Microbiologie. Définition d un Microorganisme. Microorganismes en Laboratoire. L Étude des Microorganismes

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1 Microbiologie L Étude des Microorganismes Définition d un Microorganisme Dérivé du grec: Mikros, «petit» et Organismos, «organisme» Organisme microscopique qui comprend soit une seule cellule (unicellulaires) ou amas de cellules identiques (non différentiées) Ils comprennent les bactéries, les champignons, les algues, les virus, et les protozoaires 2 Microorganismes en Laboratoire Les Milieux de Croissance 1

2 Buts Croissance sous des conditions contrôlées Maintien Isolation de cultures pures Tests métaboliques Types Liquides (bouillons) Permets la culture en suspension Distribution uniforme des éléments nutritifs, environnementaux et autres Permets la croissance de grands volumes Milieux Solides Mêmes que milieux liquides + agent de solidification L agar : Polysaccharide dérivé d une algue La Croissance en Bouillon Non-inoculé Limpide Turbide + sédiment Turbide Limpide + sédiment 2

3 Croissance sur Gélose Croissance sur surface solide Croissance isolée Permets l isolation de colonies simples Permets l isolation de cultures pures Colonie simple Milieux Solides (suite) Pente Croissance en surface et en profondeur Différentes disponibilités d oxygène Entreposage à long terme Tube profond Milieu semi-solide Entreposage à long terme Faible disponibilité d oxygène Compter les Microorganismes 3

4 Méthodes Mesure de turbidité Comptes directs Comptes viables Nombre le plus probable Mesure de la Turbidité Mesure la quantité de lumière qui peut traverser un échantillon Le moins de lumière qui traverse l échantillon le plus dense est la population Mesure la densité optique ou le pourcentage de transmission 11 Mesure de la Turbidité Spectrophotomètre (A600): Mesure de la Densité Optique (D.O.) Lumière Détecteur.lecture 600nm Lecture différente 12 4

5 Mesure de la Turbidité D.O. 600nm 2.0 % Transmission Relation inverse 50 0 Densité cellulaire Comptes Directes L échantillon à être énuméré est appliqué sur une lame d hémacytomètre qui retient un volume fixe dans une chambre de comptage Le nombre de cellules est compté Le nombre de cellules dans le volume donné est déterminé Comptes Directes Avantages: Rapide Aucune croissance requise Aucune information a propos de l organisme est requise Désavantages: Ne discrimine pas entre vivant et mort Peux être difficile de discriminer entre les bactéries et les détritus 15 5

6 Utilisation d un hémacytomètre Utilisation d un hémacytomètre (suite) Hématimètre Cette lame possède 2 cellules de comptage indépendante 18 6

7 Utilisation d un hémacytomètre (suite) Déterminer le Compte Direct Compter le nombre de cellules dans trois carrés indépendants ayant les même dimensions 8, 8 et 5 Déterminer la moyenne ( )/3 =7 Donc 7 cellules/carré 20 Déterminer le Compte Direct (suite) 1mm 1mm Profondeur: 0.1mm Calculer le volume d un carré: = 0.1cm X 0.1cm X 0.01cm= 1 X 10-4 cm 3 ou ml Diviser le nombre moyen de cellules par le volume d un carré Donc 7/ 1 X 10-4 ml = 7 X 10 4 cellules/ml 21 7

8 Problème Un échantillon est appliqué à une lame d hémacytomètre avec les dimensions suivantes: 0.1mm X 0.1mm X 0.02mm. Des comptes de 6, 4 et 2 cellules ont été faits dans trois carrés indépendants. Quelle était le nombre de cellules par millilitre dans l échantillon original si la chambre de comptage possède 100 carrés? Comptes Viables Cellule viable: une cellule capable de se diviser et de générer une population (ou colonie) 1. Un compte viable est fait en diluant l échantillon original 2. Étaler des échantillons des dilutions sur un milieu de culture approprié 3. Incuber sous les conditions appropriées pour permettre la croissance Des colonies sont formées 4. Les colonies sont comptées et le nombre original de cellules viables est déterminé en fonction de la dilution Comptes Viables Dilutions en séries de l échantillon Étalement des dilutions sur milieu approprié Chaque colonie simple est originaire d une unité formatrice de colonie (UFC) Le nombre de colonies est équivalent à une approximation du nombre de bactéries vivantes dans l échantillon 8

9 Dilution d un Échantillon de Bactéries Dilution d un Échantillon de Bactéries Dilution d un Échantillon de Bactéries 9

10 Dilution d un Échantillon de Bactéries Dilution d un Échantillon de Bactéries Comptes Viables Le nombre total de cellules viables est indiqué en tant qu Unité Formatrice de Colonies (UFC) plutôt que nombre de cellule Chaque colonie est originaire d une unité formatrice de colonie (UFC) Une plaque avec colonies est choisie Calcul: Nombre de colonies sur la plaque X la réciproque de la dilution (facteur de dilution)= Nombre d UFC/mL Ex. 57 UFC X 10 6 = 5.7 X 10 7 UFC/mL 30 10

11 Dilution en série 63 UFC/0.1 ml de UFC/1.0 ml de UFC/ml X 10 5 = 6.3 x 10 7 /ml dans l échantillon original S il y avait 100 ml d échantillon bactérien? Comptes Viables Avantages: Dénombre les microorganismes viables Peu distinguer différents microorganismes Limites: Pas de milieu universel Ne peut pas demander combien de bactérie dans un lac Peut demander combien d E. coli dans un lac Nécessite la croissance du microorganisme Seule les cellules vivantes génèrent des colonies Des amas ou des chaînes de cellules génèrent une seule colonie =? =? UFC une bactérie Ex. Un UFC de Streptococcus un de E.coli Nombre le Plus probable: NPP Fondé sur les statistiques de probabilités Test présomptif fondé sur des caractéristiques données Technique en bouillon 11

12 Nombre le Plus Probable (NPP) Commencer avec un bouillon qui permet de déceler les caractéristiques désirées Inoculer differentes dilutions de l échantillon à être testé dans chacun de 3 tubes Dilution Tubes/Dilution 1 ml de chaque dilution dans chaque tube Après une période d incubation approprié, enregistrer les TUBES POSITIFS (qui ont de la croissance et les caractéristiques désirées) NPP (Suite) L objectif est de DILUÉ l organisme à zero Après l incubation, le nombre de tubes qui démontre les caractéristiques désirées sont enregistré Exemple de résultats pour une suspension de 1g/10 ml de terre Dilutions: Tubes positifs: Choisir la bonne suite: 321 et la retrouver dans le tableau Multiplier le résultat par le facteur de dilution central» 150 X 10 2 = 1.5 X 10 4 /ml» Puisque vous avez 1g dans 10mL doit multiplier encore par 10» 1.5 X 10 5 /g La Microscopie Les Colorations 12

13 Colorations Simples Coloration positive Coloration du spécimen Coloration indépendante de l espèce Colorations négatives Coloration de l environnement de fond Coloration indépendante de l espèce Méthode Coloration simple: Un seul agent de coloration Permet de déterminer la taille, la forme, et l arrangement des cellules Les Formes Cellulaires Coccus: Sphères Division sur 1,2 ou 3 plans Nombre de plans de division donne différents arrangements Arrangements typiques de différents genres bactériens 13

14 Plans de division Les Cocci (Coccus) Arrangements Diplococcus Streptococcus (4-20) Tétrade Staphylococcus Indice: si le nom du genre de bactéria finisse par coccus, la forme de la bactérie est cocci Bacilles: Les Formes Cellulaires (suite) Bâtonnets Division sur 1 plan seulement Arrangements typiques de différents genres bactériens Les Bacilles Plans de division Arrangements Diplobacille Streptobacille Indice: si le nom du genre de bactérie finisse par bacille, la forme de la bactérie est bacille Si elle ne finisse pas par cocci, c est probablement une bacille. 14

15 Microscopie Colorations Différentielles Coloration de Gram (coloration différentielle) Divise les bactéries en deux groupes Gram Négatives & Gram Positives 44 Colorées Mauves Bacille Genres: Bacillus et Clostridium Coccus Genres: Streptococcus, Staphylococcus et Micrococcus 45 15

16 Colorées Rouges Bacille: Genres: Escherichia, Salmonella, Proteus, etc. Coccus: Genres: Neisseria, Moraxella et Acinetobacter 46 Règles Si le nom est bacillus et/ou clostridium = Gram (+), bacille Si le nom finisse par coccus ou cocci (autre que les 3 exceptions, qui eux sont Gram (-)) = forme de coccus et Gram (+) Si ça fait pas partie des règles ci-dessus, = Gram (-) bacilles Paroi Cellulaire Gram + Vs Gram - Paroi Peptidoglycane Membrane Plasmique Absente Couche de Lipopolysaccharide 48 16

17 Méthode - Coloration Primaire 1. Coloration avec le cristal violet + 2. Ajout d iode de Gram (Mordant) Paroi :peptidoglycane Membrane plasmique Gram positif Gram Négatif LPS Méthode - Étape Différentielle 3. Lavage à alcool Paroi est déshydratée Complex colorant + iode est piégé Paroi n est pas déshydratée Complex n est pas piégé Paroi :peptidoglycane Membrane plasmique Gram positif Gram Négatif LPS Méthode - Contre Coloration 4. Coloration avec la Safranine Paroi :peptidoglycane Membrane plasmique Gram positif Gram Négatif LPS 51 17

18 Gram Positif Sommaire Fixation Gram Négatif Coloration primaire Violet de cristal Lavage Décoloration Contre coloration Safranine 52 Coloration Acido-Alcoolo-Résistante Coloration diagnostique de Mycobactérium Pathogènes de la Tuberculose et de la Lèpre Paroi cellulaire avec acide mycoïque Cireuse, très imperméable 53 Méthode Principe: Contenu élevé de composés similaires aux cires dans la paroi cellulaire, Acide Mycoïque, rend ces bactéries très résistantes aux colorants 54 18

19 Méthode (Suite) La paroi est rendue perméable par la chaleur Coloration avec de la fuchsine basique À base de phénol, soluble dans la couche mycoique Refroidissement retourne la paroi à son état imperméable Colorant est piégé Lavage avec de l alcool acide Étape différentielle Mycobactéries retiennent le colorant Autres bactéries perdent le colorant 55 Coloration de Spores Spores: Cellule bactérienne différentiée Résistante à la chaleur, la déshydratation, les ultraviolets, et différents traitements chimiques Alors, très résistante aux colorant aussi! Typique des bacilles Gram positifs Genres Bacillus et Clostridium Conditions défavorables induisent la sporogénèse Différenciation de cellule végétative à l endospore E.g. Anthrax 56 Coloration au Vert de Malachite Sporangium (strucutre dans laquelle les spores se forment) Spores (structures résistantes utilisées pour la survie dans des conditions défavorables) Cellules végétatives (en croissance active) Endospore (dormant, non reproductrices) Perméabilisation des spores par la chaleur Coloration primaire au vert de malachite Lavage Contre coloration à la safranine 57 19