MALADIE DE NEWCASTLE

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1 CHAPITRE MALADIE DE NEWCASTLE RÉSUMÉ La maladie de Newcastle (MN) est due à un paramyxovirus aviaire de sérotype 1 (APMV-1), du genre Avulavirus, appartenant à la famille des Paramyxoviridae. Il existe 9 sérotypes de paramyxovirus aviaires appelés APMV-1 à APMV-9. Il a été montré que le virus de la MN pouvait infecter plus de 200 espèces d oiseaux mais la sévérité de la maladie varie considérablement selon l hôte et la souche virale impliquée. Les souches les moins virulentes peuvent induire une maladie grave en présence d'autres micro-organismes ou de certaines conditions environnementales. La méthode de diagnostic préférée est l'isolement du virus suivi de sa caractérisation. Identification de l agent pathogène : des suspensions préparées dans une solution d'antibiotiques à partir d écouvillonnages trachéaux et cloacaux (ou de matières fécales) pour les oiseaux vivants, ou à partir de matières fécales et de prélèvements d'organes regroupés pour les sujets morts, sont inoculées dans la cavité allantoïque d œufs de poule embryonnés, de 9 à 11 jours. Les œufs sont mis à incuber à 37 C pendant 4 à 7 jours. Les œufs contenant des embryons morts ou moribonds (à mesure qu ils apparaissent) et tous les œufs restants à la fin de la période d'incubation sont examinés pour rechercher l'activité hémagglutinante dans le liquide allantoïque. Toutes les substances hémagglutinantes doivent être testées pour rechercher l'inhibition spécifique avec un antisérum monospécifique dirigé contre le virus de la MN. Ce virus (APMV-1) peut présenter certaines relations antigéniques croisées avec d autres sérotypes de paramyxovirus aviaires, notamment APMV-3 et APMV-7. Le pouvoir pathogène de tout virus nouvellement isolé peut être évalué en déterminant l indice de pathogénicité intracérébrale. Le pouvoir pathogène des souches isolées peut également être évalué à l aide de techniques moléculaires telles que la transcription inverse couplée à une amplification en chaîne par polymérase (RT-PCR) et le séquençage. Dans la plupart des pays, la MN est l objet d un contrôle : les risques de propagation du virus à partir d un laboratoire étant élevés, il importe que les règles appropriées de biosécurité et de biosûreté soient respectées. Une évaluation du risque doit être effectuée pour déterminer le niveau de confinement approprié. Épreuves sérologiques : l'inhibition de l'hémagglutination est très largement utilisée pour la recherche sérologique de la MN. Son utilité diagnostique dépend du statut immunitaire vaccinal des oiseaux examinés et des conditions sanitaires qui prévalent. Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique : selon la situation sanitaire, la vaccination des volailles repose sur l'utilisation de virus vivants faiblement virulents (lentogènes) ou modérément virulents (mésogènes). On utilise également des vaccins inactivés. Différentes voies d'administration peuvent être utilisées chez les volailles pour les vaccins vivants. Les vaccins sont généralement produits en recueillant les liquides infectieux allantoïques/amniotiques après inoculation d œufs de poule embryonnés ; certains sont préparés à partir de cultures cellulaires infectées. Le produit fini est obtenu en portant les semences primaires et les semences de travail au volume voulu pour la production. Les vaccins inactivés sont administrés par voie intramusculaire ou sous-cutanée. Ils sont généralement produits par addition de formol aux préparations virales infectieuses ou par Manuel terrestre de l OIE

2 traitement à la bêta-propiolactone. La plupart des vaccins inactivés sont présentés en émulsion dans une huile minérale ou végétale. Si des virus pathogènes de la MN sont utilisés pour produire des vaccins ou effectuer des épreuves virulentes, les installations doivent répondre aux exigences de l'oie en matière de confinement des agents pathogènes (classe 4). A. INTRODUCTION La maladie de Newcastle (MN) est due à un paramyxovirus aviaire de sérotype I (APMV-I), du genre Avulavirus, appartenant à la sous-famille des Paramyxovirinae et à la famille des Paramyxoviridae. Les paramyxovirus isolés des espèces aviaires ont été classés d'après les épreuves sérologiques en 9 sérotypes appelés APMV-1 à APMV-9 ; le virus de la MN est connu sous la dénomination «APMV-1» (6). Depuis son identification en 1926, la MN est considérée comme enzootique dans de nombreux pays. La vaccination préventive est pratiquée dans presque tous les pays qui produisent des volailles à l'échelle industrielle. L'une des caractéristiques majeures du virus est la forte variation du pouvoir pathogène des différentes souches virales chez les poulets. Les souches virales ont été classées en 5 pathotypes sur la base des signes cliniques observés chez les poulets infectés (15), à savoir : 1. les souches viscérotropes vélogènes hautement pathogènes qui provoquent fréquemment des lésions intestinales hémorragiques ; 2. les souches neurotropes vélogènes qui provoquent une forme se caractérisant par une mortalité massive, généralement à la suite de signes respiratoires et nerveux ; 3. les souches mésogènes qui provoquent une forme se caractérisant par des signes respiratoires, des signes nerveux occasionnels mais une faible mortalité ; 4. les souches lentogènes ou respiratoires qui provoquent une forme se traduisant par une infection respiratoire mineure ou infraclinique ; 5. les souches asymptomatiques entériques qui provoquent une forme se traduisant généralement par une infection intestinale infraclinique. Le classement par pathotypes produit rarement des catégories bien distinctes (7) et même les infections provoquées chez des oiseaux indemnes d organismes pathogènes spécifiques peuvent donner lieu à des chevauchements considérables. Il peut aussi se produire une exacerbation des signes cliniques induits par les souches les moins virulentes en cas d infection concomitante par d'autres micro-organismes ou en présence de certaines conditions environnementales. Étant donné que les manifestations cliniques varient considérablement chez les poulets et que le diagnostic peut être compliqué par la variabilité des réponses entre les hôtes, les signes cliniques ne sont pas suffisants pour poser un diagnostic de MN. Les signes et les lésions typiquement associés aux pathotypes virulents feront toutefois fortement suspecter la maladie. Le virus de la MN est aussi pathogène pour les humains. Les infections signalées n ont jamais menacées le pronostic vital et ne furent en général pas débilitantes pour plus d un ou deux jours (18). Les symptômes les plus fréquemment signalés et bien documentés chez les humains sont des infections oculaires, consistant en une rougeur uni- ou bilatérale, un larmoiement excessif, un œdème des paupières, une conjonctivite et des hémorragies sous-conjonctivales. Bien que les troubles oculaires puissent être parfois sérieux, l infection est le plus souvent transitoire et il n y a pas d atteinte de la cornée. D autres symptômes chez des humains infectés sont moins bien documentés mais ils laissent à penser qu une infection généralisée peut survenir avec des frissons, des maux de tête et de la fièvre, avec ou sans conjonctivite. Il existe des preuves que les souches de virus de la MN, tant les souches vaccinales que les souches virulentes (pour les volailles), peuvent provoquer des symptômes chez les humains. Il n y a pas de preuve de transmission d homme à homme. 630 Manuel terrestre de l OIE 2008

3 1. Identification de l agent pathogène B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC La MN, telle qu elle est définie dans la Section B.1 de ce chapitre, est soumise à des contrôles officiels dans la plupart des pays et le risque de propagation du virus à partir d un laboratoire est élevé ; une évaluation des risques doit, par conséquent, être effectuée pour déterminer le niveau approprié de biosécurité et de biosûreté à respecter pour le diagnostic et la caractérisation du virus. Les locaux doivent respecter les normes du groupe de confinement défini par l évaluation des risques et décrits dans le Chapitre , «Biosécurité et biosûreté au laboratoire de microbiologie vétérinaire et dans les animaleries» de ce Manuel terrestre. Les pays qui ne possèdent pas de laboratoire spécialisé au niveau national ou régional doivent envoyer les prélèvements à un Laboratoire de référence de l OIE. a) Prélèvements destinés à l'isolement du virus Lorsque la MN est recherchée en présence d'une maladie sévère et d'une mortalité massive dans un élevage de poulets, il est habituel de tenter d'isoler le virus chez des oiseaux morts récemment ou bien trouvés moribonds et mis à mort dans des conditions décentes. Prélèvements à effectuer chez les oiseaux morts : écouvillonnages de la sphère oro-nasale et prélèvements tissulaires sur les poumons, les reins, l'intestin (y compris le contenu), la rate, le cerveau, le foie et le cœur. Ces prélèvements peuvent être recueillis séparément ou bien regroupés, quoique les prélèvements intestinaux soient généralement traités à part. Les prélèvements à effectuer chez les oiseaux vivants doivent inclure à la fois des écouvillonnages trachéaux et cloacaux, ces derniers devant être visiblement enrobés de matières fécales. Les oiseaux petits et fragiles peuvent être lésés par l'écouvillonnage et le recueil de matières fécales fraîches peut constituer une alternative correcte. Lorsque la possibilité d'obtenir des prélèvements est limitée, il est important d'examiner des écouvillonnages cloacaux (ou des matières fécales) et des écouvillonnages trachéaux (ou du tissu trachéal) ainsi que des organes et des tissus apparaissant lésés à l'œil nu ou connus pour être associés aux formes cliniques de la maladie. Les échantillons doivent être prélevés aux stades précoces. Les prélèvements sont placés dans une solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS) isotonique, de ph 7,0 à 7,4, additionné d antibiotiques. Les milieux à base de protéines, tels qu une infusion cœur-cerveau (BHI = brain heart infusion) ou un bouillon tryptose tamponné (TBTB = tris-buffered tryptose broth) ont aussi été utilisés et donnent de la stabilité au virus, notamment au cours du transport. Les antibiotiques peuvent varier selon les conditions locales. On peut utiliser par exemple la pénicilline (2 000 unités/ml), la streptomycine (2 mg/ml), la gentamycine (50 µg/ml) et la mycostatine (1 000 unités/ml) pour les tissus et les écouvillonnages trachéaux, mais il faut des concentrations 5 fois plus élevées pour les matières fécales et les écouvillonnages cloacaux. Il est important de réajuster la solution à ph 7,0-7,4 après avoir ajouté les antibiotiques. Pour contrôler Chlamydophila, il convient d ajouter 0,05 à 0,1 mg/ml d oxytétracycline. Les matières fécales et les coupes tissulaires minces doivent être préparées sous forme de suspensions à % (p/v) dans la solution d'antibiotiques. Les suspensions doivent être traitées dès que possible après incubation pendant 1 à 2 h à température ambiante. Lorsqu'il n'est pas possible de traiter les prélèvements immédiatement, ceux-ci peuvent être conservés à 4 C pendant un maximum de 4 jours. b) Culture du virus Les surnageants des matières fécales ou des suspensions tissulaires, obtenus par une clarification par centrifugation à g pendant environ 10 min à une température ne dépassant pas 25 C, sont inoculés sous des volumes de 0,2 ml dans la cavité allantoïque d'au moins cinq œufs de poule embryonnés, indemnes d organismes pathogènes spécifiques, incubés pendant 9 à 11 jours. Après inoculation, les œufs sont mis à incuber à 35 ou 37 C pendant 4 à 7 jours. Les œufs contenant des embryons morts ou moribonds (à mesure qu'ils apparaissent) et tous les œufs restants à la fin de la période d'incubation doivent être refroidis à 4 C afin de rechercher l'activité hémagglutinante dans le liquide allantoïque. Les liquides allantoïques donnant une réaction négative doivent être repassés sur une nouvelle série d œufs. c) Identification du virus L'activité hémagglutinante décelée dans les liquides bactériologiquement stériles recueillis sur des œufs inoculés peut être due à la présence de n'importe lequel des 16 sous-types d hémagglutinine du virus de l'influenza A ou à l'un des 8 autres sérotypes de paramyxovirus (un liquide non stérile pourrait contenir de l hémagglutinine bactérienne). Le virus de la MN peut être confirmé par l'utilisation d'antisérum spécifique dans un test d'inhibition de l'hémagglutination. On utilise généralement de l'antisérum de poulet dirigé contre une souche du virus de la MN. Manuel terrestre de l OIE

4 Les réactions croisées se produisant dans les tests d'inhibition de l'hémagglutination entre le virus de la MN et certains autres paramyxovirus aviaires, notamment les sérotypes APMV-3 et APMV-7, risquent d être sources de problèmes qui se résolvent en utilisant des antigènes et des antisérums témoins appropriés. d) Indice de pathogénicité Compte tenu de la très forte variation de virulence entre les différentes souches virales isolées et de la large utilisation des vaccins vivants, l'identification d'une souche en tant que virus de la MN chez des oiseaux présentant des signes cliniques ne confirme pas ce diagnostic. Il est par conséquent également indispensable d'évaluer la virulence de la souche (voir la Section B.1.f ci-après intitulée «Définition de la maladie de Newcastle»). Dans le passé, des tests comme le délai moyen de l effet létal sur des embryons de poulets, l indice de pathogénicité intraveineuse ou des variations de ces tests ont été utilisés (27), mais après accord international, l évaluation définitive de la virulence du virus repose sur l indice de pathogénicité intracérébrale. La définition actuelle de l'oie (voir la Section B.1.f) reconnaît aussi les avancées dans la compréhension des bases moléculaires du pouvoir pathogène et autorise la confirmation de la virulence (mais pas l absence de virulence) par des tests in vitro qui analysent la séquence des acides aminés du site de clivage de la protéine F0. Indice de pathogénicité intracérébrale i) Du liquide allantoïque infectieux frais présentant une activité hémagglutinante de titre >2 4 (>1/16) est dilué au 1/10 dans du soluté isotonique de chlorure de sodium stérile, sans autres additif du type antibiotique. ii) iii) iv) Un volume de 0,05 ml de la dilution virale est injecté par voie intracérébrale chez 10 poussins issus d œufs provenant d'un élevage indemne d organismes pathogènes spécifiques. Les poussins doivent avoir plus de 24 h et moins de 40 h au moment de l'inoculation. Ils sont ensuite examinés toutes les 24 h pendant 8 jours. À chaque observation, le score suivant est attribué : 0 si l'état est normal, 1 si le poussin est malade et 2 s'il est mort (les oiseaux vivants mais incapables de s alimenter ou de boire doivent être euthanasiés et enregistrés comme morts lors de l observation suivante. Pour les poussins morts, le chiffre 2 doit être réattribué lors de chacune des cotations journalières restantes). v) L'indice de pathogénicité intracérébrale est le score moyen obtenu par poussin et par observation sur cette période de 8 jours. Les virus les plus virulents donnent des indices qui approchent le score maximal de 2,0 alors que les souches lentogènes et entériques asymptomatiques donnent des valeurs proches de 0,0. e) Bases moléculaires du pouvoir pathogène Lors de la réplication, les particules du virus de la MN sont produites à partir d un précurseur, F0, de la glycoprotéine, qui doit être clivé en F1 et F2 pour que les particules virales deviennent infectieuses. Ce clivage post-translationnel est médié par des protéases de la cellule hôte. La trypsine est capable de cliver F0 sur toutes les souches virales de la MN. Il semble que les molécules F0 des virus virulents chez les poulets puissent être clivées par une ou plusieurs protéases de l hôte, présente(s) dans toute une série de cellules et de tissus ; ces molécules peuvent ainsi se propager chez l'hôte en endommageant les organes vitaux. Le clivage des molécules F0 des virus faiblement virulents est en revanche conditionné par la présence de certaines protéases de l'hôte, de sorte que ces virus se multiplient uniquement dans certains types de cellules hôtes. Sur la plupart des virus de la MN qui sont pathogènes pour les poulets, on constate la présence de la séquence 112 R/K-R-Q-K/R-R 116 sur la fraction C-terminale de la protéine F2, et de F (phénylalanine) sur le résidu 117, c est-à-dire la fraction N-terminale de la protéine F1 ; sur les virus de faible virulence on observe la présence de séquences 112 G/E-K/R-Q-G/E-R 116 dans la même région et de L (leucine) au résidu 117. Sur certains variants trouvés chez le pigeon (PPMV-1), on a observé la séquence 112 G-R-Q-K-R-F 117, mais avec des indices élevés de pathogénicité intracérébrale. Ainsi, pour que le virus soit virulent pour les poulets, il apparaît nécessaire qu existe au moins une paire d'acides aminés basiques aux résidus 116 et 115, en plus d une phénylalanine au résidu 117 et d un acide aminé basique (R) au 113. Plusieurs études ont été réalisées à l'aide de techniques moléculaires pour déterminer la séquence du site de clivage de F0 en utilisant la transcription inverse couplée à une amplification en chaîne par polymérase (RT-PCR), soit sur le virus isolé, soit sur des tissus et des matières fécales provenant d'oiseaux infectés. Le produit a été soumis à une analyse par enzyme de restriction, à une hybridation par sonde ou à un séquençage nucléotidique, en vue d'établir un test in vitro de routine pour le contrôle de la virulence (voir la référence 2 pour une revue de la littérature). La détermination de la séquence de clivage de F0 peut donner 632 Manuel terrestre de l OIE 2008

5 une indication claire de la virulence du virus. Aussi, cette notion a-t-elle été intégrée à la définition de la MN (voir la Section B.1.f). Dans le diagnostic de la MN, la mise en évidence d'un virus comportant de multiples acides aminés basiques au site de clivage de F0 confirme la présence d'un virus virulent ou potentiellement virulent. Il est important de souligner en revanche qu il ne faut pas conclure à l'absence de virus virulent en cas de non détection du virus ou en cas de caractérisation d un virus de la MN dénué d'acides aminés basiques multiples au site de clivage de F0, à l'aide des techniques moléculaires. S il y a mésappariement de l amorce ou en présence d'une population mélangée de virus virulents et non virulents, il restera nécessaire d'isoler le virus et d en évaluer la virulence in vivo. Des analyses récentes sur des virus isolés en Irlande en 1990 ou trouvés lors des épisodes survenus en Australie depuis 1998, ont démontré que les virus virulents peuvent provenir de virus progéniteurs de faible virulence (5, 45). Des virus virulents de la MN ont également été générés expérimentalement à partir de virus de faible virulence par passage chez des poulets (39). f) Définition de la maladie de Newcastle Il semble probable que la grande majorité des oiseaux soient sensibles aux infections par les souches virales de la MN fortement ou faiblement virulentes pour les poulets. Les signes cliniques observés chez les oiseaux infectés par ces virus varient cependant considérablement et dépendent de facteurs tels que le virus, l'espèce hôte, l'âge de l'hôte, les infections par d'autres micro-organismes, les stress environnementaux et le statut immunitaire. Dans certaines circonstances, les infections par des virus extrêmement virulents peuvent se traduire par une mortalité massive soudaine, avec relativement peu de signes cliniques. Ainsi, les signes cliniques sont variables et dépendent d'autres facteurs, et aucune manifestation ne peut être considérée comme pathognomonique. Même chez les hôtes sensibles comme les poulets, le virus de la MN présente une très large fourchette de virulence. Généralement, les tests utilisés pour évaluer la virulence montrent un regroupement par «grappes» autour des deux extrêmes mais, pour toute une série de raisons, certains virus peuvent présenter une virulence intermédiaire. Compte tenu des variations considérables qui apparaissent au niveau de la virulence et des signes cliniques, il convient de définir soigneusement les éléments constitutifs de la MN pour les besoins des échanges commerciaux, des mesures de prophylaxie et des politiques réglementaires. La définition de la MN actuellement utilisée dans tous les États membres de l'union européenne est définie par la Directive 92/66/CEE (20). La définition utilisée par l'oie pour la déclaration des foyers de MN contient les éléments suivants : «La maladie de Newcastle est définie comme une infection des volailles causée par à un paramyxovirus aviaire de sérotype 1 (APMV-1), qui présente un des critères de virulence suivants : a. le virus possède un indice de pathogénicité intracérébrale (IPIC) d au moins 0,7 pour les poussins (Gallus gallus) d un jour, ou b. la présence de multiples acides aminés basiques a été démontrée (directement ou par déduction), au niveau de la fraction C-terminale de la protéine F2, ainsi que celle de la phénylalanine au niveau du résidu 117 de la fraction N-terminale de la protéine F1. L expression «multiples acides aminés basiques» se réfère à la présence d au moins trois acides aminés correspondant à l arginine ou à la lysine entre les résidus 113 et 116. En l absence de la démonstration de la présence de multiples acides aminés basiques tels que décrits ci-dessus, il convient de caractériser le virus isolé en déterminant l indice de pathogénicité intracérébrale. Dans cette définition, les résidus d acides aminés sont numérotés à partir de la fraction N-terminale de la séquence amino-acide déduite de la séquence nucléotidique du gène F0, et les résidus correspondent aux résidus 4 à 1 à partir du site de clivage.» g) Anticorps monoclonaux Des anticorps monoclonaux de souris dirigés contre des souches du virus de la MN ont été utilisés dans les tests d'inhibition de l'hémagglutination pour permettre une identification rapide du virus, en excluant les réactions croisées avec d'autres sérotypes de paramyxovirus aviaires, qui peuvent survenir avec du sérum polyclonal. Certains travaux ont permis de produire des anticorps monoclonaux donnant lieu, dans les tests d'inhibition de l'hémagglutination, à des réactions spécifiques de certaines souches particulières ou de certains variants du virus de la MN (6, 10). Manuel terrestre de l OIE

6 Des séries d'anticorps monoclonaux ont été utilisées pour établir les profils antigéniques des souches virales, sur la base de la présence ou de l'absence de réaction avec les virus. Cette méthode s est révélée intéressante pour classer et différencier les souches du virus de la MN, et elle a été particulièrement utile pour comprendre l'épidémiologie des foyers (10). h) Études phylogénétiques Les études phylogénétiques se sont multipliées au cours des dernières années en raison de l'amélioration des techniques de séquençage nucléotidique, du développement de bases de données informatisées précisant les séquences d un nombre croissant de virus et des travaux montrant que des séquences même relativement courtes pourraient donner des résultats significatifs dans les analyses phylogénétiques. Une diversité génétique considérable a été détectée, mais les virus partageant différentes caractéristiques temporelles, géographiques, antigéniques ou épidémiologiques tendent à faire partie de lignées ou de clades spécifiques, ce qui s'est révélé utile à l'évaluation aussi bien de l'épidémiologie mondiale que de la propagation locale de la maladie (4, 8, 19, 28, 32, 33, 38, 41, 43, 44). Alors que par le passé il était impossible de recourir aux analyses phylogénétiques comme à des outils de routine, les laboratoires ont aujourd hui plus largement accès aux kits sophistiqués commercialisés pour la RT-PCR ainsi qu aux séquenceurs automatiques, avec des résultats de plus en plus rapides. Les laboratoires sont ainsi beaucoup plus nombreux à pouvoir assurer ces études qui fournissent des données significatives en temps réel et non plus seulement a posteriori (2). Aldous et al. (4) ont proposé que le génotypage des souches de virus de la MN devienne partie intégrante du diagnostic et de la caractérisation pour les Laboratoires de référence en produisant une séquence du gène F de 375 nucléotides comprenant le site de clivage F0, et en comparant en routine les séquences obtenues avec d autres souches isolées et 18 virus représentatifs des lignées et des sous-lignées reconnues actuellement. Une telle analyse permettrait une estimation rapide de l origine et de l extension des virus responsables des foyers de MN. i) Techniques moléculaires utilisées pour le diagnostic Outre la RT-PCR et d'autres techniques analogues utilisées pour déterminer la virulence des souches du virus de la MN (voir la Section B.1.e) ou pour réaliser des études phylogénétiques (voir la Section B.1.h), plusieurs rapports ont fait état du recours croissant à ce type de techniques moléculaires pour déceler le virus dans les prélèvements cliniques. Ces approches présentent l'avantage de détecter le virus très rapidement. Les prélèvements cliniques doivent être soigneusement sélectionnés car certaines études ont montré un manque de sensibilité lors de la détection du virus dans certains organes et notamment dans les matières fécales (23, 25, 30). Les échantillons trachéaux ou oro-pharyngés sont souvent des échantillons de choix car ils sont facilement traités et contiennent, en général, peu de matériel organique qui pourrait interférer avec la détection et l amplification de l ARN par PCR. Cependant, des échantillons de tissus ou d organes, et même de matières fécales, ont été utilisés avec succès. Le procédé d extraction de l ARN peut aussi influencer le résultat de la RT-PCR sur des échantillons cliniques et, même avec des kits commerciaux, il convient de choisir avec soin le plus approprié pour l analyse des échantillons séléctionnés. En général, les systèmes de RT-PCR ont été utilisés pour amplifier une fraction spécifique du génome qui apporte une valeur supplémentaire comme, par exemple en amplifiant la partie du gène F qui comprend le site de clivage F0 ce qui permet d utiliser le produit d amplification pour évaluer la virulence (3, 14, 23, 25, 29, 37, 38). Le plus sérieux problème de l utilisation de la RT-PCR pour le diagnostic est la nécessité du traitement après amplification, en raison des risques élevés de la contamination au laboratoire ou des contaminations croisées entre échantillons. Le plus grand soin doit être apporté et un protocole très strict doit être suivi lors de la manipulation des échantillons (voir Chapitre , «Validation et contrôle qualité des méthodes d'amplification en chaîne par polymérase (PCR) utilisées pour le diagnostic des maladies infectieuses»). Comme pour la détermination de la virulence, il est important que ces techniques ne soient pas utilisées seules pour conclure à la négativité des recherches en cas de suspicion de la MN Une des stratégies possibles pour éviter le traitement après amplification est d utiliser des techniques de RT-PCR en temps réel. Ces techniques étant basées sur des sondes fluorogéniques ou des colorants fluorescents, le traitement après amplification n est plus nécessaire et le résultat peut alors être obtenu en moins de 3 h. La réussite la plus spectaculaire de l utilisation de la RT-PCR en temps réel a été aux États-Unis d Amérique pendant les foyers de MN de 2002 et 2003, quand l épreuve décrite par Wise et al. (46) a montré une sensibilité de 95 % lors de comparaison avec l isolement du virus sur plus de prélèvements. L épreuve comprend trois paires d amorces et de sondes qui sont utilisées dans des réactions séparées : une paire amorce/sonde de matrice qui est prévue pour détecter la plupart des sondes de virus de la MN, une paire d amorce/sonde de fusion qui peut identifier les souches virulentes (y compris beaucoup de virus PPMV-1) et une paire d amorce/sonde pour la détection des souches faiblement virulentes. Les échantillons sont d abord criblés avec les amorces/sondes de matrice. Les échantillons positifs sont par la suite testés avec les autres paires d amorces/sondes (pour les souches très ou 634 Manuel terrestre de l OIE 2008

7 faiblement virulentes) pour confirmer la présence de virus fortement ou faiblement virulents. Les amorces et les sondes décrites ont été validées sur les souches lentogènes, mésogènes et vélogènes qui ont circulé aux États-Unis. Au pic de l épizootie, entre et échantillons furent testés tous les jours par RT-PCR. Un inconvénient de la RT-PCR en temps réel est qu actuellement des thermocycleurs spéciaux sont nécessaires ; ces appareils sont extrêmement coûteux, ce qui pourrait empêcher de nombreux laboratoires d employer cette épreuve. Bien que la grande majorité des souches isolées sont génétiquement apparentées, un autre problème important est que certaines souches se sont révélées génétiquement distinctes. Par exemple, certains virus qui avaient été classés dans le génogroupe 6 par Aldous et al. (4) puis dans la Classe I par Czegledi et al. (24) sont si différents des autres souches isolées, par ex. les virus de Classe II (24), que des amorces différentes sont nécessaires pour leur détection par RT-PCR. Comme pour la détermination de la virulence, il importe que les techniques de PCR ne soient pas utilisées seules lors de résultat négatif sur des foyers suspects de MN. 2. Épreuves sérologiques Le virus de la MN peut être utilisé comme antigène dans toute une série de tests sérologiques, ce qui permet d'utiliser la technique de neutralisation, la méthode immuno-enzymatique ELISA ou l inhibition de l hémagglutination (IHA) pour estimer les taux d anticorps chez les oiseaux. C est l'épreuve d'inhibition de l'hémagglutination qui est aujourd'hui la plus largement utilisée, bien que de nombreux élevages de volailles utilisent des kits ELISA commercialisés pour évaluer les anticorps après vaccination. a) Épreuves d hémagglutination et d'inhibition de l'hémagglutination Avec cette méthode, les sérums de poulet donnent rarement des réactions positives non spécifiques, de sorte qu'il est inutile de prétraiter les sérums. Les sérums provenant d'autres espèces que le poulet peuvent parfois provoquer une agglutination des érythrocytes de poulet. Aussi, cette réaction doit-elle être recherchée avant l'épreuve et supprimée, s il y a lieu, par adsorption du sérum avec des érythrocytes de poulet. La technique consiste à ajouter 0,025 ml d un culot d érythrocytes de poulet à chaque volume de 0,5 ml d antisérum, à agiter doucement et à laisser reposer pendant au moins 30 min. Un culot de centrifugation est alors préparé à 800 g pendant 2 à 5 min puis les sérums adsorbés sont mis à décanter. Des variantes pour les méthodes utilisées pour la recherche de l activité hémagglutinante et pour l épreuve d'inhibition de l'hémagglutination existent entre les laboratoires. Les exemples recommandés ci-après correspondent à l'utilisation de plaques en matière plastique à micropuits, munies d un fond en V, dans lesquelles le volume final pour les deux types de tests est de 0,075 ml. Les réactifs nécessaires pour ces épreuves sont du tampon PBS isotonique (0,01 M), de ph 7,0-7,2, et des érythrocytes prélevés au minimum sur trois poulets indemnes d organismes pathogènes spécifiques, et réunis dans un volume égal de solution d Alsever (s'il n'est pas possible de disposer de poulets indemnes d organismes pathogènes spécifiques, le sang peut être prélevé chez des individus non vaccinés, surveillés régulièrement et non porteurs d'anticorps dirigés contre le virus de la MN). Les globules rouges doivent être lavés à trois reprises dans du tampon PBS avant d'être utilisés sous forme de suspension à 1 % (volume globulaire/volume total). Des antigènes et antisérums témoins positif et négatif appropriés doivent être utilisés pour chaque analyse. Épreuve d hémagglutination i) Verser 0,025 ml de tampon PBS dans chacun des puits d une plaque de microtitrage en matière plastique, munie d un fond en V. ii) iii) iv) Ajouter 0,025 ml de la suspension virale (liquide allantoïque infectieux ou inactivé) dans le premier puits. Afin de déterminer avec exactitude la teneur en hémagglutinine, cette étape doit être effectuée à partir d'une fourchette étroite de dilutions initiales (1/3, 1/5, 1/7, etc. par exemple). Des dilutions au demi de volumes de 0,025 ml de la suspension virale sont effectuées sur l ensemble de la plaque. Un volume supplémentaire de 0,025 ml de tampon PBS est ajouté à chaque puits. v) Un volume de 0,025 ml de suspension d érythrocytes de poulet à 1 % (v/v) est ajouté à chaque puits. vi) La solution est mélangée en tapotant doucement la plaque. On laisse ensuite se déposer les érythrocytes pendant 40 min à température ambiante (c'est-à-dire à environ 20 C), ou pendant 60 min à 4 C si la température ambiante est élevée ; les érythrocytes témoins doivent alors former un bouton distinct. Manuel terrestre de l OIE

8 vii) La lecture de l activité hémagglutinante est effectuée en inclinant la plaque et en recherchant la présence ou l'absence d un flux d érythrocytes en forme de larme. Le titre doit être lu à la dilution la plus élevée produisant une activité hémagglutinante complète (pas de flux) ; cette valeur représente 1 unité hémagglutinante et peut être calculée avec précision à partir de la fourchette initiale de dilutions. Inhibition de l hémagglutination i) Verser 0,025 de tampon PBS dans chacun des puits d une plaque de microtitrage en matière plastique, munie d un fond en V. ii) iii) iv) Ajouter 0,025 ml de sérum dans le premier puits de la plaque. Des dilutions au demi de volumes de 0,025 ml du sérum sont effectuées sur l ensemble de la plaque. 4 unités hémagglutinantes de virus ou d antigène dans 0,025 ml sont ajoutées à chaque puits et la plaque est laissée pendant au moins 30 min à température ambiante, c'est-à-dire à environ 20 C, ou pendant 60 min à 4 C. v) On ajoute 0,025 ml de suspension d érythrocytes de poulet à 1 % (v/v) dans chaque puits et, après avoir mélangé doucement, on laisse décanter les érythrocytes pendant 40 min à température ambiante (c'est-à-dire à environ 20 C), ou pendant environ 60 min à 4 C si la température ambiante est élevée ; les érythrocytes témoins doivent alors former un bouton distinct. vi) vii) Le titre d'inhibition de l'hémagglutination est la dilution sérique la plus poussée qui provoque une inhibition complète de 4 unités hémagglutinantes d'antigène. L'agglutination est évaluée en inclinant les plaques. Seuls les puits dans lesquels les érythrocytes s écoulent au même rythme que dans les puits témoins (contenant seulement 0,025 ml d érythrocytes et 0,05 ml de PBS) doivent être considérés comme présentant une inhibition. La validité des résultats doit être évaluée par rapport à un sérum témoin négatif, ce qui ne devrait pas donner un titre >1/4 (>2 2 ou >log 2 2 en valeur inverse), et par rapport à un sérum témoin positif pour lequel le titre ne devrait pas s'écarter de plus d'une dilution du titre connu. La valeur des épreuves sérologiques dans le diagnostic est clairement liée au statut immunitaire escompté des oiseaux touchés. Les titres d inhibition de l'hémagglutination peuvent être considérés comme positifs si une inhibition est obtenue avec une dilution sérique de 1/16 (2 4 ou log 2 4 en valeur inverse) ou davantage en présence de 4 unités hémagglutinantes d'antigène. Certains laboratoires préfèrent utiliser 8 unités hémagglutinantes dans les tests d'inhibition de l'hémagglutination. Si cette valeur est autorisée, elle influe sur l'interprétation des résultats, de sorte qu'un titre est alors positif à partir de 1/8 (2 3 ou log 2 3). Le titrage inverse de l'antigène doit être inclus dans toutes les épreuves pour vérifier le nombre d'unités hémagglutinantes utilisées. Les titres d'inhibition de l'hémagglutination peuvent servir à évaluer le statut immunitaire d'un élevage. Dans les élevages vaccinés soumis à une surveillance sérologique, il est possible d'identifier des réponses anamnestiques après une épreuve virulente utilisant des souches de terrain (13). Il faut toutefois rester très prudent car des variations dues à d'autres causes peuvent survenir. Il a ainsi été montré que les infections par le virus APMV-3 chez des dindons vaccinés contre la MN entraînent un accroissement substantiel des titres spécifiques du virus de la maladie (11). b) Epreuve immuno-enzymatique Toute une série de kits ELISA sont actuellement commercialisés. Ils reposent sur plusieurs stratégies différentes pour la détection des anticorps dirigés contre le virus de la MN, y compris les techniques indirectes, sandwich et bloquantes ou compétitives avec anticorps monoclonaux. L un des kits au moins fait appel à un antigène sous-unitaire. Ces tests ont généralement été évalués et validés par le fabricant et il est donc essentiel que les instructions d'utilisation soient soigneusement respectées. Les épreuves d inhibition de l hémagglutination et les tests ELISA reconnaissent des anticorps dirigés contre différents antigènes ; selon le système utilisé, les tests ELISA peuvent détecter des anticorps dirigés contre plus d un antigène, tandis que l inhibition de l hémagglutination est probablement limitée à ceux qui sont dirigés contre la protéine HN. Cependant, des études comparatives ont démontré que les tests ELISA sont reproductibles et ont une sensibilité et une spécificité élevées ; leur corrélation avec les épreuves d inhibition de l hémagglutination est bonne (1). Les tests ELISA conventionnels présentent l inconvénient de nécessiter une validation du test pour chacune des espèces d oiseaux pour lesquelles elles sont destinées. Les tests ELISA de compétition utilisent, en général, des anticorps monoclonaux qui en raison de leur spécificité pour un seul épitope, peuvent ne pas reconnaître toutes les souches d APMV Manuel terrestre de l OIE 2008

9 C. SPÉCIFICATIONS APPLICABLES AUX VACCINS ET AUX PRODUITS BIOLOGIQUES À USAGE DIAGNOSTIQUE Une description détaillée de tous les aspects des vaccins préparés à partir du virus de la MN, y compris leur production et leur utilisation, a été publiée (13). Il convient de s'y référer pour obtenir des informations détaillées sur les procédures présentées ici. Des lignes directrices sur la production des vaccins vétérinaires figurent dans le Chapitre , «Principes de fabrication des vaccins vétérinaires». Les lignes directrices fournies ici et dans le Chapitre sont de type général et peuvent être complétées par des spécifications nationales et régionales. La présente section traite des vaccins vivants et inactivés classiques car ceux-ci sont toujours utilisés universellement. Il faut cependant rappeler que de nombreux travaux récents ont été consacrés à l'application des techniques de biologie moléculaire pour la production de nouveaux vaccins. Des résultats intéressants ont permis d'obtenir une protection immunitaire en utilisant le virus recombiné de la variole aviaire, le virus de la vaccine, le virus de la variole du pigeon, l'herpèsvirus du dindon et des cellules aviaires dans lesquelles sont exprimés le gène HN et/ou le gène F du virus de la MN. L'emploi de plusieurs de ces virus recombinés a été autorisé dans certains pays. Les souches du virus de la MN utilisées dans les vaccins à virus vivants commercialisés se répartissent en deux groupes : vaccins lentogènes tels que Hitchner-B 1, La Sota, V4, NDW, I2 et F, et vaccins mésogènes tels que Roakin, Mukteswar et Komarov. Des souches appartenant à ces deux groupes ont été soumises à sélection et clonage pour remplir différents critères de production et d'application. Tous les virus vaccinaux mésogènes possèdent deux paires d'acides aminés basiques au site de clivage de F0 et des indices de pathogénicité intracérébrale de l'ordre de 1,4. Il en résulte que la contamination d'oiseaux par ces virus entrerait dans la définition de la MN (Section B.1.f) mais, comme ces vaccins sont principalement utilisés dans des pays où la maladie est enzootique, cela n'interdit pas nécessairement leur utilisation. Certains pays ont décidé que seulement des souches lentogènes de virus peuvent être utilisées pour les vaccins (42). Les unités de production de vaccin doivent fonctionner avec les procédures et les pratiques de sécurité biologique qui conviennent. Si des virus de la MN, telle que définie dans la Section B.1.f de ce chapitre, sont utilisés pour produire des vaccins ou les contrôler par des épreuves virulentes, la partie des installations où ces opérations sont effectuées doit répondre aux exigences de niveau 4 applicables au confinement des agents pathogènes, comme indiqué dans le Chapitre du présent Manuel terrestre. Pour produire des vaccins à virus vivant, la multiplication du virus est généralement effectuée dans la cavité allantoïque d œufs de poule embryonnés, mais certaines souches, et notamment des souches mésogènes, ont été adaptées à différents systèmes de culture tissulaires. Les vaccins à virus vivants peuvent être administrés aux oiseaux par incorporation dans l'eau de boisson, sous forme de pulvérisation à grosses gouttes ou par instillation intranasale ou conjonctivale. Un vaccin à virus lentogène pour utilisation in ovo a été mis sur le marché aux États-Unis d Amérique. Certaines souches mésogènes sont administrées par inoculation intradermique dans la membrane alaire. Les vaccins ont été conçus pour donner des résultats optimaux lorsqu'ils sont administrés par des voies spécifiques. En règle générale, les vaccins vivants les plus immunogènes sont les plus virulents, et par conséquent les plus susceptibles de provoquer des effets indésirables. Ainsi, la vaccination avec la souche La Sota peut donner des problèmes beaucoup plus importants chez les jeunes oiseaux sensibles que la souche Hitchner-B 1, mais la première induit une réponse immunitaire plus marquée. Les vaccins inactivés sont nettement plus onéreux que les vaccins vivants et leur utilisation entraîne la manipulation individuelle des oiseaux pour l injection. Ils sont préparés à partir de liquide allantoïque dont le pouvoir infectieux a été inactivé par addition de formol ou de bêta-propiolactone. Ces vaccins sont présentés en émulsion dans de l huile minérale et administrés par voie intramusculaire ou sous-cutanée. Chaque oiseau reçoit ainsi individuellement une dose de référence. Il n en résulte pas de propagation du virus ni de réaction respiratoire. Des souches virulentes et des souches non virulentes sont utilisées comme semences virales, mais les souches non virulentes paraissent préférables au plan de la sécurité d'emploi. Étant donné qu'aucune multiplication du virus n'intervient après l'administration, la quantité d'antigène requise pour obtenir l'immunisation voulue est beaucoup plus importante qu avec les vaccins à virus vivant. Il est important d'obtenir un rendement viral élevé pour produire un vaccin puissant, et la souche Ulster 2C convient très bien à cet effet. La durée de l'immunité dépend du programme de vaccination choisi. L une des considérations les plus importantes concernant les programmes de vaccination est le niveau d'immunité maternelle qui existe chez les jeunes poulets et qui peut varier considérablement d'une exploitation à l'autre, d'un lot à l'autre et d'un sujet à l'autre. C est pourquoi l'on a recours à l'une des deux stratégies suivantes : les oiseaux ne sont vaccinés qu'à l'âge de 2 à 4 semaines, au moment où la plupart sont sensibles, ou bien ils sont vaccinés à l'âge d'un jour par instillation conjonctivale ou par application d'une pulvérisation à grosses gouttes. Il en résulte une infection active chez certains oiseaux, qui persistera jusqu'à la disparition de l'immunité maternelle. Une revaccination est Manuel terrestre de l OIE

10 pratiquée 3 à 4 semaines plus tard. Il a été démontré que les vaccins inactivés peuvent également être intéressants pour vacciner les poussins d'un jour présentant un certain degré d'immunité maternelle (17). L association d un vaccin vivant et d un vaccin inactivé chez les poussins d'un jour présentant une immunité maternelle a donné des résultats supérieurs à l'administration de l un ou l autre de ces vaccins utilisés séparément (16). La vaccination d oiseaux d'un jour totalement sensibles, même avec le plus atténué des vaccins vivants, peut entraîner une maladie respiratoire, surtout en présence de bactéries pathogènes courantes en quantités significatives. Seules les poules reproductrices et pondeuses sont normalement vaccinées après l'âge de 3 semaines. La vaccination doit être renouvelée à intervalles suffisamment fréquents pour maintenir une immunité adaptée. Les programmes de vaccination font souvent appel à des vaccins à virus vivants légèrement plus pathogènes pour les rappels que pour la vaccination initiale. Ces vaccins vivants plus pathogènes peuvent également être utilisés après une vaccination initiale avec des vaccins inactivés présentés sous forme d émulsion huileuse. La conception d'un programme de vaccination doit tenir compte du type de vaccin utilisé, du statut immunitaire et sanitaire des oiseaux à vacciner ainsi que du niveau de protection requis vis-à-vis de toute possibilité d'infection par des souches de terrain dans les conditions locales (13). Deux exemples de programmes de vaccination pouvant être utilisés dans différentes circonstances sanitaires sont détaillés ici. Dans le premier exemple, lorsque la maladie est discrète et sporadique, il est suggéré d'adopter l'ordre de vaccination suivant : Hitchner-B 1 vivant par administration conjonctivale ou en pulvérisation à l'âge d'un jour ; Hitchner-B 1 ou La Sota vivant à l âge 18 à 21 jours, administré dans l'eau de boisson ; La Sota vivant administré dans l'eau de boisson à l'âge de 10 semaines, puis un vaccin inactivé en émulsion huileuse au moment de la ponte. Dans le second exemple, lorsque la maladie est sévère et plus répandue, le même protocole est adopté jusqu'à l'âge de 21 jours, puis il est suivi d'une revaccination à l'âge de 35 à 42 jours avec le vaccin La Sota vivant administré dans l'eau de boisson ou sous forme d'un aérosol. Cette revaccination est répétée à l âge de 10 semaines où l'on administre un vaccin inactivé (ou un vaccin vivant mésogène) et renouvelée au moment de la ponte (13). 1. Gestion des semences virales a) Caractéristiques de la semence virale La première considération dans le choix d une souche destinée à produire un vaccin à partir du virus vivant de la MN est son utilisation comme vaccin primaire ou secondaire, et avant tout son pouvoir pathogène. Les méthodes d'administration et la fréquence d'utilisation sont aussi des facteurs à prendre en compte. Le recours aux anticorps monoclonaux a révélé une variation considérable de l antigénicité des différentes souches (10). Lors de la conception des vaccins, il pourrait donc s avérer nécessaire d'accorder une plus grande attention à leur relation antigénique avec les virus prévalents sur le terrain. Un vaccin vivant reposant sur la souche V4 du virus de la MN, sélectionné pour sa stabilité à la chaleur, a été introduit pour lutter contre les problèmes spécifiques liés aux poulets élevés en liberté dans les villages des pays en développement. Le but est d utiliser ce vaccin pour enrober les aliments distribués à ces poulets. Les études réalisées à ce jour dans différents pays ont fourni des résultats variables, ce qui peut s'expliquer par le fait que les facteurs locaux sont extrêmement importants pour la réussite de cette stratégie (40). Plus récemment, le vaccin thermostable 12 a été développé spécifiquement pour vacciner les poulets élevés dans les villages. Il est actuellement recommandé d'administrer ce vaccin sous forme de collyre (9). L'usage des vaccins vivants peut être restreint par la législation. Ainsi, la Décision 93/152/EEC de la Commission (21) a restreint l'usage des vaccins dans les États membres de l'union européenne depuis le 1 er janvier 1995 à ceux dont la semence primaire a été contrôlée et présente un indice de pathogénicité intracérébrale < 0,4 si au moins 10 7 doses infectantes moyennes pour l œuf (DIO 50 ) sont administrées individuellement, ou < 0,5 si au moins 10 8 DIO 50 sont administrées individuellement. De même, la Commission des normes de l'oie considère que si les vaccins doivent en principe présenter un indice de pathogénicité intracérébrale < 0,7, une marge de sécurité doit être prévue pour tenir compte de la variabilité entre les essais et entre les laboratoires, de sorte que les souches virales utilisées pour la semence primaire ne doivent pas avoir un indice supérieur à 0,4 (35). Le facteur essentiel pour sélectionner une semence destinée à la préparation d'un vaccin inactivé est la quantité d'antigène produite lors d'une culture sur œufs embryonnés. Il est rarement rentable de concentrer les virus. Des souches virulentes et des souches lentogènes ont été utilisées comme vaccins inactivés, mais les premières sont associées à des risques inutiles car elles impliquent la manipulation de grandes quantités de virus virulents. Elles peuvent être insuffisamment inactivées et risquent de donner lieu à des contaminations ultérieures. Ce risque est reflété par la Décision 93/152/CEE de la Commission (21) qui a restreint l'usage des virus utilisés pour la préparation des vaccins inactivés dans les États membres de l'union européenne depuis le 1 er janvier 1995 à ceux dont la semence primaire présente un indice de pathogénicité intracérébrale < 0,7 si au moins 10 8 DIO 50 sont administrées à chaque individu. Certaines souches lentogènes atteignent des titres très élevés dans les œufs. Des titres exceptionnellement élevés 638 Manuel terrestre de l OIE 2008