Le monde complexe et mouvant des ARN. Première partie

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1 Le monde complexe et mouvant des ARN. Première partie J. Lamoril a, N. Ameziane a, J.-C. Deybach a, P. Bouizegarène a, M. Bogard b alaboratoire de biochimie et génétique moléculaire, Hôpital Louis-Mourier, Colombes, France blaboratoire de biochimie et biologie moléculaire, Centre hospitalier Victor-Dupouy, Argenteuil cedex, France RÉSUMÉ Depuis la découverte du code génétique il y a environ 40 ans, le rôle des ARN en biologie n a fait que croître. Cela fait environ une dizaine d années que l étude des ARN est devenue un des domaines les plus fertiles de la recherche en biologie moléculaire et cellulaire. Jusqu à ces dernières années en effet, la partie du génome constituée de l ADN codant les protéines constituait le moteur principal de la recherche en génétique moléculaire. Les ARN étaient peu étudiés. Les recherches récentes et plus particulièrement l étude des transcrits ARN (grâce en particulier aux transcriptomes) ont cependant démontré le rôle crucial des ARN et la richesse de ce nouveau monde dans les relations complexes au sein de la cellule et de son environnement. Ces études ont révélé de nouveaux et multiples mécanismes fonctionnels. Cette explosion de découvertes et la révolution qui en découle ne sont pas terminées. Les ARN dévoilent leurs mystères et les implications majeures en médecine commencent seulement à s ébaucher. Nous allons décrire dans cet article constitué de deux parties la diversité incroyable de ce monde et les implications importantes pour la santé humaine. Mots-Clés: ARN; Transcriptome; Ribonome RIASSUNTO Il mondo complesso e in evoluzione degli acidi ribonucleici (RNA). Prima parte. A partire dalla scoperta del codice genetico, circa 40 anni fa, il ruolo degli acidi ribonucleici (RNA) in biologia ha registrato una attenzione crescente. Attualmente lo studio degli RNA è una delle aree a più rapido sviluppo nella biologia molecolare e cellulare. Per molto tempo e sino questi ultimi anni la parte di genoma costituita dal DNA codificante le proteine ha costituito il motore principale delle ricerche di genetica molecolare; gli RNA erano poco studiati. Le ricerche recenti, e particolarmente lo studio degli RNA trascritti (grazie in particolare ai transcriptomi) hanno dimostrato il ruolo cruciale degli RNA e la ricchezza di questo nuovo mondo nelle relazioni complesse all interno della cellula e nel suo comportamento. Questi studi hanno rivelato nuovi e molteplici meccanismi funzionali. Questa esplosione di scoperte e la rivoluzione che ne è derivata non è terminata. Gli RNA svelano i loro misteri e le importanti implicazioni in medicina cominciano solo ad intravvedersi. Nel presente articolo, costituito da due parti, vengono esaminate le incredibili diversità di questo mondo e le importanti implicazioni per la salute umana. Parole chiave: RNA; Transcriptoma; Ribonoma ABSTRACT The RNA world, a complex and moving world. First part. Since the elucidation of the genetic code approximately 40 years ago, the role of RNA in biology has gained increasing attention. Now, study of RNA is one of the fastest developing area in molecular and cellular biology. For a long time, biologists have been focused on DNA and proteins with little interest for RNA. The growing interest in genome-wide transcriptional profiling has allowed new developments in RNA research and brought important attention to the RNA world, its incredible complexity and its huge functional role within the cell and its environment. The RNA world with its remarkable range of biological processes have important implications in human health that begins only to be sketched out. In this article in two parts, we will describe the diversity of the RNA world and potential consequences in medicine. Key words: RNA; Transcriptome; Ribonome INTRODUCTION Depuis le décryptage du code génétique, il y a environ 40 ans, le rôle de l acide ribonucléique (ARN) en biologie n a fait que croître et constitue actuellement un des domaines de découvertes les plus fertiles de la biologie. À la fin des années 1990, la relation entre l acide désoxyribonucléique (ADN), l ARN et la protéine semblait simple. L ADN génomique était transcrit en ARN messager (ARNm) et ce dernier traduit en protéine. Depuis 2000, de nombreuses études ont décrit l existence d une panoplie d ARN aux rôles insoupc onnés jusqu alors. Leur découverte concomitante à celle de l épigénétique, a révolutionné notre compréhension du monde du vivant et notre vision de la physiopathologie humaine. Les dernières analyses du génome ont révélé qu environ 60-70% de notre génome au minimum était transcrit 1. Outre les gènes codant pour des protéines (2% du génome humain et envi- Riprodotto da Immunoanal Biol Spéc 2010;25:4-25 con l autorizzazione del coordinatore di CORATA, Prof. B. Poggi LigandAssay 15 (2)

2 ron gènes), de nombreux transcrits ne sont pas codants et sont constitués pour une grande majorité par des ARNs fonctionnels provenant de régions intergéniques, d introns, d exons ou de séquences répétitives (pour certains, plus de 90 % du génome est transcrit 2 ). Il reste cependant encore beaucoup d inconnues. Ainsi, progressivement, le monde des ARNs se dévoile 3. Dans cet article, nous allons le survoler, montrer sa diversité, sa richesse et son importance croissante en médecine. ARN: DÉFINITION Il existe de nombreux ARN aux fonctions différentes. L étude du transcriptome (catalogue des ARN codés par le génome) a montré son incroyable complexité. La majorité du génome est en effet transcrite par un ensemble de réseaux se chevauchant parfois en sens et antisens, souvent soumis à de nombreux épissages alternatifs. Les études sur le transcriptome non codant pour des protéines sont par ailleurs de plus en plus nombreuses. La moisson des découvertes est importante aboutissant à la description de nombreuses classes de petits ARN ( nucléotides) tels que les micro-arn, les ARN PIWI, les petits ARN interférents et de grands ARN (> 200 nucléotides) non codant. Ces derniers constituent probablement la majeure partie du transcriptome non codant. Aussi, distingue-t-on dorénavant les ARN qui jouent le rôle de molécules intermédiaires transmettant l information génétique codée dans l ADN avec pour finalité la synthèse de protéines, des ARN non codants (ARNnc) ayant également un rôle fonctionnel majeur. Bien que différents dans leur rôle, ces ARN présentent une structure de base similaire. Structure d un ARN Structure de base L ARN se distingue de l ADN par son sucre, le D- ribose, et diffère d une base pyrimidique, l uracile (U) étant intégrée au lieu de la thymine (T). Il s agit d une macromolécule formée de la polymérisation d unités de base, les nucléotides (composés de l union d une base avec un sucre, le D-ribose [cette dernière association s appelant le nucléoside] et d un acide phosphorique), reliés par des liaisons phosphodiesters. Les bases composant un ARN normal sont au nombre de quatre, les bases puriques (adénine [A] et guanine [G]) et les bases pyrimidiques (cytosine [C] et uracile [U]). Un ARN peut s apparier à luimême, à un autre ARN ou à un ADN par des liaisons faibles, les liaisons hydrogène selon la règle de base suivante (règle de Watson-Crick): la base «A» est associée avec la base «U» par deux liaisons hydrogènes (A = U) ; la base «G» est associée avec la base «C» par trois liaisons hydrogènes (G T). Par opposition à l ADN sous sa forme (majeure) hélicoïdale B, l ARN forme une hélice A plus compacte. Ainsi, sa structure spécifique permet d autres formes d appariement (dites non Watson-Crick), la plus commune étant la paire G: U (appelée aussi wobble pair). Des interactions multiples sont donc possibles au niveau des nucléotides ARN et jouent un rôle fondamental dans sa structure. On peut par exemple observer des interactions triples (ainsi, un nucléotide simple brin peut interagir avec une pair de bases), ce type d interaction impliquant non seulement la base mais le sucre associé. C est le cas du motif «A», l adénosine étant souvent en contact avec une paire de bases type Watson-Crick. L ARN est donc constitué d hélices double brins (comme pour l ADN) définies par la règle de Watson-Crick et de motifs ARN essentiellement maintenus par des appariements dit «non Watson-Crick» (exemple: appariements de type «reverse Watson-Crick», «Hoogsteen», «reverse Hoogsteen» etc.). Ces interactions sont moins dépendantes de la structure primaire comme on le voit dans l ADN par exemple et expliquent que l identification informatique d ARNnc dans le génome soit plus compliquée 4. Autres éléments structuraux La structure de l ARN est complexe: son étude réalisée notamment par cristallographie et par études fonctionnelles a démontré l importance de ces structures secondaires et tertiares dans leur fonctionnalité. Nous citons ici, à titred exemple, quelques éléments structuraux importants présents dans certains ARNs : le pseudo-noeud (pseudoknot): il s agit d une structure tertiaire entortillée contenant deux éléments en épingle à cheveux (stem-loop), le premier élément étant une structure interne de la construction en épingle à cheveux du second. Elle peut se trouver en 5, en 3 ou dans la région codante de l ARN. Selon sa position dans l ARN, elle joue une influence sur la traduction des ARNm (en 5), la phase de lecture, la reconnaissance du codon stop, l élongation (dans la partie codante) ainsi que dans le passage de la traduction à la réplication de l ARN viral (en 3) 5. Cette structure est fréquemment retrouvée dans le génome des virus ARN ; le ribose zipper (fermeture à ribose): le groupe 2-OH de l ARN peut servir de donneur ou d accepteur d hydrogène. Une fermeture à ribose peut se former à l interface de deux duplex ARN dans lesquels les groupes 2-OH sont associés par des liaisons hydrogène; le récepteur de tétraboucle (tetraloop): il s agit d une interaction à grande distance dans laquelle un arrangement particulier est observé, constitué de formations de boucles complexes avec interaction de type liaison hydrogène et fermeture de la boucle par appariement entre guanine (en 5 de la boucle) et adénine (en 3 de la boucle); l IRES (internal ribosome entry site, site d entrée interne des ribosomes) 5 : il s agit d une structure présente dans la partie interne de la région 5 non-codante essentiellement chez les virus ARN qui déclenche une traduction alternative à la traduction classique et permet donc la synthèse protéique 6. Gènes d ARN Normalement, les gènes d ARN non traduits possèdent, comme les autres gènes, un promoteur et sont transcrits de la même fac on que les gènes codant pour des protéines par une ARN polymérase (le plus souvent, l ARN polymérase II, pol II) 7. Ces gènes peuvent être transcrits à partir du brin sens ou antisens et peuvent même dans certains cas partager le même promoteur qu un autre gène. Après le début de la transcription, un chapeau est ajouté 156 LigandAssay 15 (2) 2010

3 en 5 de nombreux ARN (incluant les ARNnc) par la pol II (structurem7gppp reconnue par le facteur d initiation de la traduction eif4f), structure indispensable à sa stabilité ainsi que pour la traduction en protéine dans le cas des ARNm. En 3, la transcription des ARN est plus complexe 8. Classification des ARN Selon l ARN, la molécule possède une activité catalytique et/ou constitue un composant structural d un ensemble complexe. Actuellement, on distingue les ARN codants (en pratique, les ARNm, ARN messagers) et les ARNnc. Pour certains, 98% des transcrits du génome humain représenteraient des ARNnc 9. Parmi ces ARNnc, on distingue les longs ARN dont la taille est supérieure à 200 nucléotides qui fonctionnent sans prétraitement particulier et les petits ARNnc issus d un prétraitement de longs précurseurs. Les fonctions de ces ARNs sont multiples. On peut citer le clivage d ARN, la ligation d ARN, les modifications site-spécifique d ARN, la méthylation de l ADN, la synthèse de télomère, la modulation des fonctions protéiques. Les ARNs jouent ainsi un rôle primordial dans l expression des gènes et dans la stabilité du génome. Quelle que soit la classe d ARN, le principe d action est le même. Les ARNs sont des molécules intermédiaires (adaptateurs) se fixant sur une séquence nucléique spécifique (molécule cible) et provoquent ainsi l activité catalytique d une ou plusieurs molécule(s) partenaire(s). Dans le cas des ARNnc, de nombreuses protéines partenaires sont impliquées et constituent une unité fonctionnelle, le complexe des ribonucléoprotéines. Il est impossible de décrire tous les ARN: un ouvrage entier serait nécessaire. Nous décrirons uniquement et simplement ceux qui nous paraissent à ce jour important pour comprendre les évolutions de la médecine actuelle. Les ARN codants Seuls les ARNm sont des ARN codants. Après synthèse du pré-arnm par transcription de l ADN génomique, les introns sont éliminés par épissage (splicing) et l ARNm mature transporté dans le cytoplasme pour traduction en protéine. Ils ne représentent que 2,3% du génome 10. Les ARN non codants Les ARNnc sont constitués d un grand nombre d ARN différents (Tableaux 1 et 2). De manière générale, les ARNnc servent à guider des complexes protéiques vers des séquences d acides nucléiques. Il résulte de cet assemblage ARNnc-complexe protéique, une multitude de fonctions cellulaires, par exemple, la régulation d un gène en cis ou en trans 11. Par ailleurs, leur localisation dans le génome est variable. Sans rentrer dans les détails et selon l ARNnc en cause, on peut trouver ces ARNnc dans le génome sur le brin sens ou le brin antisens, dans ces deux cas chevauchant ou non un ou plusieurs exons d un gène transcrit (avec possible interférence transcriptionnelle, voir infra). L expression de l ARNnc peut aussi être bidirectionnelle. Enfin, l ARNnc peut être situé dans un intron ou dans une région intergénique (entre deux gènes codants). Toutes ces localisations possibles rendent difficile la mise en évidence d un ARNnc 12. Parmi ces ARNnc, on peut citer: les ARN ribosomaux (ARNr), composants du ribosome, organelle cytoplasmique permettant la traduction des ARNm en protéines. Ils représentent la majorité des ARN de la cellule; les ARN de transferts (ARNt): ce sont des transporteurs d acides aminés qu ils amènent au site ribosomique pour la synthèse protéique; les ribozymes: ARN possédant une activité catalytique (par exemple, la RNase P, ribozyme clivant les précurseurs d ARNt). On peut citer les ribozymes «hairpin» (en boucle à cheveux), hammerhead (en tête de marteau), le ribozyme du virus de l hépatite Delta, les introns des groupes I, II et III, capables d auto-épissage, présents chez les plantes, les champignons et les bactéries mais rarement chez les animaux; les petits ARN: un certain nombre de petits ARN contribuent à divers processus biologiques en association avec des complexes de ribonucléoprotéines (RNP), par exemple les petits ARN nucléaires (snrna, small nuclear RNA). Ces petits ARN jouent alors le rôle de guide de reconnaissance d une séquence nucléique cible grâce à la complémentarité de séquence 11 ; les snorna (small nucleolar RNA, petits ARN nucléolaires): ces petits ARN contribuent aux modifications de séquences ARN des ARN ribosomaux. Parmi ces petits ARN encore mal connus, certains joueraient aussi un rôle dans la régulation de l épissage alternatif 1 ; les microarn (miarn): ce sont de courts ARN de pb dont le rôle de régulateur de l expression est fon- LigandAssay 15 (2)

4 damental. Ils provoquent la dégradation de l ARNm ou la répression de la traduction ; les siarn (small interfering RNA, petits ARN interférents): leur rôle est similaire à celui des microarn, mais ils dégradent systématiquement l ARN cible; les piarn (Piwi-interacting RNA, pirna, ARN interagissant avec les protéines Piwi): ces ARN jouent aussi un rôle dans la régulation de l expression des gènes. Ces ARN sont encore mal connus. Il est probable que d autres ARN restent à découvrir (Tableau 2). LES ARN MESSAGERS (ARNM) Bien que des progrès considérables aient été réalisés en biologie moléculaire, un des principes fondamentaux de la biologie moléculaire découvert dans les années 1950 reste vrai: l information génétique est transmise de l ADN vers l ARN puis vers la protéine. Un ARN messager (ARNm) est un ARN, copie de la partie codante du gène (ADNg) à partir duquel il a été formé (on parle de transcrit) et qui servira de support pour la synthèse peptidique d une protéine (cette transformation en protéine étant appelée la traduction). Sur le plan structural, un ARNm est schématiquement constitué d un chapeau en 5 (ajout en 5 du pré- ARNm d un nucléotide G méthylé non codé par l ADNg), une partie non traduite, la partie 5 non codante (5NC ou 5UTR, untranslated region), une séquence codante appelée aussi open reading frame (ORF) et constituée de nucléotides dont l association par triplet est dénommée codon (chaque codon correspondant à un acide aminé selon le code génétique), une région 3 non codante (3NC 158 LigandAssay 15 (2) 2010

5 ou 3UTR) contenant un signal de polyadénylation (séquence consensus 5-AAUAAA), une queue poly-a (longue suite d adénosines) et de nombreuses séquences régulatrices 14,15. Un ORF débute par le codon initiateur AUG (la séquence consensus du site d initiation de la traduction chez l humain est: 5-GCCRCCAUGG) dénommé site d initiation de la traduction et se termine par le codon stop X (il en existe trois: UAA, UGA, UAG) (Fig. 1). La transcription de la région de l ADNg cible catalysée essentiellement par l ARN polymérase II, donne un pré-arnm, copie de l ADN génomique. Après épissage (élimination des introns dégradés dans le noyau par des complexes enzymatiques, les exosomes, présents aussi dans le cytoplasme), phénomène complexe que nous ne décrirons pas, l ARNm mature est obtenu. Il est important néanmoins de savoir que, selon les pré-arnm, des épissages alternatifs sont possibles. Cet ARNm sera ensuite traduit en protéine à l aide des ARN de transfert (ARNt) et des ribosomes (situés essentiellement dans le cytoplasme et le réticulum endoplasmique mais retrouvés aussi associés aux mitochondries, aux synapses, aux structures d adhésion cellulaire) 16. L étude du transcriptome a permis de constater l extraordinaire complexité de cette transcription dont la vision jusqu au début des années 2000 était simple 17. Il a été notamment constaté que le début de la transcription (site d initiation de la transcription) présentait souvent de nombreuses alternatives (on parle de diversité transcriptionnelle). L épissage des pré-arnm Le mécanisme d élimination des introns a lieu dans le noyau. Complexe, nous en rappellerons seulement certains aspects 18. L ADN génomique est transformé en pré- ARNm par transcription. Ce pré-arnm est une copie de l ADN génomique contenant l information pour la synthèse de la protéine codée par le gène. Le pré-arnm possède donc les exons et introns du gène correspondant 19. Les introns sont alors éliminés pour réunir entre eux les exons correspondant à la partie codante du gène. Cette élimination des introns, l épissage (en anglais, splicing), est effectuée à l aide d un complexe, le spliceosome. Ce complexe contient cinq ribonucléoprotéines (U1, U2, U4, U5 et U6 appelées aussi snrnp) et de nombreuses autres protéines non-snrnp 20. Les introns à éliminer varient en taille d une centaine de nucléotides à plusieurs milliers. Par ailleurs, selon les gènes, l épissage peut varier: on parle alors d épissage alternatif (c est-à-dire l inclusion ou l exclusion d un ou plusieurs exons), mécanisme pouvant être tissu spécifique ou variable au cours du développement. Après épissage, les ARNm sont exportés dans le cytoplasme à l aide de protéines d export. La polyadénylation des ARNm L épissage et la polyadénylation des ARNm (ajout d une queue poly(a) en 3 de l ARNm) sont des processus couplés, les facteurs d épissage proches des sites poly(a) influenc ant le traitement de l extrêmité 3 de l ARNm et les facteurs de polyadénylation influenc ant réciproquement l épissage des introns proches des sites poly(a). Cette régulation complexe joue un rôle majeur dans la régulation des sites alternatifs de polyadénylation 19. Par ailleurs, pour certains auteurs, l existence possible de sites alternatifs de polyadénylation serait un moyen d échapper à la dégradation de l ARNm par des miarn 21. La régulation de la transcription Sans rentrer dans les détails, nous allons rappeler quelques éléments importants de cette régulation 22. La régulation de la transcription de l ARNm est en partie liée à la diversité des parties 5 et 3 des gènes mais aussi à certaines caractéristiques variables de l ARNm telles que sa rapidité de synthèse (turnover), sa traduction et sa localisation intracellulaire. D autres structures peuvent être présentes dans les ARNm. Ainsi, il est possible d avoir plusieurs ORF (on parle alors d upstream ORF [uorf]) dont l importance fonctionnelle dans la régulation de la transcription et la traduction de l ARNm a été récemment confirmée 23 : plusieurs sites d initiation de la traduction (AUG, codon initiateur), des sites d entrée de ribosome (plus exactement de la sous-unité 40S du ribosome) 24. On peut aussi avoir des sites alternatifs de fixation des ribosomes, les internal ribosome entry site (IRES), plusieurs signaux de polyadénylation ainsi que des sites de régulation de la traduction (par exemple, des éléments de réponse au fer, les iron responsive element (IRE). Par ail- Figure 1 Schéma d un ARNm. L ARNm est constitué de 5 vers 3 d un chapeau (m 7 G), d une région 5 non codante (5-NC), d un cadre ouvert de lecture (open reading frame [ORF]) correspondant à la région codante traduite en protéine, d une région 3 non codante (3 -NC) et d une queue poly(a). Deux codons spécifiques limitent l ORF, le codon initiateur AUG et le codon stop appelé aussi codon X (correspondant à un des codons suivants : UGA, UAA et UAG). LigandAssay 15 (2)

6 leurs, certaines structures secondaires peuvent aussi modifier cette régulation. En effet, l ARNm peut présenter des séquences autocomplémentaires provoquant la formation de structures en boucle (stem-loop) où se fixent certaines protéines, les mrnp (mrna binding proteins), les iron regulatory protein (IRP) se fixant sur les IRE en étant un exemple. Ces éléments jouent un rôle important dans la stabilité de l ARNm, son accessibilité par les ribosomes, ses interactions avec la machinerie complexe traductionnelle et sa localisation cellulaire. Dans certains cas (par exemple, dans certains neurones), la régulation de l expression des gènes est également fonction de sa localisation dans la cellule, restreignant ainsi la traduction à certains sites cellulaires, ce qui permet de réguler cette expression indépendamment de facteurs agissant directement sur le gène. Ce mécanisme permet d augmenter localement la traduction en protéines tout en économisant de l énergie (la protéine n est pas transporté au site actif mais y est directement produite). L adressage cellulaire des ARNm est complexe et implique de nombreux partenaires protéiques 25. Les différentes étapes de transcription bien que décrites séparément sont en fait liées. Une grande partie se déroule dans le noyau pour se poursuivre dans le cytoplasme 26. L editing des ARNm Les ARNm présentent une grande diversité résultant de deux mécanismes, l épissage alternatif et l editing (terme difficile à traduire en franc ais). L editing des ARN (sur les ARNm et les ARNnc) est une modification posttranscriptionnelle de l ARN qui provoque des changements subtils (insertion, délétion, conversion enzymatique d un ou quelques ribonucléotides). Il peut agir ou non de concert avec les mécanismes d épissage alternatif. Ces réactions expliquent la grande diversité transcriptionnelle. La forme la plus commune d editing est la transformation de l adénosine en inosine. À ce jour, en excluant les zones répétitives, quelques centaines de gènes édités ont été recensés 27. Quelques exemples. Transformation de l adénosine en inosine Réaction prédominante d editing chez les mammifères, il s agit d une réaction de désamination de l adénosine en inosine catalysée par les enzymes adenosine deaminases acting on RNA (ADARS). L inosine est ensuite reconnue parle ribosome (et les reverses transcriptases) comme une guanosine (A I G). Modification de la cytosine en uracile L editing peut aussi être réalisé à l aide d une famille de cytidine déaminase, les apolipoprotein B editing complex (APOBEC), groupe d enzymes agissant sur l ADN et/ou l ARN (dix sont actuellement recensées). Elles catalysent la désamination de la cytosine en uridine 28. Ce mécanisme a été retrouvé chez de nombreux procaryotes (par exemple, le virus de la rougeole) et chez les eucaryotes dont l exemple le plus connu est celui de l apolipoprotéine B (ApoB, Omim ) pour lequel existent deux formes (ApoB48 et ApoB100) de métabolisme totalement différent et codées par le même gène ApoB. L une est synthétisée dans le foie (ApoB100) et l autre dans l intestin (ApoB48). Dans ce cas particulier, l editing du gène au niveau d une séquence CAA est effectué par désamination de la cytosine (ce qui la transforme en uridine: C U) et produit un codon stop (UAA) et la formation d une protéine tronquée, ApoB48. Pour mémoire, certaines APOBEC agissent au niveau de l ADN par un mécanisme d editing et sont impliqués notamment dans la résistance aux virus (notamment VIH) 28. Autres rôles de l editing L editing joue aussi un rôle dans la régulation des petits ARN interférents (siarn), les miarn et d autres ARNnc en inhibant leur action par editing de l ARN double brin cible par exemple ou par action directe de fixation des ADARS sur ce même ARN. Un phénomène similaire existe pour les miarn 29. Par ailleurs, il a été aussi démontré que l editing étaitun moyen de réguler les séquences Alu (courtes séquences répétées d environ 280 pb de la famille des SINEs [short interspersed nuclear elements] qui constituent environ 10% du génome humain). Les séquences Alu transcrites pourraient modifier l expression des gènes dans lesquels ils se trouvent 29. Il existerait donc un editing important des séquences Alu tissu-spécifique (notamment dans le cerveau et le rein) dont les conséquences ne sont pas claires actuellement, même s il semble qu il s agisse d un mécanisme anti-alu. Dans certains cas, l editing permet aussi une diversité transcriptionnelle déjà évoquée en participant aux mécanismes d épissage alternatif ou de modification de codon stop (Fig. 2) 29. L editing joue un rôle majeur dans de nombreux tissus et plus particulièrement dans le cerveau tant dans son développement que dans la régulation de nombreuses fonctions cellulaires et même semble-t-il cognitives 30. PETITS ARN NUCLÉAIRES, ARNSN (SMALL NUCLEAR RNA, SNRNA) Les ARNsn constituent un petit groupe de transcrits présents en grande quantité dans le noyau. Ces derniers sont constitués de deux classes en fonction de leur séquence et des cofacteurs protéiques associés (snrnp, small nuclear ribonucleoproteins) (Fig. 3) : les ARN de la classe Sm, caractérisés par un chapeau 5-triméthylguanosine, une anse en 3 (stem-loop) et un site de fixation (dénommé Sm) pour un groupe de protéines dites Sm (protéines U1, U2, U4, U4atac, U5, U7, U11, U12); les ARN de la classe Lsm, caractérisés par un chapeau monométhylphosphate, une anse 3 (stem-loop) se terminant par une queue uridine constituant un site de fixation pour des protéines dénommées Lsm (U6 et U6atac). Dans le génome humain, les gènes codant pour ces ARNsn sont répétés de nombreuses fois. Transcrits par l ARN polymérase II, les gènes de ARNsns Sm les mieux caractérisés sont ceux codant pour les ARNsn U1 et U2 du complexe d épissage. Nous les prendrons comme exemple pour décrire ce petit ARN. Le promoteur du gène possède deux séquences particulières et importantes dans le contrôle de la transcription du gène, le site distal sequence element (DSE) agissant comme un enhancer et le site 160 LigandAssay 15 (2) 2010

7 Figure 2 L editing des ARN. Figure 3 Les petits ARN nucléaires, ARNsn 13. Les ARNsn sont constitués de deux classes : (i) les ARNsn Sm, caractérisés par un chapeau 5 -triméthylguanosine (TMG), un site de fixation des protéines Sm (site Sm) et une structure en anse (3 stem-loop) encadrée. Ils sont transcrits par l ARN polymérase II; (ii) les ARNsn Lsm, caractérisés par un chapeau 5 -monométhylphosphate (MPG), une structure en anse (3 stemloop) et une queue poly-(u), le site Lsm. Ils sont transcrits par l ARN polymérase III. proximal sequence element (PSE). Le transcrit de ces gènes n est pas épissé et contrairement à la majorité des transcrits ne possède pas de queue poly-a en 3. Une séquence spécifique en 3, dénommée 3- box, est localisée 9-19 pb en aval de la région codant pour l ARN. Cette boîte est nécessaire pour la formation correcte en 3 de l ARNsn. D autres ARNsn, les ARNs Lsm (Like Sm: famille de protéines à laquelle se lie l ARN) sont transcrits par une ARN polymérase III 31. Alors que les ARNsn Sm sont exportés dans le cytoplasme pour leur maturation puis repassent dans le noyau par un processus complexe, les ARNsn Lsm restent intranucléaires 13. L ensemble constitué par ces ARNsn et les snrnp participe à la réaction d épissage, c est-à-dire l élimination des introns des pré-arnm. Cette réaction est guidée par l appariement base-base entre les ARNsn constitutifs du complexe protéique d épissage appelé spliceosome et les jonctions exon/intron du pré-arnm. Il s agit d une réaction complexe dans laquelle plus de 150 protéines interagissent 32. PETITS ARN NUCLÉOLAIRES, ARNSNO (SMALL NUCLEOLAR RNA, SNORNA) Schématiquement, les ARNsno sont impliqués dans les modifications des ARNr, des ARNsn et des ARNt 33. Les petits ARN nucléolaires (ARNsno) sont constitués de deux familles, les ARNs C/D et les ARNs H/ACA. Le terme «nucléolaire» est historique et se rapporte aux descriptions initiales observant leur localisation aux nucléoles dans le noyau cellulaire par opposition aux ARNsn. En fait, cette dénomination est trompeuse, cette classe d ADN possédant de nombreuses fonctions tant dans le noyau que dans le cytoplasme. Chez l être humain, au moins 200 ARNs différents C/D et H/ACA sont répertoriés. L étude de ces ARN à travers les espèces montre que leur existence remonte à plus de deux à trois millions d années. Ces ARN jouent un rôle majeur dans de nombreux processus biologiques tels que la traduction des protéines, l épissage des ARNm et la stabilité du génome. Ils participent aussi aux modifications nucléotidiques d autres ARNnc au sein de complexes protéines, les ribonucléoprotéines (RNPs). Les ARN C/D participent aux méthylations des 2-O-ribose et les ARN H/ACA guident les pseudo-uridylation (conversion de l uridine en pseudo-uridine). Ces actions sont effectuées par ces ARN conjointement et simultanément sur les ARN ribosomaux (ARNr). Ces RNPs agissent sur des sites clés des ARNr et jouent un rôle majeur pour assurer la fonction du ribosome. D autres fonctions complexes sont assurées par les ARNsno telles qu une action sur le spliceosome (en agissant sur les ARNsn), sur la synthèse du télomère (assurée par un ARN H/ACA). Il semble que de nombreuses autres fonctions restent à découvrir pour ces ARNsno. Certaines caractéristiques structurales définissent ces ARN. Les ARN C/D possèdent deux séquences dites boîtes C (5-RUGAUGA) et D (5-CUGA) réunies par des anses (loop) et formant des tours en boucles (kink turns). Une paire C/D est associée à une séquence antisens (l ARN cible) en amont de la boîte D. L ARN cible est alors méthylé sur le ribose correspondant au nucléotide situé en complément de la base localisée 5 nucléotides en amont de la boîte D (Fig. 4). Comme les autres ARNnc, le rôle de ces ARN guidant des modifications (on parle d ARN guide) est en fait celui d un adaptateur assurant le lien entre un ou plusieurs composants catalytiques (des ribonucléoprotéines, RNPs) et la cible. Nous ne décrirons pas les montages et régulations complexes associant ces ARNsno et les RNPs et renvoyons le lecteur à la référence 13 pour des descriptions précises. Sur le plan génétique, plusieurs constructions existent. Les gènes codant pour les ARNsno sont essentiellement localisés dans les introns de gènes codant pour des protéines impliquées dans la biogenèse des ribosomes. On peut aussi les retrouver dans les introns de gènes codants. En fait, leur synthèse à partir des introns est réalisée après épissage des pré-arnm. Dans certains cas, les pré-arnm ne sont pas traduits en protéines et seuls les introns sont transformés. Dans d autres cas, les ARNsno sont dérivés de transcrits polycystroniques qui peuvent contenir jusqu à dix ARN différents, chaque ARN étant ensuite libéré par endoclivage. Plus rarement, quelques ARNsno sont transcrits indépendamment (Fig. 5). Chez les eucaryotes, les ARNsno sont assemblés avec les pré-rnps inactifs. L ensemble est transporté vers les corps de Cajal, structures intranucléaires nécessaires à l assemblage et la maturation des RNPs. Les RNPs sont LigandAssay 15 (2)

8 Figure 4 Les ARNsno C/D et H/ACA 13. a: structure secondaire d un ARNsno C/D, guide de méthylation 2O. Deux boîtes conservées C (RUGAUGA) et D (CUGA) sont présentes aux extrémités en anse en formant des tours en boucles (kink turns, k-turns). La pair C/D est associée à une séquence antisens (trait épais) en amont de la boîte D et s apparie avec l ARN cible (en rouge). L ARN cible se méthyle sur le ribose du nucléotide (nt) apparié à l ARN guide (l ARNsno) se trouvant cinq paires de bases en amont de la boîte D; b: structure secondaire d un ARNsno H/ACA, ARN guide de pseudo-uridylation (pseudou). Une boucle (hairpin) imparfaite est formée entre la tige inférieure, la poche de pseudou, la tige supérieure et l anse apicale. L ARN cible est apparié dans la poche de pseudou. Une boîte ACA ou H se trouve en aval de la boucle. À 15 nucléotides (nt) de cette boîte se trouve l uridine de l ARN cible qui est modifié (Nψ représente le nucléotide conservé adjacent à l uridine cible ψ). La boîte H/ACA est en fait constituée de deux unités en boucle séparées par une séquence simple brin contenant la boîte H (ANANNA). Chez les eucaryotes, l anse apicale possède une boîte CAB (Cajal box de séquence UGAG) permettant la rétention de certains ARN ACA/H pour guider la modification d ARNsn (plutôt que des ARNr). Chez les Archeae, ces ARN possèdent aussi une formation en tours de boucle (k-turns). A: adénine; U: uracile; N : n importe quelle base ARN; R: base pyrimidique (cytosine ou uracile); G: guanine. ensuite dirigés vers leurs sites actifs suivant leur fonction c est-à-dire dans les nucléoles, les télomères, les corps de Cajal (organelles nucléaires) selon les séquences signatures (boîtes C/D, H et ACA) qu elles contiennent. Les ARN qui retournent vers les corps de Cajal s appellent encore ARNsca (small Cajal body RNAs) et participent aux modifications des ARNsn 13. ARN DE TRANSFERT (ARNT) Les ARN de transfert (ARNt) participent à la synthèse des protéines en permettant le transfert de l acide aminé spécifique qui leur est attaché au peptide en cours de synthèse au sein du complexe ARNm/ribosomes/ribonucléoprotéines/ARNr lors d une réaction complexe appelée traduction. Celle-ci est constituée schématiquement de trois étapes: initation, élongation et terminaison. Cette traduction réalise une synthèse linéaire d une chaîne de résidus aminoacides dans un ordre spécifique. Bien que différant dans certains détails, la traduction chez les eucaryotes et les procaryotes présente beaucoup de similitudes. Nous allons présenter cette traduction dans ses grandes lignes sans entrer dans les particularités différenciant les aspects traductionnels des eucaryotes et des procaryotes 34. Au cours de la traduction, au niveau du ribosome, l hybridation ARNm/ARNt par association du codon situé sur l ARNm avec l anticodon complémentaire situé sur l ARNt (en fait, l amino-acyl ARNt, un acide aminé spécifique de l anticodon étant fixé sur l ARNt par une enzyme, l aminoacyl-trna synthétase) (Fig. 6). Le ribosome en permettant l ajout des acides aminés un par un au cours de la traduction permet la synthèse progressive du polypeptide qui aboutira dans un deuxième temps au cours des modifications post-traductionnelles à la protéine mature. Pour mémoire, le code génétique est constitué de 61 codons codant pour 20 acides aminés (aas) et trois codons stop. Le code génétique est dit dégénéré dans le sens où plus d un codon code pour un même acide aminé (codons synonymes). Les codons synonymes ne sont pas utilisés avec la même fréquence (on parle de biais de codons). Leur utilisation dépend de l abondance de l ARNt correspondant dans la cellule 35. Par exemple, dans Escherichia coli, parmi les six codons codant pour l arginine (CGU, CGC, CGA, CGG, AGA et AGG), CGU et CGC sont les plus utilisés. L interaction codon/anticodon est complexe et ne répond pas uniquement aux règles d appariements Figure 5 Organisation génomique des ARNsno C/D et H/ACA 13. Chez les eucaryotes, plusieurs organisations génomiques des ARNsno (grosses flèches) sont possibles. 1: beaucoup d ARNsno ont leurs gènes dans des introns de gènes codant pour des protéines qui participent à la biogenèse des ribosomes; 2: certains ARNsno sont organisés en polycistrons. Un transcript (le polycistron) contient jusqu à dix transcrits d ARN. Chaque ARN est ensuite libéré du précurseur par endoclivage; 3: quelques ARNsno sont transcrits isolément. 162 LigandAssay 15 (2) 2010

9 Figure 6 Schéma d un ARNt36. Il s agit de la séquence primaire et secondaire de l ARNtVal d Escherichia coli. Encadré en jaune se trouve l anticodon UAC sur l ARNt. Ce dernier va s hybrider au codon GUA de l ARNm (un des codons pour l acide aminé valine). Dans sa structure primaire, outre les nucléosides contenant les A, C, G et U, on trouve des nucléosides modifiés tels que cmo5u (uridine-5-oxydoacétique), D (dihydrouridine), s 4 U (4-thio-urine), m 6 A (N6-méthyladénosine), m 7 G (7-méthylguanosine), T (ribothymidine), ψ (pseudouridine). Figure 7 de Watson et Crick 36. L incorporation des acides aminés est rapidement réalisée (environ aas par seconde) en plusieurs étapes. L étape d initation est complexe et fait intervenir de nombreuses protéines (par exemple, initiation factor 2 [eif2]), l ARNt de la méthionine (AUG, appelé aussi codon initiateur). Elle démarre dans la partie 5 non codante de l ARNm et forme dans un premier temps, un complexe de préinitiation (complexe 43S puis 48S [par association d autres protéines au cours du processus] en présence de la sousunité ribosomale 40S chez les eucaryotes). Ce complexe va alors démarrer dans la direction 5 3 la vérification de l ARNm jusqu à rencontrer le codon initateur AUG provoquant alors le positionnement de l ARNtméthionine sur le site P du ribosome. L assemblage avec la sous-unité 60S (eucaryotes) permet de démarrer l élongation. On aura alors schématiquement la sélection de l anticodon par le ribosome, la reconnaissance de l anticodon, l assemblage à l ARNm, la modification conformationnelle de la sous-unité 30S du ribosome et de l ARNt permettant l entrée de l ARNt sur le site A de la sous-unité 50S du ribosome puis des étapes d élongation proprement dite du peptide naissant, la translocation et l expulsion de l ARNt utilisé, une nouvelle arrivée de l aminoacyl-arnt spécifique du codon et renouvellement des étapes précités, la traduction se terminant au codon stop (terminaison) spécifiquement reconnu par un groupe de protéines appelées erf1 chez les eucaryotes (RF1 ou RF2 chez les procaryotes; release factor [RF]) qui permet l hydrolyse du peptide synthétisé et sa libération de l ARNt-peptidyl (en association avec d autres protéines telles que RF3 et erf3) 37. Schématiquement, ces facteurs reconnaissent le codon stop par un motif protéique spécifique au site A (par Schéma de la traduction. La traduction a lieu au sein des deux sous-unités ribosomales 30S (40S chez les eucaryotes) et 50S (60S chez les eucaryotes), l ensemble donnant un ribosome 70S (80S chez les eucaryotes). L ARNm est lu (traduit) par le ribosome en présence de complexes protéiques, l ARNt servant d intermédiaire pour traduire cet ARNm en protéine. a: au niveau du ribosome (dans la sous-unité 30S/40S à l interface avec la sous-unité 50S/60S), l élongation de la protéine et la traduction se situent sur trois sites : le site A (amino-acyl), le site P (peptidyl) et le site E (exit). L ARNt arrive au niveau du site A (ARNtaminoacyl) où il reconnaît sur l ARNm le codon complémentaire de son anticodon (traduction). À l aide de réactions complexes incluant notamment des protéines appelées facteurs d élongation (par exemple, EFTu), l acide aminé est ensuite transféré sur le peptide naissant fixé sur l ARNt (ARNt-peptidyl; on parle d élongation) au site P. Cette réaction est réalisée à l aide d une peptidyl transférase; b: les ARNt du site A (aminoacyl) et P (peptidyl) sont ensuite transférés respectivement sur le site P et E à l aide d autres protéines (par exemple, facteur d élongation EF-G) tandis qu un nouveau ARNt-aminoacyl vient se fixer sur le site A (translocation). L élongation se termine quand un codon stop au site A est reconnu par certains facteurs protéiques (par exemple, class I release factors, erf1 chez les eucaryotes) provoquant alors l hydrolyse de l ARNt-peptidyl et la libération du peptide synthétisé de l ARNt. Ce dernier subira alors d autres modifications, les modifications post-traductionnelles (par exemple, phosphorylation). exemple, pour RF1, le motif «Proline-acide aminé quelconque-thréonine» [PNT] et pour RF2, le motif «sérineproline-phénylalanine» [SPF]). Ce peptide sera ensuite remanié par des modifications posttraductionnelles pour aboutir à la protéine mature (Fig. 7) 38. Contrairement à la réplication de l ADN effectuée avec une grande fidélité (taux d erreur de 1/ ), la traduction présente un taux d erreur plus important (1/ , taux identique à la transcription: 1/10 4 ). Il est important que ce taux d erreur soit le plus minime possible. En effet, une erreur de tra- LigandAssay 15 (2)

10 duction aboutit à une protéine déstructurée activant alors les mécanismes de contrôle de qualité de la cellule et peut aboutir à l apoptose de celle-ci. Pour certains auteurs, dans certains cas, ces erreurs participeraient à la diversité protéique (et donc phénotypique) et à l évolution et pourraient ainsi être considérées comme des phénomènes physiologiques dans certaines circonstances 38. Par exemple, ces erreurs participent à la synthèse de protéines clés chez certains rétrovirus 39. Après la traduction, le ribosome est recyclé en présence de protéines de recyclage (ribosome recycling factor [RRF] chez les procaryotes par exemple), ce mécanisme étant différent chez les eucaryotes et les procaryotes. Dans tous les cas, les deux sous-unités, l ARNt et l ARNm se séparent. Le recyclage est cependant encore un mécanisme mal connu 34. RIBOSOMES ET LES ARN RIBOSOMAUX Les ARN ribosomaux (ARNr) sont des structures complexes et compactes dont on distingue chez les procaryotes deux formes principales, l ARN 16S (participant à la structure de la sous-unité ribosomale 30S) et l ARN 23S (participant à la structure de la sous-unité ribosomale 50S), l association des sous-unités 30S et 50S constitue le ribosome 70S. Rappelons ici que le terme «S» est extrapolé de Svedberg, unité de mesure de sédimentation des molécules (ici ribosomes) soumises à ultracentrifugation. Chez les procaryotes, on retrouve les ARN 5S, 18S et 25S. Les ARNr sont associées aux ribonucléoprotéines (RNPs) pour constituer les sousunités ribosomales dont l assemblage constitue le ribosome 40. Chez les eucaryotes, on distingue deux sous-unités, la petite (40S) et la grande (60S), l ensemble constituant le ribosome 80S 34. La grande sous-unité est constituée de 47 protéines et de trois ARNr 41. La petite de 32 protéines et un ARNr (ARNr 5S). La synthèse du ribosome est complexe et démarre avec celle des ARNr dans le noyau 42. L ARNr synthétisé subit ensuite des modifications multiples (méthylation, pseudo-uridylation, action d endo- et exonucléases) et s associe à des protéines, les protéines ribosomales (plus de 180 d entre elles appelées facteurs et 100 petites ribonucléoprotéines nucléolaires, snornp constituées ellesmêmes en partie de snoarn) pour constituer le préribosome. Le préribosome constitué dans le noyau est ensuite exporté dans le cytoplasme par un processus actif pour y subir des étapes complexes de maturation 41. Le principal rôle du ribosome est d interagir avec l ARNm et l ARNt en présence d un complexe protéique et de petits ARN, les ARN ribosomaux pour effectuer la synthèse des protéines au cours de la traduction, c est-à-dire l ajout des acides aminés, un par un. Les ARNr constitutifs des ribosomes participent à la reconnaissance des ARNt au site A du ribosome 43. Sur le plan génétique, les gènes des ARNr (ADNr) sont présents en opérons (clusters), structures locales des chromosomes assemblant des gènes transcrits en groupe. Chez les humains, une sous-unité de transcription d ARNr mesure environ 43 kb et est constitué de séquences codant pour des pré-arnr séparés par des séquences intergéniques d environ 30 kb. Les clusters d ARNr sont localisés sur les bras courts de certains chromosomes et sont appelés régions nucléolaires organisatrices (nucleolar organizer regions [NORs]) 44. Chez les eucaryotes, ils sont transcrits par différentes ARN polymérases dans les nucléoles (par exemple, l ARN 5S est transcrit par une polymérase III et le pré-arn 35S par une polymérase I). Le nombre de gènes ARNr actifs varie selon les cellules et les demandes de ces dernières pour la synthèse protéique. Nous ne décrirons pas la transcription complexe des ARNr et leur association au sein des ribosomes avec des protéines ribosomales 43. L enzyme participant à l ajout d un acide aminé au cours de l élongation, la peptidyl transférase est constitué de plusieurs ARNr. Par ailleurs, pour maintenir les sites A et P en configuration active au cours de la traduction au sein du ribosome, la présence d un ARNr 23S est nécessaire. La présence d un ribosome est fondamentale dans la traduction et la mise en conformation spatiale correcte de la protéine (même si des protéines spécifiques, les chaperones participent aussi au remodelage spatial correct de la protéine) car elle minimise l énergie thermodynamique afin d optimiser cette réaction 45. À titre d exemple, si cette synthèse se faisait sans ce dernier et les complexes protéiques associés, au moins un milliard d année serait nécessaire pour obtenir une protéine de 100 acides aminés de structure tridimensionnelle adéquate! 46. RIBOZYMES Les ribozymes constituent un groupe d ARN possédant une activité catalytique. Il s agit donc d ARNenzyme 47,48. En dehors du ribozyme le plus complexe à savoir le ribosome qui permet la formation de liaisons peptidique ARN-dépendantes, les ribozymes sont constitués de trois groupes, les introns auto-épissants (divisés en deux classes principales, I et II), la RNase P (impliquée dans la synthèse des ARNt) et les petits ARN catalytiques (groupe incluant quatre motifs catalytiques partageant un même mécanisme chimique) (Tableau 3). Parmi ces ARN, on distingue principalement les introns du groupe II s autoépissant (self-splicing group II introns) retrouvé à la fois parmi les ARN codants et les ARNnc. Introns du groupe I et II s auto-épissant 164 LigandAssay 15 (2) 2010

11 Ces ribozymes participent à l épissage des ARN. À l instar de la composante ribozyme de la RNase P, ils catalysent le clivage des liaisons phosphodiesters et la ligation produisant des extrémités 5-phosphate et 3-hydroxyl 47. Formation de la liaison peptidique au ribosome Le ribosome est le plus gros des ribozymes. Il catalyse la formation des liaisons peptidiques au cours de la synthèse protéique pendant la traduction. L activité de la peptidyl-transférase implique deux ARNt substrats, l ARNtamino-acyl au site A du ribosome et l ARNt-peptidyl au site P du ribosome (constitué d ARNr). Elle permet l ajout d un aminoacide sur l ARNt-peptidyl par une réaction complexe schématiquement décrite plus haut 47. Le ribozyme GlmS Il s agit du riboswitch glms localisé dans la région 5- non codante du gène codant pour la glucosamine-6-phosphate synthetase. En présence de glucosamine-6-phosphate (GlcN6P), il clive son propre ARNm réprimant ainsi la production de l enzyme. Le métabolite GlcN6P, en se fixant sur l ARNm, provoquerait une modification conformationnelle et stabiliserait l ARNm et induirait ainsi le clivage d autres ARNm codant pour la même enzyme 50. Ce modèle de réaction est discuté par d autres auteurs 48. La RNase P C est une enzyme clé ubiquitaire de la synthèse des ARN de transfert (ARNt) retrouvée chez les procaryotes et les archeae. Cette endonucléase clive spécifiquement les ARNt précurseurs (pré-arnt) permettant la formation d un ARNt mature 51. Il s agit d une ribonucléoprotéine (RNP) contenant une sous-unité ARN essentielle pour la catalyse. La composante protéique est essentielle pour l activité de l enzyme in vivo. Il a été démontré néanmoins que le composant ARN est la sous-unité catalytique (au moins pour certaines eubactéries). Cette dernière peut suffire seule pour catalyser la réaction de clivage in vitro chez certaines bactéries (par exemple, E. coli). Cela n a pas été observé chez l être humain où la composante protéique est indispensable 51. Les petits ARNs catalytiques Ce sont de petits ARN impliqués dans le processus de réplication des génomes à ARN qui les contiennent. On distingue quatre groupes selon leur structure secondaire caractéristique. Le ribozyme en tête de marteau (hammerhead ribozyme) Cette structure a été initialement découverte chez des ARN pathogènes pour les plantes (par exemple, les viroïdes) puis mise en évidence chez certains eucaryotes (par exemple, certaines espèces de crickets). Ils sont impliqués dans la transformation de longs transcrits multimériques en plusieurs transcrits monomériques. Dans les plantes, ils interviennent dans la réplication des génomes à ARN dans lesquels ils sont contenus (par un mécanisme de cercle roulant, rolling circle dont le principe est similaire à celui de la technique d amplification par rolling circle amplification [RCA]). Démontré pour certains de ces ARN, le mode d action fait intervenir un mécanisme d autoclivage grâce à un domaine en tête de marteau. Il s agit d un motif d environ 35 nucléotides contenant des régions simple brin très conservées et qui contiennent les nucléotides nécessaires à une activité catalytique optimum. Le complexe ribozyme/substrat est constitué d une hélice intramoléculaire (hélice II) et de deux hélices intermoléculaires (hélices I et III) (Fig. 8). Bien que de structure différente, les ribozymes en tête de marteau et ceux en épingle à cheveux peuvent se retrouver sur les brins opposés d un même virus ARN satellite et catalysent des réactions identiques 47. Le ribozyme en épingle à cheveu (hairpin ribozyme) Ces ARN ont été initialement isolés de virus satellites de plantes. Le motif catalytique en épingle à cheveu est impliqué dans la réplication de ces virus par un processus de cercle roulant identique à ce qui a été observé dans les hammerhead ribozyme. Le motif en épingle à cheveu catalyse aussi la ligation des extrêmités et permet de générer des ARN à forme circulaire (activité ARN ligase). Ces ribozymes mesurent environ 50 nucléotides et sont constitués de deux domaines A (contenant l activité ribozyme et associé à l ARN substrat) et B séparés par une boucle interne. Les boucles A et B subissent des modifications conformationnelles et interagissent entre elles (procédé de docking), modification essentielle pour l activité catalytique. Le ribozyme du virus de l hépatite delta (HDV) L HDV est un virus circulaire à ARN satellite du virus de l hépatite B. Son ARN est simple brin et mesure 1700 pb. Il se réplique par un double mécanisme de cercle roulant nécessitant une activité autocatalytique contenue à la fois dans l ARN sens et l ARN antisens. L activité ribozyme est donc nécessaire à sa réplication. Le ribozyme VS Cet ARN a été isolé de mitochondries d une souche de Neurospora sp. (souche Varkud-1c). Le motif catalytique est responsable de l autoclivage et la ligation de l ARNnc VS transcrit à partir de l ADN VS. L activité du domaine catalytique correspond à un fragment de 154 nucléotides. La structure secondaire complexe est constituée de six domaines (I à VI) dont deux (I et V) possèdent des inter- Figure 8 Principe d action d un ribozyme 49. 1: les ribozymes spécifiques s hybrident à l ARNm cible; 2: l ARNm est lysé en présence du ribozyme à activité catalytique. L ARNm ne peut plus être traduit. LigandAssay 15 (2)

12 actions importantes. Les longs ARN non codant (long noncoding RNA, lncrna) Ces ARN se définissent par une taille supérieure à 200 pb et peuvent aller jusqu à 100 kb. Les gènes codant pour ces ARN sont transcrits essentiellement par l ARN polymérase II et dans de rares cas par l ARN polymérase III, et ne subissent pas de traitement identique à celui subit par l ARNm du fait de leur propriété principale de régulation. Nous donnerons quelques exemples de leur action, ces longs ARNnc sont nombreux et mal connus à l heure actuelle (Fig. 9) 2. Actuellement, le nombre d ARNnc contenus dans le génome humain n est pas connu. L inactivation de l X Chez les mammifères (dont l être humain), le mâle possède un X et la femelle deux X. Afin de pallier à la différence du nombre de chromosome X et pour qu il n y ait pas de déséquilibre quantitatif dans l expression des gènes issus de ces chromosomes, deux mécanismes peuvent être observés, soit l un des deux X est inactivé aléatoirement (c est le cas chez la femme), soit l expression des gènes de l unique X du mâle est augmentée (c est le cas de la drosophile). Dans tous les cas, la stratégie de régulation de l expression de l X fait intervenir des ARNnc. Sans entrer dans les détails de ce mécanisme, chez la femme, une région particulière du chromosome X joue un rôle fondamental dans l initiation et la diffusion de l inactivation de l X, la région X inactivation center (Xic). Un ARNnc transcrit à partir de cette région du chromosome X qui deviendra inactif, X inactivation specific transcript (Xist) participe au recrutement d enzymes permettant la condensation progressive de la chromatine (notamment en méthylant des histones) et par conséquent, l inactivation de l X 52. Les loci HOX Au nombre de quatre (A, B, C et D et contenant 39 gènes homeobox [HOX]), ces loci jouent un rôle fondamental dans l expression coordonnée de gènes pour le modelage et la différentiation cellulaire. Plus de la moitié des transcrits de ces loci sont des ARNnc issus des régions intergéniques souvent co-exprimés avec les gènes issus des parties codantes adjacentes. Bien que mal connue et complexe, cette co-expression en cis (sur le même chromosome et locus) permet localement une régulation fine, par exemple en se fixant sur une méthyltransférase dont l action sera alors d inactiver le gène adjacent. Par ailleurs, ces ARNnc peuvent aussi avoir une activité en trans 53. On retrouve des mécanismes similaires dans d autres cas tels que l empreinte parentale (où seul, un des chromosomes issus soit du père soit de la mère est exprimé) dans laquelle un long ARNnc inactive un des deux chromosomes (par exemple, l ARN H19 est impliqué dans l empreinte d insulin like growth factor 2 (IFG2). L exemple des loci HOX démontre le rôle fondamental de certains ARN dans le développement d un organisme et une de leur propriété, la capacité à recruter des complexes protéiques modifiant les histones afin de transformer la structure chromatinienne dans un état transcriptionnel actif ou passif. Répression transcriptionnelle par les ARN non codant Alu Les ARNnc peuvent aussi interagir avec l ARN polymérase II afin de réprimer la transcription chez les eucaryotes. Par exemple, schématiquement, dans certaines conditions de choc thermique sur des cellules humaines, Figure 9 Exemples d action des longs ARNnc. Schéma d une région avec les deux brins sens (5 3 ) et antisens (3 5 ). Les gènes sont représentés par les régions avec les rectangles pleins. Les flèches sur les rectangles indiquent le sens de la transcription sur chaque brin. 1: une région d un promoteur non codant (orange) peut modifier (par stimulation ou inhibition) l expression d un gène situé en aval (gène violet) par exemple en inhibant l ARN polymérase II et/ou en remodelant localement la chromatine. C est le principe de l interférence transcriptionnelle; 2: un transcrit antisens (marron) hybride un transcrit sens chevauchant et inhibe la reconnaissance des sites d épissage par le complexe protéique d épissage, le spliceosome. Il en résulte un ARNm avec épissage alternatif. Une alternative possible à cette hybridation de l ARNnc est l activation de Dicer puis la formation de siarn; 3: un transcrit ARN antisens se fixe sur des protéines cibles et peut alors avoir plusieurs conséquences selon les ARNnc; a: moduler l activité d une protéine; b: guider la localisation cellulaire d une protéine; c: constituer une partie d une structure protéique complexe ; 4 : un long ARNnc peut être fragmenté en plusieurs petits ARNnc (exemples, miarn, piwiarn). 166 LigandAssay 15 (2) 2010

13 l ARN polymérase III permet la transcription d un ARNnc Alu à partir d éléments short intersped element (SINE). L ARNnc se fixe alors sur l ARN polymérase II et inhibe son interaction avec les promoteurs de gènes de ménage (housekeeping genes). Le mécanisme précis demeure encore mal connu 53. Expression tissu spécifique des ARN non codant Dans le cerveau plus particulièrement, on retrouve des ARNnc spécifiques issus de diverses régions génomiques (intergéniques, introniques et sites soumis à empreinte parentale). Ces régions codent des transcrits ARNnc pouvant chevaucher en sens ou antisens des gènes codants dont le rôle est essentiel pour le fonctionnement du neurone. On observe une inter-relation de l expression des ARNnc et des gènes codants (chevauchant ou non) aboutissant à une régulation fine effectuée par les ARNnc (Fig. 10). LES PETITS ARN NON CODANT RÉGULATEURS Les ARNnc des procaryotes Les petits ARN de régulation ou ARNs Certains petits ARNnc des procaryotes appelés ARNs (ou srna, small regulatory RNA) jouent un rôle majeur de régulation chez les procaryotes notamment en condition de stress. Le séquenc age de plusieurs génomes de procaryotes a permis de mettre en évidence de nombreux ARNs conservés entre les différentes souches bactériennes 54. Ces ARNs bactériens non codant mesurent entre 50 et 250 pb, sont transcrits depuis des régions intergéniques (IGR) des chromosomes, à partir d éléments mobiles (cf transposons) ou dans des plasmides et présentent souvent des structures secondaires complexes. Ils ont une structure et des caractéristiques proches de celles des microarn (miarn) des eucaryotes. Ces ARNs agissent en trans (plus rarement en cis) et sont impliqués dans la régulation traductionnelle. De manière générale, les ARNs en cis sont exprimés de manière constitutive alors que ceux codés en trans agissent en général en présence de conditions spécifiques (faible teneur en fer du milieu, stress oxydatif par exemple). Ainsi, certains ARNs hybrident les ARNm et par un mécanisme complexe, inhibent la traduction de l ARNm d une manière similaire aux miarn des eucaryotes. D autres ARNs viennent se fixer sur la séquence de Shine-Dalgarno (nécessaire à la traduction chez les procaryotes) ou au codon d initiation AUG pour réprimer la traduction en empêchant la fixation du ribosome 30S. D autres mécanismes de régulation par les ARNs semblent aussi exister 53. Selon les cas, la complémentarité au cours de l hybridation peut être partielle ou complète 54. Les protéines et les ribonucléases agissant de concert avec ces ARNs sont encore mal connues. Figure 10 Régulation schématique en cis d un gène par un ARNnc chevauchant - Exemple. La séquence codante d un ARNnc est exprimé en antisens (flèche mauve indiquant le sens 5 3 de la transcription) alors que le gène codant est exprimé en sens (flèche bleue indiquant le sens 5 3 de la transcription). Les deux gènes se chevauchent (séquences communes aux deux gènes). Après transcription, l ARNnc va se fixer sur une méthyltransférase d histone et l activer. En méthylant les histones se fixant localement sur le génome, une condensation de la chromatine provoque l inhibition de la transcription du gène codant pour une protéine. Les riboswitches Dans la partie 5 de l ARNm se trouvent des éléments de régulation de l ARN pouvant adopter différentes conformations en réponse aux événements extérieurs (ribosomes bloqués, fixation de ligands/métabolites, modification de température...) modifiant ainsi l expression du gène correspondant. Parmi ces éléments, certains sont des capteurs de métabolites (par exemple, S-adenosylmethionine, lysine...) appelés aussi riboswitches 55. La fixation du métabolite sur cette structure complexe de l ARN provoque une modification conformationnelle et participe soit à la régulation transcriptionnelle, soit au contrôle de la traduction, en induisant essentiellement une action de répression 54. Bien que le plus souvent décrits chez les bactéries, les riboswitches sont aussi présents chez les eucaryotes 56. Les ARNs modulant l activité protéique Certains ARNs possèdent une activité intrinsèque (cf. la RNase P), participent aux fonctions essentielles de ribonucléoprotéines (cf. ARN 4.5S et tm) ou exercent une activité régulatrice en mimant la structure de certains acides nucléiques et déroutent ainsi les protéines vers leurs acides nucléiques cibles (cf. ARNs CsrB, 6S et GlmY) 54. Les groupes de courtes séquences palindromiques CRISPR (clusters of regularly interspaced short palindromic repeats) Les CRISPR constituent un système de défense contre les virus, les plasmides et les transposons similaire à ce qu on observe chez les eucaryotes (similitude avec les petits ARN interférents, siarn). Elles empêchent par ailleurs la conjugaison bactérienne. On les retrouve chez 40% des bactéries démontrant ainsi leur rôle majeur 57. Les loci CRISPR sont constitués d une séquence leader de 550 pb suivie de courtes séquences répétées très conservées de pb séparées par de petites séquences (spacer) de pb mais de séquence variable (zones hypervariables). Ces spacers incorporent («capturent») spécifiquement de l ADN viral (par exemple, ADN de phage) à l aide de protéines CAS dont le rôle est encore mal connu (codées par des gènes adjacents aux loci CRISPR, les gènes CAS (CRISPR-associated) et les petits ARN issus de ces loci). Des segments d ADN du locus sont transcrits en ARNs pour assurer une réponse immunologique adaptée de la bactérie (adaptive immunity), c est-à-dire la destruction du phage ADN en pré- LigandAssay 15 (2)

14 sence des protéines CAS. Les séquences CRISPR agissent donc sur de l ADN et non de l ARN. Par un mécanisme inconnu, des séquences d ADN du phage sont incorporées, deviennent héritables et permettent à la bactérie d acquérir une résistance aux phages (Fig. 11). Par un mécanisme similaire, la conjugaison des plasmides peut être inhibée 53. La présence de ces séquences chez la plupart des bactéries permet de les utiliser comme outils épidémiologiques (cf. évolution bactérienne, génotypage de souches, transfert horizontal). Quels sont les avantages de ces ARNs par rapport à des protéines au rôle similaire pour la régulation de l expression de gènes? Les ARNs sont rapides à synthétiser et nécessitent moins d énergie pour la cellule. Ils sont plus petits que les ARNm ( pb pour les ARNs versus au-dessus de 1000 pb pour les ARNm). Ils ne nécessitent pas d étape de traduction. Leurs effets sont rapides et sensibles. Leur action on/off est plus vive que celle des protéines 58. Les cinétiques d action des ARNs et des protéines sont différentes. Leur action étant stoechiométrique, la quantité d ARNs est importante pour son effet. Quand elle dépasse largement celle de l ARNm, son action off est immédiate. Dans le cas contraire, l ARNs a peu d action sur l ARNm. Il existe donc pour les ARNs un seuil d efficacité. Ainsi, lorsque le signal de stimulation est faible, les ARNs sont peu efficace. En revanche, autour du seuil d efficacité des ARNs, il semblerait que l ARNs soit très sensible aux stimuli et puisse provoquer une modulation précise de la réponse génétique 59. Les ARNs par ailleurs peuvent contrôler à des degrés variables tout un réseau métabolique et selon le degré d appariement (et la priorité dans l appariement de l ARNs sur ses cibles) moduleront les expressions de gènes. Par ailleurs, les protéines régulatrices peuvent aussi agir en complément des ARNs. Différentes combinaisons sont alors possibles 60. Les ARNg (guide RNA) Les ARNguides (ARNg) sont de petits ARN simple brin d environ 60 pb présents chez certains procaryotes. On les retrouve dans le kinétoplaste mitochondrial de certains parasites comme les trypanosomes. Ces ARNg catalysent l insertion ou la déletion d un résidu U de certains pré- ARNm dans les mitochondries en présence d un complexe protéique, l éditosome. Il s agit d un mécanisme d editing génerant un ORF permettant la traduction de cet ARNm édité en protéine fonctionnelle. Les ARNg modulent ainsi la combinatoire de traduction possible à partir d un pré- ARNm 11. Les ARNnc des eucaryotes impliqués dans la répression des ARN Figure 11 Principe d action des ARNs CRISPR (clusters of regularly interspaced short palindromic repeats) 53. Le locus CRISPR est composé de séquences répétées séparées par des séquences hypervariables uniques (spacers). Les gènes CAS codent pour des protéines CAS dont les fonctions consistent à manipuler les ARN CRISPR pour les rendre fonctionnels et/ou à réprimer l expression des séquences du locus. Le locus CRISPR est transcrit en un long ARN traité ensuite à l aide d un complexe protéique appelé complexe Cascade et qui le transforme en petits ARN constitués d un ensemble spacer/séquence répétée appelés aussi ARNcr (ARN CRISPR). Ces ARNcr, par un mécanisme inconnu, ciblent l ADN étranger en présence d autres protéines CAS, semble-t-il pour le dégrader. Il s agit d un domaine récent fondamental dont les applications tant dans la recherche que dans le domaine thérapeutique ou diagnostique sont potentiellement très importantes. Nous allons les décrire schématiquement, la seconde partie de cet article leur étant consacrée. De manière générale, ces petits ARN sont obtenus à partir de précurseurs ARNnc et ont la particularité de servir de guide à des protéines particulières, les protéines argonautes (AGO) afin de réguler leur cible respective. On distingue trois classes d ARNnc, les microarn (miarn), les piwiarn (piarn) et les petits ARN interférents (small interfering ARN [siarn]). Les microarn (miarn) Ce sont de petits ARN de pb dont la production est assurée par les enzymes Dicer à partir de précurseurs transcrits de zones intergéniques, introniques ou même de régions codantes. Les miarn vont guider les complexes RNAinduced silencing complexes (RISC) aux ARNm auxquels ils s apparient avec une spécificité absolue ou, le plus souvent, relative (par appariement à un site spécifique du miarn de 6-8 pb, la tête (seed)). Par ce complexe ainsi formé, on observera une inhibition de la traduction ou une lyse de l ARNm. Ces miarn jouent un rôle fondamental dans la régulation du transcriptome. Présents dans tout le génome, ces miarn jouent des rôles multiples tant dans le développement que l adaptation au stress et à la signalisation hormonale. Les small interfering RNA (siarn) Les siarn, petits ARN d environ 22 pb, sont synthétisés à partir de précurseurs ARN double brin traités par les enzymes DICER. Ces siarn peuvent avoir plusieurs origines différentes telles que les ARN viraux, des transgènes, des transposons, des loci spécifiques. Ils peuvent être aussi synthétisés par des ARN polymérases ARN dépendantes (RNA dependent RNA polymerase [RdRp]) qui recopient des ARN simple brin (ce dernier mécanisme n existe pas chez les mammifères). Une fois traités par les enzymes DICER, les siarn vont s associer aux protéines AGO qui vont guider l interférence ARN soit au niveau de l ARN, soit au niveau de l ADN. Ces siarn jouent un rôle majeur dans la défense contre les virus chez la drosophile et les plantes notamment. Certains virus peuvent d ailleurs contourner ces siarn à l aide de protéines ciblant le mécanisme de répression siarn-ago. Par ailleurs, les siarn jouent un rôle majeur dans la régulation de l expression de nombreux gènes notamment la répression de transposons. De nombreux siarn notamment ont été observés chez la souris et la drosophile, les siarn endogènes, endo-siarn exprimés dans les oocytes et les cel- 168 LigandAssay 15 (2) 2010

15 lules des lignées germinales et somatiques dont les transposons sont la principale cible en empêchant leur expression. Observés principalement chez les plantes et plus rarement chez les mammifères (notamment la souris chez qui cet ARN a été particulièrement étudié), les transcrits siarn issus de gènes antisens peuvent jouer en cis ou en trans un rôle direct de régulation de l expression du gène dont ils sont adjacents et/ou chevauchant 53. Dans la lignée germinale chez les plantes, les siarn jouent aussi un rôle pour empêcher la mobilité des transposons, rôle assuré par les piarn chez les mammifères. Les piwi-interacting RNA (piarn) La superfamille des protéines argonautes (AGO) est constituée de deux grandes branches, la branche AGO retrouvée tant dans la levure, les plantes que les animaux et la branche PIWI spécifique de l espèce animale. Les piarn ont surtout été étudiés chez la souris et la drosophile. Dans les deux cas, on distingue trois membres différents. Les piarns se distinguent des miarn et des siarn par leur taille (25-30 pb), et leur biogenèse, indépendante des enzymes DICER. Il semblerait que ces piarn soient restreints aux cellules germinales ainsi qu aux cellules somatiques en contact avec les cellules germinales. Chez les mammifères, les piarn sont présents uniquement chez le mâle. On y distingue deux classes, la classe prépachytène et la classe pachytène. Les ARN prépachytène présentent des homologies de séquence avec les transposons et les séquences répétées. Leur expression est exactement associée avec la fenêtre d effacement/rétablissement de la méthylation de l ADN des transposons au cours du développement de la lignée germinale, probablement en provoquant des modifications histones. En revanche, les origines et les cibles des piarn pachytènes restent encore mystérieuses. Ils pourraient jouer un rôle dans le maintien de l intégrité génomique des cellules germinales. Les introns, une riche source d ARNnc Les introns constituent au moins 30% du génome humain et semblent constituer une source majeure d ARNnc. Parmi ces derniers nichés dans des gènes codants ou non, certains jouent un rôle majeur dans la régulation de l expression des gènes codant dans lesquels ils se trouvent 56,61. Il semble qu environ 81% des gènes codants subissant un épissage possèdent des introns transcriptionnellement actifs essentiellement dans le noyau 62. Les introns sont épissés au cours de la transcription mais la formation des ARNnc issus de ces derniers est encore largement inconnue. Il semble que l ARN polymérase II agisse sur leur transcription (d autres ARN polymérases ont été aussi impliquées) et que celle-ci soit coordonnée et co-régulée avec la transcription du gène codant correspondant. Parmi ceux-ci, certains ARNnc possèdent une queue poly(a) 62. Un certain nombre de ces ARNnc issus d introns jouent un rôle de régulateur de l expression de gènes codants soit au niveau transcriptionnel (régulation de l épissage alternatif), soit au niveau post-transcriptionnel (par exemple, par interférence transcriptionnelle) bien que cela soit encore mal connu. Ces ARNnc seraient eux-même régulés par des stimuli extérieurs (cf. hormones) mais cela nécessite confirmation 62. Parmi les ARNnc issus d introns, on retrouve notamment des microarn et des ARNsno. Les études montrent cependant qu un certain nombre d entre eux sont transformés en d autres petits ARN [63]. Comme d autres ARNnc, ceux-ci peuvent aussi assurer un rôle de régulation épigénétique 62. Les systèmes de contrôle de qualité des ARN La dégradation des ARN dans la cellule est un phénomène général dont le contrôle est finement régulé. Malgré la grande complexité des mécanismes de dégradation des ARN, il existe de nombreuses similitudes entre les bactéries, les archaea et les eucaryotes. Schématiquement, trois classes d enzyme dégradant les ARN appelées ribonucléases (RNases) sont répertoriées selon le site de coupure en interne (les endonucléases), en 5 (les 5-exonucléases) ou en 3 (les 3-exonucléases). En pratique, il existe de très nombreuses RNases 42. Certains mécanismes assurent un contrôle de qualité des ARN. Nous en citerons quelques uns. La dégradation de l ARN après un codon stop anormal prématuré (ou NMD, nonsensemediated mrna decay) La synthèse des protéines se réalise dans le cadre d un ensemble parfaitement orchestré de transcription puis de traduction 19. Pour que cet ensemble fonctionne correctement, un certain nombre de contrôles de qualité est assuré par la cellule. Parmi les dispositifs mis en jeu, la dégradation de l ARNm après un codon stop anormal (nonsense-mediated mrna decay, NMD) constitue une réaction fondamentale dans la régulation génétique. Ce mécanisme permet l élimination des ARNm anormaux ayant acquis un codon stop prématuré anormal (pour mémoire, les codons stop sont UAA, UAG, UGA) dont les conséquences si l ARNm anormal était transcrit, serait la formation de protéines aux effets délétères de type gain/perte de fonction. Environ 30 % des maladies héréditaires sont liées à un codon stop prématuré et induisent donc cette réaction. Ce processus agit également aussi dans certains cas sur des ARNm normaux 64. Ces codons stop prématurés peuvent être la conséquence de mutations, d erreurs de transcription ou d expression de pseudogènes, d anomalies d épissage, de réarrangements, de l utilisation de sites alternatifs AUG d initiation. Dans certains cas cependant, ce mécanisme n est pas déclenché 65. C est le cas par exemple, en cas de codon stop anormal proche du codon stop normal (à une distance inférieure à 50/54 pb de ce dernier) 66 ou à proximité du codon d initiation de la transcription (AUG initiateur). Par ailleurs, la NMD n est en général pas activée dans les gènes sans introns (tels que les gènes codant pour l histone H4, pour la protéine de choc thermique 70 [hsp70] et pour le récepteur à la mélanocortine 4 [MC4R]), la machinerie cellulaire impliquée dans l épissage jouant un rôle dans la reconnaissance des codons stop prématurés du moins chez les mammifères. En revanche, chez la drosophile ou chez Caenorhabditis elegans, des gènes sans intron peuvent subir la NMD. Cette dernière notion est cependant remise en cause dans certaines études 65. LigandAssay 15 (2)

16 Bien qu encore mal connue, la reconnaissance d un codon stop anormal et le déclenchement de la NMD est complexe. Elle fait appel à de nombreuses protéines parmi lesquelles des ribonucléoprotéines présentes en aval du ribosome de terminaison et qui activeraient ce dernier, un complexe protéique du spliceosome appelé exon junction complexes (EJC) chez les mammifères uniquement 65 ) et des protéines regulator of nonsens transcripts (UPF) 64,65. Ainsi, le déclenchement de la NMD est complexe et un certain nombre de protéines interviennent tant dans la régulation de la NMD que dans son déclenchement ou son inhibition (par exemple, la protéine PABPC1, poly(a)-binding protein 1, impliquée dans la traduction) 64. La NMD dont on pensait initialement qu elle jouait un rôle comme gardien de l intégrité de l ARNm joue aussi une fonction importante dans la modulation de l expression des gènes. Des travaux sont en cours à ce sujet, la NMD jouant un rôle non seulement dans la dégradation des ARNm anormaux mais aussi dans celle d environ 5-10% d ARNm normaux 65. La dégradation par polyadénylation Chez les procaryotes Ce mécanisme a été démontré chez E. coli pour la dégradation des ARNt et des ARNr anormaux 67. Une polymérase poly-(a) permet la polyadénylation d ARNt anormaux qui subissent alors une dégradation par une 3 5 ribonucléase polynucléotide phosphorylase (PNPase). De manière similaire, une PNPase, une 3 5 exoribonucléase et une RNase R dégradent les ARNr anormaux. Le mécanisme de déclenchement de ces réactions est encore mal connu. Il semblerait que la modification spatiale de l ARN anormal induise ces réactions en permettant l accessibilité d un groupement 3hydroxyl à ces molécules ce qui ne serait pas possible dans la configuration spatiale normale 67. Chez les eucaryotes Un système proche de celui exposé ci-dessus à savoir une 3polyadénylation des ARNnc anormaux, a été démontré chez Saccharomyces cerevisiae. Cela a été démontré pour les ARNt anormaux en présence d un complexe protéique dénommé TRAMP mais ce complexe agit aussi sur les autres ARNnc tels que les ARNr, les ARNsno et les ARNsn 67. Ce complexe possède une activité de polyadénylation. La structure spatiale de l ARN joue un rôle majeur dans la reconnaissance d un ARN anormal par le complexe TRAMP. L ARN est ensuite dégradé par un autre complexe, l exosome constitué de protéines et de ribonucléases (par exemple, la RNase PH) dans le noyau, TRAMP étant alors un cofacteur de ce complexe. La protéine Ro60 La dégradation des ARN peut se faire dans le noyau comme ci-dessus et/ou dans le cytoplasme. La protéine Ro60 (Trove domain family member 2 [TROVE2]) a initialement été décrite comme un antigène chez les patients atteints de pathologie inflammatoire auto-immune (telle que le lupus ou le syndrome de Goujerot-Sjögren). Il s agit d une protéine de localisation nucléaire et cytoplasmique. Elle présente la particularité de s associer avec des ARNnc d environ 100 nucléotides, les ARN Y dont le rôle est mal connu. Chez les humains, quatre ARN Y ont été identifiés. Transcrits par l ARN polymérase III, ils joueraient un rôle dans la réplication de l ADN (Omim ). Ro60 se fixe sur de nombreux ARNnc de conformation spatiale anormale tels que les pré-arnr 5S, des snarn. Fixé aux ARNnc anormaux, Ro60 induit l action de nucléases non identifiés pour dégrader l ARN. L ARN Y pourrait jouer un rôle dans la régulation de Ro Les mécanismes sont encore largement inconnus. Les autres systèmes de dégradation de l ARN Les ARNm Nous ne traiterons dans ce paragraphe ni des ARNs ni des siarn ou miarn, objets de paragraphes spécifiques. En dehors du contrôle de qualité décrit ci-dessus, la dégradation de l ARN peut survenir de différentes manières. Schématiquement, elle peut survenir à plusieurs étapes, ces mécanismes étant intriqués avec ceux des contrôles de l intégrité des ARN: l ARNm synthétisé sous forme d un large précurseur doit être partiellement dégradé pour devenir actif. Chez les eucaryotes, par exemple, un ARN polycistronique d ARN ribosomaux synthétisé par l ARN polymérase I nécessite d être clivé à l aide d endo- et exonucléases pour libérer les ARNr actifs; les introns éliminés par épissage sont dégradés par des exonucléases; au cours de l exportation de l ARNm du noyau vers le cytoplasme, l ARNm peut être dégradé par des 5- ou des 3-exonucléases; au cours de la traduction, l ARNm subit plusieurs tours de traduction au cours desquels la queue poly(a) est progressivement raccourcie par une deadenylase; lors du turnover des ARNm et des ARNnc, partie intégrante du métabolisme des ARN. Il s agit alors d une dégradation constitutive qui joue un rôle clé dans la régulation de l expression des gènes 42. Les ARNnc (ARN non codant) En grande majorité, les ARN et notamment les ARNnc sont transcrits par l ARN polymérase II. La plupart des ARN transcrits sont dégradés dans le noyau formant une population hétérogène nucléaire, l ARNhn (heterogeneous nuclear RNA). Il semblerait que de l ARNnc, véritable bruit de fond transcriptionnel, serait aussi présent dans le noyau 42. De petits transcrits antisens sont aussi générés à partir de promoteurs et sont rapidement détruits par les exosomes. Enfin, on retrouve aussi des ARNnc transcrits à partir de régions antisens intergéniques ou de zones antisens de gènes codants et qui constituent aussi un bruit de fond transcriptionnel de rôle mal défini. Ces ARNnc seraient hautement instables et sont difficiles à mettre en évidence expérimentalement. Ils seraient dégradés par les complexes exosomes. L ARN polymérase III transcrit de petits ARN tels que l ARNt, l ARNr 5S, l ARNsn U6. La surveillance de ces ARN peut amener à leur dégradation par des 5-exonucléases, des exosomes 42. La dégradation des ARNnc est en fait un processus hautement efficace. 170 LigandAssay 15 (2) 2010

17 Par ailleurs, outre les systèmes complexes de dégradation des ARNnc brièvement évoqués, il existe aussi un grand nombre de RNases non spécifiques telles que la RNase A pour les eucaryotes ou la RNase T1 pour les champignons. Il s agit dans ces derniers cas de RNases extracellulaires dégradant les ARN. On en retrouve notamment sur la peau et dans le sang. Il semblerait que le rôle de ces RNases serait d empêcher des ARN de s intégrer aux métabolismes intracellulaires. Le ribonome Certains auteurs ont proposé la théorie du ribonome 68. Le ribonome est constitué par l ensemble des ARN cellulaires et de leur facteurs de régulation au sein des ribonucléoprotéines à un temps et un lieu donnés. Il opère à de multiples niveaux de la régulation des gènes en contrôlant et coordonnant la transcription, l épissage, l export, la stabilité et la traduction de nombreux ARNm réalisant ainsi une expression coordonnée de gènes. Dans les cellules de mammifères, il est constitué de protéines fixant des ARN (RNA-binding proteins [RBP]), les ARNm, des ARNnc de régulation et des protéines auxiliaires, les messenger ribonucleoprotein (mrnps) 68. Les RBP sont retrouvées également chez les eucaryotes et les archaea. Il s agit encore une fois d un phénomène complexe dans lequel un certain nombre d ARNm sont assemblés et corégulés à l aide de protéines associées à des mrnps. Des petits ARNnc sont alors ciblés sur ces ARNm co-régulés en agissant en trans sur des RNPs afin de coordonner l expression de l ensemble de ces ARNm. Sur chaque ARNm, de multiples éléments sont présents en cis et constituent un code modulaire appelé untranslated sequence element for regulation (USER). Ce code modulaire détermine les RBP qui se fixeront sur un ou plusieurs ARNm et définira ainsi le destin de chaque ARNm. Ces nombreux RBPs agissent en collaboration ou en compétition, leur combinaison donnant le schéma d expression final. Les changements métaboliques de la cellule sont alors responsables de modulation de l expression des gènes de fac on coordonnée permettant alors à la cellule de réagir rapidement à un changement environnemental Figure 12 Principe de régulation au sein d un ribonome - Exemple 68. Ce schéma illustre les régulations complexes qu on peut observer au sein d un ribonome. Dans ce schéma, les ribonucléoprotéines (RBP) constituent un réseau dans le cytoplasme où ils régulent directement la stabilité ou la traduction d ARNm réciproquement, ce qui aboutit à une régulation fine et coordonnée du système. Ce système agit aussi en coordination avec d autres et module ainsi d autres ARNm cibles. interne ou externe. Le ribonome n est pas le transcriptome. Il représente l organisation dynamique des ARNm au sein de l infrastructure constituée par les ribonucléoprotéines alors que le transcriptome évalue les ARNm dans leur ensemble. Nous allons illustrer par un exemple cette différence 68. Par exemple, supposons que 100 molécules d ARNm codent pour la protéine X, 25 d entre elles pourraient être activées dans un état associé avec les mrnp 1, 50 autres pourraient être réprimés au cours de la traduction dans un état associé avec les mrnp 2 et 25 autres ARNm pourraient se trouver dans un état/compartiment silencieux. Le transcriptome donnerait une activité de cet ARNm de 25 % sans autre précision. Le ribonome permet d évaluer comment est régulé plus finement cet ARNm ou plus précisément l ensemble des régulations auxquelles est soumise un ARNm ou une classe d ARNm à l étape post-transcriptionelle. Le ribonome peut donc être défini comme l état des ribonucléoprotéines (incluant les ARNm) présentes dans la cellule à un moment donné. Elle permet une étude des régulations dynamiques à l étape post-transcriptionnelle (Fig. 12) 68. Par ailleurs, il a pu être démontré dans certains cas que le ribonome agissait au sein d une cellule mais pouvait aussi parfois agir sur les cellules adjacentes par transfert d ARN à l aide d exosomes (transfert horizontal) 69. Certains par analogie avec ce qui est observé avec les virus ont même parlé de «quasi-génome» pour le ribonome. Mais, cela reste encore à confirmer par d autres études 68. Le ribonome est donc une couche de modules et de circuits fonctionnels ayant des tâches autonomes de contrôle et de coordination au sein des réseaux d expression des gènes. Le transcriptome Le transcriptome représente l ensemble des transcrits issus d un génome à un moment donné. En pratique, il s agit de l expression des ARN de toute classe, identifiés et exprimés dans une cellule et/ou un tissu voire un organisme entier. Il est bien entendu impossible dans cet article de décrire ce dernier tant sa complexité, ses spécificités cellulaires, tissulaires, métaboliques, d espèce sont importantes. Nous donnerons quelques idées générales en se basant sur certains aspects du transcriptome de mammifères. Dans le génome cellulaire humain, on considère qu il existe environ gènes codant pour des protéines. Néanmoins, l étude du transcriptome a montré que la diversité de transcription amenait à un niveau de complexité supérieure du fait de la possibilité d épissages alternatifs aboutissant à des isoformes protéiques (environ 60% des transcrits codants mais les chiffres varient selon les études, allant jusqu à 95% 70 ), de l utilisation de codons d initiation alternatifs (environ 60% de gènes codant ont au minimum deux sites de transcription), de la diversité des extrémités 5 et 3 des gènes dont la structure est fondamentale pour la régulation des ARNm, leur synthèse, leur traduction et leur localisation subcellulaire. Par ailleurs, dans certains cas, l editing de l ARN peut aussi modifier la diversité transcriptionnelle. Comme nous l avons déjà écrit ci-dessus, l étude du transcriptome a démontré que la majorité des transcrits ne sont pas des ARNm mais des ARNnc. Par ailleurs, une couche supplémentaire de complexité a été mise en évidence par la démonstration d une LigandAssay 15 (2)

18 organisation de régions de gènes transcrits en sens et en antisens au même locus et dont la coordination est finement régulée (Fig. 13) 17. Par ailleurs, les études de transcriptomes de mammifères ont révélé qu environ 0,5-1% des gènes codants humains possédaient des domaines de fixation de l ARN (RNA-binding domains [RBD]), les protéines contenant ces domaines sont encore mal connues et d autres domaines similaires existent probablement 70. Beaucoup d interrogations demeurent par exemple : quel(s) mécanisme(s) de coordination existe(nt) entre la transcription et le traitement de l ARN afin d obtenir un métabolisme physiologique équilibré cellule- ou tissu-dépendant, avec ou sans nécessité d interactions physiques directes? quelle est la part réellement fonctionnelle des transcrits ARN mis en évidence 70? Par ailleurs, de nombreuses études démontrent que le taux d ARNm du transcriptome et de protéines du protéome (l ensemble des protéines exprimés dans une cellule et/ou un tissu voire un organisme entier) ont une faible corrélation l un avec l autre (r = 0,2-0,6) 71, ce qui laisse penser que d autres régulations complexes existent en plus de celles actuellement connues pour la transcription et la traduction 68. ARN non codants et pathologie chez l être humain Lorsqu un gène codant présente une mutation, le phénotype est plus ou moins sévère, le plus souvent visible cliniquement. Un gène codant muté provoque donc de manière variable, fonction de la pénétrance, un phénotype visible clinique et/ou biologique dans les maladies dites monogéniques. Dans le cadre des maladies polygéniques, le phénotype est plus difficile à interpréter à partir des données génetiques et de nombreuses études d association dans le génome sont en cours pour compléter et comprendre les résultats déjà obtenus. L importance croissante des ARNnc et leur rôle majeur dans la régulation génétique ajoutent un degré de complexité supplémentaire à l interprétation des phénotypes observés tant dans les maladies monogéniques que polygéniques. Les modifications (mutations) sur les ARNnc provoquent le plus souvent des modifications plus subtiles et plus difficiles à déterminer d autant plus que leur connaissance est plus récente. L association de mutations sur des gènes codants et non codants aboutit à une combinatoire d effets phénotypiques complexe à interpréter 61. De nombreux exemples seront donnés dans la seconde partie de cet article. Certains mécanismes régulateurs peuvent moduler les effets pathologiques des mutations sur les gènes codants. Nous présentons ci-dessous deux mécanismes potentiels (transvection et transinduction) puis d autres exemples généraux de mécanismes moléculaires impliquant des ARNnc. D autres mécanismes existent. Nous ne les décrirons pas ici 72. Transvection et ARNnc Sur certains loci, un phénomène particulier a été observé. Il a été nommé transvection : une région jouant un rôle de régulation située en amont d un gène codant Figure 13 Schéma représentant un aspect de la complexité du transcriptome. Les rectangles verts représentent des séquences d exons non codants et les rectangles bleus des séquences d exons codants. Les diamants verts représentent des ARNsno et les triangles jaunes des séquences de microarns. A. Présence de transcrits à partir des brins sens et antisens se chevauchant. B. Transcrit sur le brin sens avec présence d un autre transcrit niché dans un intron du grand transcrit. Il y a donc deux transcrits sur le brin sens. muté peut maintenir un phénotype relativement normal lorsqu il est combiné avec une région mutée jouant un rôle de régulation, celle-ci étant associée (linked) au gène codant non muté sur le même chromosome (lesquels donnent un phénotype mutant quand ils sont homozygotes). Ce phénomène a été décrit chez la drosophile 73. Il semblerait cependant qu il s agisse d un phénomène universel 61 qui mettrait en oeuvre un mécanisme lié physiquement entre des promoteurs et/ou des enhancers agissant en cis sur un même chromosome permettant de stimuler la transcription de gènes codants adjacents sur l autre chromosome. Dans certains cas, ce mécanisme pourrait s effectuer sur de grandes distances, voire entre différents chromosomes 61. Beaucoup de promoteurs présentant une transvection sont transcrits en ARNnc. Complexité supplémentaire, des modifications épigénétiques peuvent survenir (elles-même pouvant être régulées par des ARNnc). En conclusion, les études menées sur ce difficile sujet semblent montrer que la transvection est effectuée à l aide d ARNnc. Il s agirait alors d une transcomplémentation, résultat d un état hétérozygote composite entre un locus contenant un ARNnc régulateur et un locus contenant un gène codant à proximité et dont l expression est contrôlée par cet ARNnc. Ce mécanisme est cependant encore mal connu chez les eucaryotes 61. Transinduction Ce phénomène a été observé pour le locus -globine. Lorsqu on transfecte transitoirement un gène -globine, celui-ci induit la transcription de la région de contrôle du locus, locus control region (LCR) ainsi que des régions intergéniques du locus β-globine dans des cellules nonérythroïdes. Cet effet dépend de la transcription du gèneglobine issu du plasmide transfecté et de son association au locus β-globine endogène mais non pas de son expression protéique démontrant ainsi qu il ne s agit pas d un phénomène associé à l expression d une protéine mais bien à l action d ARNnc 74. La séquence impliquée dans ce phénomène n a pas encore été élucidée 61. Mutation et gène d ARNnc À ce jour, peu de pathologies conséquences directes de mutation sur des gènes d ARNnc ont été décrites. 172 LigandAssay 15 (2) 2010

19 Peut-être ces gènes ne sont-ils pas suffisamment explorés, la majorité des études de pathologie moléculaire ciblant surtout les gènes codants. Les mutations affectant les fonctions transrégulatrices des ARNm Des mutations sur des régions 3-non codantes des ARNm ont été identifiées, par exemple dans le syndrome de la Tourette 75. Ces mutations semblent être localisées sur des sites de fixation de miarn et provoquent alors un gain ou une perte de fixation de ces derniers. Un certain nombre de mutations situées sur la partie 3-non codante d un ARNm ne semblent pas affecter l ARNm directement en cis mais plutôt la régulation en trans assurée par un ARNnc 61. La régulation de mécanismes génétiques complexes Les ARNnc jouent un rôle majeur dans les régulations comme cela a été souvent souligné dans cet article. Leur rôle dans les mécanismes de régulation épigénétique est aussi fondamental (modification de la chromatine, des histones, méthylation de l ADN). Ces mutations induisent des modifications du phénotype soit subtiles, soit plus importantes (par exemple, dans l inactivation de l X, l exclusion allélique, l empreinte parentale, la reprogrammation des cellules germinales, les paramutations, l effet de position...) 61. Un exemple de mutation sur un ARNnc est celui décrit dans un modèle murin d une ataxie cerebelleuse humaine, l ataxie spinocerebelleuse de type 8 (SCA8, Omim ). Les patients présentent une expansion (augmentation) du nombre de triplets CUG sur l ARNnc présent sur le brin antisens, ataxin 8 opposite strand (ATXN8OS), gène en antisens du gène codant KLHL1 (Kelch-like 1, Omim ). La souris transgénique présentant la même expansion développe les signes cliniques observés chez l humain. Les études ont montré que dans certains cas, SCA8 développait un mécanisme de gain de fonction dans lequel étaient impliqués l ARNnc ATXN8OS et une protéine polyglutamine ATXN8 (ataxin 8), transcrite à partir du brin antisens 76. Il semblerait que des mécanismes similaires (expansion de triplets) se retrouvent au niveau des ARNnc dans certaines formes de myotonies 12. CONCLUSION Le monde des ARN dont une ébauche a été présentée dans ce premier article est complexe. L élucidation progressive mais non terminée de la structure du génome humain et des autres génomes montre l importance majeure des ARN et notamment des ARNnc longtemps négligés au profit des seuls gènes codants et de leurs ARNm. Les implications thérapeutiques, diagnostiques, pronostiques de ces découvertes sont majeures et ne sont qu à leur début. Dans la seconde partie, nous évoquerons certains ARNnc dont les rôles sont multiples bien que non encore complètement élucidés. Le monde des ARN démontre la complexité de notre génome et la finesse de sa régulation. De nouveaux mécanismes et l intrication complexe ADN/ARN se font jour. Encore une révolution biologique en marche. INTERNET Bases de données de maladies héréditaires, Omim (On line mendelian inheritance in man): nih.gov/sites/entrez?db=omim&itool=toolbar. CONFLIT D INTÉRÊT Aucun. RÉFÉRENCES 1. Kawaji H, Hayashizaki Y. Exploration of small RNAs. PLoS Genet 2008;4:e Wilusz JE, Sunwoo H, Spector DL. Long noncoding RNAs: functional surprises from the RNA world. Genes Dev 2009;23: Amaral PP, Dinger ME, Mercer TR, et al. The eukaryotic genome as an RNA machine. Science 2008;319: Dinger ME, Pang KC, Mercer TR, et al. Differentiating protein-coding and noncoding RNA: challenges and ambiguities. PLoS Comput Biol 2008;4:e Roberts L, Holcik M. RNA structure: new messages in translation, replication and disease. Workshop on the role of RNA structures in the translation of viral and cellular RNAs. EMBO Rep 2009;10: Martínez-Salas E, Pacheco A, Serrano P, et al. New insights into internal ribosome entry site elements relevant for viral gene expression. J Gen Virol 2008;89: Carninci P. The long and short of RNAs. Nature 2009: Gilmartin GM. Eukaryotic mrna 3 processing: a common means to different ends. Genes Dev 2005;19: Mattick JS. The functional genomics of noncoding RNA. Science 2005;309: Frith MC, Pheasant M, Mattick JS. The amazing complexity of the human transcriptome. Eur J Hum Genet 2005;13: Hüttenhofer A, Schattner P. The principles of guiding by RNA: chimeric RNA-protein enzymes. Nat Rev Genet 2006;7: Ponting CP, Oliver PL, Reik W. Evolution and functions of long noncoding RNAs. Cell 2009;136: Matera AG, Terns RM, Terns MP. Non-coding RNAs: lessons from the small nuclear and small nucleolar RNAs. Nat Rev Mol Cell Biol 2007;8: Chen JM, Férec C, Cooper DN. A systematic analysis of diseaseassociated variants in the 3 regulatory regions of human protein-coding genes I: general principles and LigandAssay 15 (2)

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