide à l autoclave pendant 20 min à 1kg/cm 2 Dissoudre 20 g de maltose dans 80 ml d eau distillée. Ajuster le volume à 100 ml avec de l eau distillée. Stériliser la solution par passage sur filtre de 0,45 micron (voir figure). Conserver la solution à 4 C 2. MgSO 4 1M MgSO 4 7H 2 O (ref Sigma: M-9397) Dissoudre 24,65 g d MgSO 4 dans 80 ml d eau distillée. Ajuster le volume à 100 ml avec de l eau distillée Stériliser la solution à l autoclave pendant 20 min à 1kg / cm 2 3. LB medium (Luria-Bertani medium) Luria-Broth ( ref Sigma: L-3522) Solution contenant 10 g de Bacto-tryptone, 5 g de bacto-yeast extract et 10 g d NaCl Dans un bécher d un litre, peser 25 g de luria broth. Ajouter environ 800 ml d eau distillée et agiter la solution jusqu à dissolution complète. Ajuster le ph à 7 avec de l NaOH 5M Ajuster le volume à un litre avec de l eau distillée. Stériliser la solution à l autoclave pendant 20 min à 1 kg / cm 2

3 Préparation des milieu de culture LB medium p: 2 2. MgSO 4 1M p: 2 3. Agar ref Sigma: A Boite de Pétri 5. Tubes en pyrex + bouchons 6. Bain marie à 50 C 7. Erlen de 300 ml + bouchon en cellulose Bottom agar 1. Préparer 120 ml de bottom 3 agar dans un erlen de 300 ml. 2. Dissoudre l agar en chauffant la solution (quantité voir tableau ci dessous). 3. Ajouter à cette solution de MgSO 4 1M pour obtenir une concentration finale égale à 10 mm (voir tanleau ci dessous) tableau [ ] finale LB medium 120 ml Agar... g 15 g/l MgSO4... µl 10 mm Top agar 4. Pour préparer la solution de top 4 agar, laisser refroidir la solution jusqu à ± 50 C et transférer 1,5 ml de bottom agar dans les tubes en pyrex. 5. Ajouter à tous les tubes 1,5 ml de LB medium, mettre un bouchon sur les tubes et sur l erlen 6. Stériliser le tout à l autoclave pendant 20 min à une pression de 1 kg / cm 2 7. Aprés la stérilisation, mettre les tubes et l erlen dans un bain marie à 50 C. 8. A cette température et dans un environnement stérile, couler environ 20 ml de bottom agar dans les boites de pétri. 3 Bottom agar : LB medium + 15 g / l d agar 4 Top agar : LB medium + 7,5 g / l d agar

4 Dilution du phage lambda et infection Solutionde SM 5 p: 5 2. Phage lambda 3. 2 rangées de 5 microtubes de 1,5 ml 4. Tubes avec 3 ml de top agar à 50 C. 5. Bottom agar dans boites de Pétri stériles 6. Bain marie à 50 C Première partie infection 1. Numéroter 5 microtubes de la première rangée de 1 à 5 2. Mettre 270 µl de SM dans tous les microtubes. 3. Ajouter au microtube n 1, 30 µl de la solution de phage lambda. Agiter et centrifuger la solution brièvement. 4. Ajouter au microtube n 2, 30 µl de la dilution du microtube n 1 Agiter la solution et centrifuger brièvement. 5. Ajouter au microtube n 3, 30 µl de la dilution du microtube n 2 Agiter la solution et centriguger. Procéder ainsi jusqu au 5e microtube. 6. Numéroter les 5 microtubes de la seconde rangée de 1 à 5 7. Mettre dans ces microtubes 100 µl de bactéries compétentes. 8. Transférer dans le microtube n 1, 100 µl de la dilution n 1 9. Dans le microtube n 2, 100 µl de la dilution n 2 et ainsi de suite jusqu au dernier microtube. 10. Incuber les microtubes à 37 C pendant 20 min. 5 SM : Sel - Magnésium

5 Seconde partie : étalement Introduire stérilement 100 µl du microtube n 1 dans le tube contenant le Top agar à 50 C 12. Agiter avec précaution et couler stérilement cette solution dans une boite de Pétri. Etaler le solution en imprimant un mouvement circulaire à la boite. 13. Laisser solidifier à température ambiante. Mettre les boites dans l étuve à 37 C pour la nui Préparation des solutions. 1. SM (Sel - Magnésium) Solution de Tris 1M et de ph = 7 Solution d MgSO 4 1M Solution de gelatine à 2% NaCl (ref Promege: H5271) Solution contenant du Tris 50 mm, NaCl 0,1M, MgSO 4 25 mm et 0,01% de gelatine Dans un ballon de 100 ml transférer 0,58 g d NaCl, ajouter 2,5 ml d MgSO 4 1M, 5 ml de Tris 1M ph 7 et 0,5 ml de la solution de gelatine à 2%. Porter au volume avec de l eau distillée et stériliser la solution à l autoclave pendant 20 min à 1kg/cm Solution de gelatine à 2% Gelatine ref Sigma : G Tris 1M ph = 8 Tris: Tris (hydroxymethyl) aminomethane. Tris-Hydrocloride ref Promega: H5123 Dissoudre 12,11 g de Tris dans environ 80 ml d eau distilée. Ajuster le ph à 8 avec de l HCl 10 N, Porter au volume de 100 ml avec de l eau distillée et stériliser la solution 20 min à 1kg/cm 2