Informatique et biologie moléculaire
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- Adam Lamontagne
- il y a 7 ans
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1 UE 1B-biomolécules, génome, bioénergétique, métabolisme, méthodes d étude et analyse du génome II-le génome : sa structure, son expression Organisation, évolution et fonction du génome humain Approches pan-génomiques Bio-informatique PACES Pr Nicolas SEVENET Informatique et biologie moléculaire Avertissement Utilisation par le biologiste de l outil informatique Bases/banques de données Définition Développement des outils informatiques (science de l information) Permettant d extraire une signification biologique de résultats expérimentaux (science du vivant) Paradoxe Avec le développement des techniques pan-génomiques, le biologiste n est plus capable d interpréter seul le résultat de ses expériences (microarrays, NGS) 1
2 Les 2 sites de bioinformatique les plus importants au monde EBI (EMBL) European Bioinformatics Institute Cambridge, UK out_ebi/about_ebi.html NCBI National Center for Biotechnology Information, National Library of medicine, National Institutes of Health Bethesda, MD, USA Trier l information Masse de l information Retrouver des informations stockées en banque de données (interrogation (requête), soumission, maintenance) Dry lab (biologie sèche) Les banques de données en ligne les compilateurs de bases de données (méta-moteur; méta-banques de données) Entrez NCBI Genecards Genome Browser Le site de recherche bibliographique PubMed Les sites de données spécialisés Séquences des gènes (Refseq, GenBank) Variations polymorphes de l ADN (dbsnp) Séquences et fonctions des protéines (UniProt) 2
3 Listing des banques de données Pendant ce cours Générer l information : bio-informatique liée au NGS Analyses Fichiers de sortie Interprétation des résultats Stocker l information : Banques de données Diverses Objectif et utilisation respectifs Exemples Utiliser une information Trouver une séquence de référence Connaître la structure intron-exon d un gène Dessiner des oligonucléotides de PCR (amorces/primers) 3
4 Générer l information BIOINFORMATIQUE LIÉE AU NGS Enchaînement des étapes Item Analyse primaire Analyse secondaire Analyse tertiaire Visualisation PGM Ion torrent Life technologies Fichiers sortie de run.dat.cel Fichiers de séquence (base calling + Phred score) Alignement sur le génome de référence (par exemple BWA Picard tools) Détection des variants (par rapport au génome de référence) Annotation des variants SFF Fastq MiSeq Illumina Fastq Sam (Sequence Alignment/map) puis bam (format compressé binaire du précédent) Vcf (variant call format) Par exemple VEP (Variant Effect Predictor) ANNOVAR Par exemple IGV (Integrative Genome Viewer) Alamut (Interactive Biosoftware) 4
5 Stocker l information MÉTA-BANQUES DE DONNÉES Gène Le fil rouge du cours : RB1 RB1 : RetinoBlastoma 1 Code une protéine impliquée dans le contrôle du cycle cellulaire (entrée en phase S après la phase G1) Retrouvé muté dans les rétinoblastomes (tumeurs oculaires de l enfant) certains sarcomes 5
6 Diapo 40 cours UE2 JB Corcuff contrôle moléculaire du cycle cellulaire, contrôle de la transition G1/S Entrez NCBI 6
7 Contenu Les banques de données universelles en génétique Génome Gène, localisation chromosomique, séquence génomique Transcrits Protéine description localisation Anticorps Fonctions, voies fonctionnelles, classification «ontologique» Dysfonction, pathologies Références bibliographiques Genecards 7
8 UCSC Genome Browser Outil de cartographie du génome Rentrer RB1 dans cette fenêtre UCSC Genome Browser Fenêtre de localisation du gène demandé (RB1) Exons 8
9 BIBLIOGRAPHIE PubMed 9
10 Les publications sont classées en ordre décroissant de leur date de sortie (les plus récentes en premier (haut de liste)) SITES SPÉCIALISÉS 10
11 Nucléotides Banques de données primaires 3 dans le monde DDBJ (Japon) European Nucleotide Archive (Europe) GenBank (NCBI, USA) Banque de données spécialisées RefSeq (NCBI) fournir, à une position nucléotidique couverte par plusieurs séquences primaires, un identifiant unique Genatlas (France) structure intron-exon d un gène European Nucleotide Archive 11
12 dbsnp Banque de données de polymorphismes Polymorphisme définition Le polymorphisme correspond à une variation d une à quelques bases de l ADN sans retentissement sur la structure, la fonction ou l expression de la protéine Définit un allèle (version alternative d un gène) Polymorphisme simple de nucléotide (Single Nucleotide Polymorphism) Seul un nucléotide varie à une position donnée Exon 4 gène RB1 Rentrer RB1 dans cette fenêtre 12
13 Résultats SNP RB1 Protéines - UniProt Rentrer RB1 dans cette fenêtre 13
14 RB1 Uniprot Quelle protéine de référence choisir? retour à genecards 14
15 Genecards permet de choisir la bonne référence protéique Fiche Uniprot RB1 15
16 Objectif : Banques de dépôt Déposer le résultat d expériences D autres équipes peuvent alors les télécharger et traiter avec leurs outils ce résultat partage Partage de données et comparaison validation in silico 2 bases essentiellement GEO (Gene Expression Omnibus) Array-express Rentrer RB1 dans cette fenêtre 16
17 Résultat requête RB1 La plateforme où a été faite l expérimentation (biopuce) Le code de la série expérimentale pour le sujet donné (biopuces) Les résultats de chaque manip d hybridation Utiliser l information APPLICATIONS PRATIQUES 17
18 ADN Que faire? Trouver une séquence de référence RefSeq Connaître la structure intron-exon d un gène Genatlas Dessiner des amorces de PCR Primer 3 Pathologies Savoir si un gène est muté dans certaines pathologies COSMIC : Catalogue Of Somatic Mutation in Cancer OMIM : Online Mendelian Inheritance in Men Savoir qui, en France, peut prendre en charge une pathologie rare, ou le diagnostic mutationnel d un gène? Orphanet : portail des maladies orphelines Trouver la séquence de référence d un gène? Etape 1 : RefSeq (NCBI) Etape 2 Search : NUCLEOTIDE et nom du gène 959 résultats! 18
19 Trouver la séquence de référence d un gène? Restreindre à - Homo Sapiens (167) - Refseq (227) - 37 séquences Tri par accession number Contigs : ensemble de séquences assemblées, localisées sur le chromosome, qui ont servir à déduire la RefSeq RefSeq génomique Gènes comprenant RB1 dans leur titre mais n ayant rien à voir avec RB1 RefSeq ARN messager 19
20 Connaître l organisation intron/exon d un gène?? Geneatlas Puis Rentrer RB1 dans Symbol Name 20
21 Cliquer sur see the exons Codage des RefSeq et longueur des fragments des RefSeq Intron-exons : L ADN intronique est en bleu et minuscules, la séquence exonique en noir et majuscules (noir caractères gras = séquence codante) 21
22 Trouver des amorces de PCR??? Objectif : cribler et/ou séquencer un gène (un exon) à la recherche de mutations ponctuelles délétères (diagnostic mutationnel/biologique) Rechercher des amorces déjà publiées PubMed avec comme mot d entrée, le nom du gène Créer de nouvelles amorces in silico Primer3 Les primers créés sont-ils spécifiques? Alignement de séquences (Blast) Permet de voir si les séquences retrouvées par Blast après alignement des primers sont réellement spécifiques Matrice + Thermocycleur 22
23 Départ 1 copie de l exon 1 du gène b Après 1 cycle copies (2 1 ) Après 2 cycles 4 copies (2 2 ) zone amplifiée Après 3 cycles Après n cycles 8 copies (2 3 ) 2 n copies 23
24 Exemple primer 3 On copie la séquence de l exon 4 avec les séquences introniques adjacentes Des symboles <> sont placés de part et d autre de la séquence exonique (en majuscule) pour interdire que les primers soient dans cette zone (qu on voudra analyser après PCR) Résultats primer 3 Primer forward La séquence qui avait été encadrée de <> est marquée de X symbolisant une zone d exclusion de choix de primers Primer reverse 24
25 Alamut La représentation du gène dans sa totalité La séquence nucléotidique avec le dénombrement des nucléotides depuis le A de l ATG (base 1) RB1 exon 4 La traduction protéique avec le dénombrement des codons (AA) depuis le 1 er (ATG = Met) Les polymorphismes connus Les mutations délétères rapportées dans les bases de données La conservation phylogénétique 25
26 Les séquences introniques encadrant l exon 4 de RB1 Intron 3 Intron 4 Blast Vérification Comparaison de séquences Principe Exemple d utilisation Aligner la séquence de chacun des primers afin de voir si la bonne séquence nucléotidique est retrouvée. Adresse du site internet 26
27 On copie la séquence du primer forward dans la fenêtre de requête Blast en cours 27
28 Résultat 1 ère requête Blast Code couleur des scores d alignement Le classement se fait par ordre décroissant de similarité (score d alignement) Suite résultats Blast 28
29 Blast primer reverse GenBank RB1 Primer forward Primer reverse 29
30 Catalogue des mutations du gène RB1 /genetics/cgp/cosmic/ Rentrer RB1 dans cette fenêtre Résultat requête RB1 Cliquer sur RB1 30
31 Résultat requête RB1 La répartition des mutations le long de la séquence codante de RB1 Répartition des mutations RB1 dans les cancers humains Quelles sont les mutations contenues dans l exon 4 de RB1? Comme on connaît les AA de l exon 4 fenêtre de recherche limitée aux AA 127 à 167 inclus 31
32 Pathologies liées à RB1 Online Mendelian Inheritance in Men (OMIM) Rentrer RB1 dans cette fenêtre 32
33 Résultat requête RB1 Cliquer sur RB1 TEXT Cloning Gene structure Mapping Gene Function Evolution Molecular Genetics Retinoblastoma Small Cell Lung cancer Allelic variants (28) Rapporte certaines mutations remarquables References (80) Contributors Creation date Edit history (de la fiche!) 33
34 Trouver une consultation en Europe concernant le rétinoblastome consor4.01/www/cgibin/index.php?lng=fr Rentrer RB1 dans cette fenêtre 34
35 Trouver une consultation en Europe concernant le rétinoblastome consor4.01/www/cgibin/index.php?lng=fr Rentrer Rétinoblastome dans cette fenêtre Cliquer sur Rétinoblastome 35
36 Cliquer sur «centres experts», sélectionner «France» puis «consultations et conseil génétique» Aquitaine - rétinoblastome Pas de consultation spécialisée, mais 5 consultations de conseil génétique 36
37 Que retenir du cours? Les grandes voies de recherche d information Bibliographie ADN protéines Applications pratiques quel site permet de trouver quelle information? Les principes sous-jacents des banques lorsqu ils sont énoncés Les noms généraux des sites (ex : Pubmed, OMIM,.) Ne pas retenir les détails Pour chaque site internet concernant la requête précise RB1 Les adresses internet! 37
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