La spectrométrie de masse : Une technique d étude structurale des protéines

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1 1 La spectrométrie de masse : Une technique d étude structurale des protéines Cours 2013 L2 Régine Lebrun rlebrun@imm.cnrs.fr Plate-forme Protéomique de l Institut de Microbiologie de la Méditerranée FR3479 CNRS-AMU

2 2 Plan du cours sur La Spectrométrie de Masse Introduction : quelques définitions Chapitre I : Principes 1.1 Schéma du spectromètre de masse : source-analyseur-détecteur 1.2 L ionisation dans la Source l ionisation chimique (IC) Désorption-Ionisation Laser Assistée par Matrice (MALDI) l électronébulisation (ESI) 1.3 Les analyseurs à temps de vol (TOF) quadripolaire (Q) et trappe à ions (IT) 1.4 L analyse MS et la fragmentation MS/MS 1.5 Couplage Chromatographie Spectromètre de masse

3 3 Plan du cours sur La Spectrométrie de Masse Chapitre II: Applications aux peptides, aux protéines et au protéome 2.1. Caractérisation physico-chimique par la masse globale contrôle de l intégrité de protéine interactions protéine-ligand modifications post-traductionnelles interactions protéine-protéine: oligomérisation /stoechiométrie 2.2. Identification de protéines : Protéomique Descriptive quelques définitions séparation par Electrophorèse 2D principe et ex de «peptide mass fingerprint» exploitation de la fragmentation MS/MS de la protéine au Protéome 2.3. Quantification de protéines : Protéomique Quantitative quantification relative quantification absolue quantification «label free»

4 4 Introduction : quelques définitions Les molécules biologiques sont composées essentiellement de: Carbone : C Hydrogène : H Oxygène : O Azote : N Phosphore : P Souffre : S A chacun de ces nucléides correspond une masse atomique. Connaissant la formule brute d une molécule, on peut donc calculer une masse chimique. Par exemple, l alanine (CH 3 CHCO 2 HNH 2 ), soit C 3 H 7 N0 2 = (3x12,01115)+(7x1,00797)+(1x14,0067)+(2x15,9994) =89,09474 Da L unité de masse (u) est appelée dalton (Da) pour une masse chimique. Elle est définie comme 1/12 de la masse d un atome de carbone 12 : 1u =1Da = 1,660540x kg

5 5 Introduction : quelques définitions La spectrométrie de masse est une technique d'analyse physico-chimique permettant de détecter, d'identifier et de quantifier des molécules d intérêt par mesure de leur masse Son principe réside dans la séparation en phase gazeuse de molécules chargées (ions) en fonction de leur rapport masse/charge (m/z). De plus, la spectrométrie de masse permet de caractériser la structure chimique des molécules en les fragmentant. + + Champ électromagnétique Rapport masse/charge Rapport poids/puissance

6 6 Chapitre I : Principes

7 7 1.1 Schéma du spectromètre de masse : source-analyseur-détecteur Source d ions Analyseur en masse m/z Détecteur Traitement du signal Production d ions en phase gazeuse Séparation des ions produits en fonction du rapport m/z Conversion d un courant ionique en courant électrique Représentation des données dans un spectre de masse

8 8 1.2 L ionisation dans la Source : Les différentes sources Production d ions en phase gazeuse Molécules volatiles Chauffage et introduction du gaz L ionisation chimique Phase solide (microcristaux) Impact laser Désorption/Ionisation Laser Assistée par Matrice Molécules non volatiles Phase liquide Dispersion en microgouttelettes sous haute tension Electronébulisation

9 9 1.2 L ionisation dans la source L ionisation chimique s adresse à des composés volatils, apolaires et stables à la chaleur CH 4 (méthane) en large excès e - électron de haute énergie M (analyte) Une molécule de méthane qui reçoit l impact d un électron à haute énergie émis par un filament chauffé à haute température va subir l arrachage d un électron pour donner un ion radicalaire chargé positivement (CH 4 +. ). Il s ensuit une réaction qui donne naissance à des ions CH 5 + pouvant réagir avec les molécules d'analyte (M) arrivant dans la source. Ce type de réactions ions-molécules produit principalement des ions [MH] + et [MCH 4 ] +.. D autres gaz d ionisation chimique peuvent être utilisés, tels que l'isobutane et l'ammoniac.

10 L ionisation Désorption/Ionisation Laser Assistée par Matrice (MALDI) s adresse aux molécules polaires, peu volatiles comme peptides/protéines Laser Matrices: ac. α- cyanocinnamique, sinapinique, 2,5- dihydroxybenzoïque, etc Désorption L analyte M est dispersé dans une solution saturée de petites molécules aromatiques (matrice) et l ensemble est co-cristallisé par évaporation du solvant. Le dépôt solide obtenu est irradié par un laser de longueur d onde où les molécules de matrice ont une forte absorption. Il en résulte la désorption des ions formés par transfert de proton (H+) entre la matrice photoexcitée et l analyte M: [MH]+. *Matrix Assisted Laser Desorption Ionization

11 11 Débits 1-10 µl/min nl/min 1.2 L ionisation Electronébulisation (ESI) L électrospray est produit par application d un fort champs électrique sur un liquide contenant l analyte M traversant un capillaire. Ce champs provoque une accumulation de charges à la surface du liquide en sortie du capillaire, ce qui va former de fines gouttelettes hautement chargées (nébulisat). L évaporation de solvant conduit au rétrécissement de la taille des gouttelettes jusqu à ce que le champs électrique à leur surface soit suffisant pour provoquer la désorption des ions. Analyseur *ESI: ElectroSprayIonisation

12 L ionisation dans la source Les ions produits L ionisation chimique Le MALDI Molécules monochargées, essentiellement sous la forme [M+H] + donne le rapport m/z: [M+H] 1 L électronébulisation Molécules le plus souvent multichargées : [M+2H] 2+, [M+3H] 3+ [M+nH] n+ Ce qui donne des rapports m/z: [M+2H] [M+3H] [M+nH] 2 3 n

13 Les analyseurs Source d ions Production d ions En phase gazeuse Analyseur en Masse m/z Séparation des ions produits en fonction du rapport m/z

14 Les analyseurs à temps de vol (TOF) L Analyseur : Tube de Vol de longueur l Le Détecteur : Scintillateur/Photomultiplicateur 2 e détecteur Réflectron Analyse Peptides 1 e détecteur linéaire Analyse Protéine entière Energie cinétique d un ion de charge z soumis à une tension accélératrice Vo Ec=½ mv 2 = ½ m(l 2 /t 2 )=zvo Miroirs électrostatiques m/z = 2Vo t 2 /l 2 (Vo, l sont connus) rapport m/z = fonction du temps de vol t * TOF: Time of Flight

15 15 Couplage MALDI-TOF Torr Torr Vo Pompe Turbo : [A+H] + [A+cation] + [A-H] - [A+matrice] + [ions matrice] Laser 337nm vide élevé

16 Les analyseurs quadripolaire (Q) Les ions émanant de la source sont soumis à une tension continue (U) et une tension alternative (V) appliquées entre 4 électrodes. Le trajet des ions dans le quadripole est oscillant. Si l amplitude des oscillations est trop grande, les ions sont collectés par les barres du quadripole et ils ne seront pas détectés. On règle U et V de sorte que seul un ion de rapport m/z choisi puisse se frayer un chemin jusqu au détecteur (trajectoire stable). Pour obtenir des mesures sur une gamme de rapports masse/charge, on modifie les réglages de l appareil à haute fréquence.

17 Les analyseurs Trappe à ions (Ion Trap) Les ions décrivent des mouvements oscillatoires stables au centre de la trappe. Par application d une rampe de Radiofréquences au niveau de l électrode annulaire, les ions vont avoir une trajectoire déstabilisée et vont être éjectés de la trappe en fonction de leur m/z croissant. Spectre MS

18 18 Couplage ESI-Trappe à ions (IT) Capillaire de transfert chauffé L Analyseur : Trappe à ions Ion Trap 760 Torr 1 Torr Q Torr Q1 Lentille Torr ESI La Source : ESI Skimmer Dual Stage Turbo

19 l analyse MS TOF Quadripole Trappe à ions m/z = 2Vo t 2 /l 2 Gamme des rapports m/z par temps de vol Intensité Courant ionique 100% M A /z Réglage de radiofréquences pour sélectionner un m/z Gamme des rapports m/z par réglages successifs Spectre de masse M C /z M B /z m/z

20 l analyse MS Sensibilité de la spectrométrie de masse De l ordre de l attomole 1 mole N = 6, milli mole micro nano pico femto atto , soit molécules!!!

21 l analyse MS Résolution de la spectrométrie de masse Dépend de la qualité de l appareil Fonction du rapport masse/charge m 1 1,2 + 20% m 10 10,2 + 2% Rapport poids/puissance

22 l analyse MS Résolution de la spectrométrie de masse Dépend de la qualité de l appareil Fonction du rapport masse/charge La résolution mesure l aptitude d un analyseur à séparer l ion M de l ion M+ΔM Dès lors, un spectromètre dont la résolution est de 2000 peut séparer des pics situés à des valeurs m/z de 2000 et et 200,1 20,00 et 20,01

23 l analyse MS Isotopes naturels Élément Masse atomique Nucléide Masse H 1,00797 C 12,01115 N 14,0067 O 15, H D (ou 2 H) 12 C 13 C 14 N 15 N 16 O 17 O 18 O exacte 1, , , , , , , , ,9992 Abondance relative (%) 99,985 0, ,90 1,10 99,63 0,37 99,76 0,04 0,20 P 30, P 30, S 32, S 33 S 34 S 36 S 31, , , , ,03 0,75 4,22 0,02

24 l analyse MS Isotopes naturels Masse monoisotopique C est la masse du premier pic du profil isotopique c est-à-dire celle qui ne prend en compte que les masses des isotopes les plus stables (C12, H1, O16, S32, N14, ). Masse chimique ou moyenne C est le barycentre (centroïde) des masses des pics constituant le profil isotopique c est-à-dire la masse qui prend en compte la masse des éléments donnée par le tableau périodique (C=12,011).

25 l analyse MS Isotopes naturels et résolution Exemple : Spectre de l insuline (Masse moyenne : 5807,22) Résolution:

26 l analyse MS GYLSPYFINKPETGAVELESPFILLADK 13 C 2 x 13 C Résolution C

27 l analyse MS Exemple d un Spectre MS simple par MALDI-TOF d un peptide de 1570,632 ua Analyse d 1fmol de Glu-Fib purifié En mode Réflectron

28 l analyse MS Exemple d un Spectre MS simple par MALDI-TOF d une protéine de 66,5 kda Analyse de 500fmol de BSA En mode Linéaire

29 29 Consiste à sélectionner un ion (MS-MS), en provoquer la fragmentation, puis analyser la masse des fragments obtenus (MS-MS). L ion sélectionné est conduit dans une cellule de collision remplie d'un gaz inerte (argon par exemple). Lorsque l'ion sélectionné rentre en collision avec ce gaz, son énergie cinétique est convertie en énergie interne. La dissociation de l'ion se réalisera lorsque son énergie interne sera devenue supérieure à l'énergie d'activation nécessaire à la fragmentation. L analyse de la masse des fragments obtenus renseigne sur la structure de la molécule analysée. butane 1.4. l analyse MS-MS Fragmentation Par exemple, dans les alcanes linéaires, la fragmentation se manifeste par la perte d'un méthyle; ce qui donne des fragments de m/z = (masse 15).

30 30 fragmentation MS-MS sur une protéine Nomenclature des fragmentations peptidiques

31 l analyse MS-MS La fragmentation dans une Trappe à ions Collision avec He et irradiation à faible amplitude à la fréquence propre de l ion sélectionné Fragmentation Spectre MS/MS

32 l analyse MS et MS-MS Temps d acquisition en spectrométrie de masse TOF Quadripole Trappe à ions m/z = 2Vo t 2 /l 2 Gamme des rapports m/z par temps de vol < 20 msec Réglage de radiofréquences pour sélectionner un m/z Gamme des rapports m/z par réglages successifs < 200 msec Quelques microsecondes

33 Couplage Chromatographie Spectromètre de masse Compatibilité avec la rapidité d acquisition des spectres : 1 spectre MS (gamme de masses m/z balayée en 200msec) Courant ionique Total Intensité relative Chromatogramme Séparation de mélanges complexes couplée à l analyse Gradient par spectrométrie de 70 min: de masse d un mélange de peptides 32, % CH 3 CN/ HCO 2 H0.1% HPLC Spectre de masse Au temps: 32,17 min dans H 2 O/HCO 2 H 0.1% Phase inverse C18 1 chromatogramme HPLC Temps(min) spectres MS et MS/MS! m/z

34 34 Résumé des caractéristiques de la spectrométrie de masse - très sensible : qq attomoles sont détectées - haute résolution permet de distinguer les isotopes naturels d un élément - analyse rapide (qq msec) et compatible avec des mélanges séparés par chromatographie en ligne - génère de nombreuses données : spectres MS, MS/MS qui renseignent sur la structure de biomolécules - compatible avec l étude de mélanges hautement complexes comme un protéome entier.

35 35 Chapitre II : Applications de la spectrométrie de masse à l étude des peptides, des protéines et du Protéome

36 36 Chapitre II: Applications aux peptides, aux protéines et au protéome 2.1. Caractérisation physico-chimique par la masse globale contrôle de l intégrité de protéine interactions protéine-ligand modifications post-traductionnelles interactions protéine-protéine: oligomérisation /stoechiométrie 2.2. Identification de protéines : Protéomique Descriptive quelques définitions séparation par Electrophorèse 2D principe et ex de «peptide mass fingerprint» exploitation de la fragmentation MS/MS de la protéine au Protéome 2.3. Quantification de protéines : Protéomique Quantitative quantification relative quantification absolue quantification «label free»

37 Caractérisation physico-chimique par la masse globale contrôle de l intégrité d une protéine TorA (95 kda) est une protéine périplasmique d Escherichia coli. TorD (22 kda) est la chaperone stricte de TorA. Les 39 acides-aminés N-terminaux de TorA constituent une séquence signal indispensable à la translocation de TorA vers le périplasme. On mesure la masse de TorA produite par deux souches de bactéries E. Coli TorD + TorD - Extraction de protéines Spectrométrie de masse MALDI-TOF En l absence de sa protéine chaperone, TorA subit un clivage de 35 acides-aminés en N-terminal (-3877 Da)

38 Caractérisation physico-chimique par la masse globale interactions protéine-ligand AFEST Carboxylester hydrolase de l archeobactérie hyperthermophile Archaeoglobus fulgidus I Spectre MALDI-TOF AFEST Enzyme seule Le composé «7600» est un puissant inhibiteur de plusieurs sérine carboxylester hydrolases. II Enzyme + composé «7600» Composé «7600» Masse moléculaire : 284 Da Interaction forte mise en évidence par MALDI-ToF Intensité relative (%) m = 289 m/z

39 Caractérisation physico-chimique par la masse globale Modifications post-traductionnelles N-Glycosylation [M+H] + à Isoformes glycosylées d une protéine produite chez Pichia Pastoris MALDI-ToF [M+H] + + adduitmatrice, à Protéine mutée sur les 2 Asn par 2 Gln Glycosylation [M+H] + à Protéine non mutée Glycosylation Da sucres

40 Modifications post-traductionnelles Phosphorylation Mise en évidence d une phosphorylation sur la beta-caséine, par MALDI-ToF fmol Peptide Phosphorylé? Action Phosphatase Alkaline Peptide Déphosphorylé!

41 Modifications post-traductionnelles Type Δm (Da) Tout incrément de masse m (modification chimique ou mutation d AA) peut être mesuré par spectrométrie de masse. Cette détection m dépend de la Résolution de l appareil. Sera d autant plus notable sur des peptides où les m/z sont bien résolus.

42 Caractérisation physico-chimique par la masse globale interactions protéine-protéine en conditions dénaturantes (H 2 0/MeOH/AcAcétique) : Interactions non covalentes par ESI: Ex: la Ribonucléotide réductase E. coli en conditions non dénaturantes (tampon bicarbonate d ammonium) : Masse mesurée Masse mesurée Masse calc M 2 (Fe-O-Fe) 2 Monomère inactif Masse calc Dimère actif : avec 1 cluster «Fe-O-Fe» lié non covalemment sur chaque monomère

43 43

44 Identification de protéines : Protéomique Descriptive quelques définitions Protéome : ensemble des protéines exprimées par le génome ou par un type cellulaire ou une cellule (Wilkins, 1996) Protéomique descriptive : identification et caractérisation des protéines d une cellule dans un environnement donné L analyse «rapide» et à grande échelle des protéomes est devenue possible grâce à: * la connaissance des Génomes et donc des cadres ouverts de lectures (ORF) * méthodes de séparation des protéines * la spectrométrie de masse * la Bioinformatique

45 Identification de protéines Séparation par Electrophorèse bi-dimensionnelle (2-DE) Principe 1 ère Dimension: séparation = f(pi) Focalisation isoélectrique: IEF Gradient de ph immobilisé Strip - 2 nde Dimension: séparation = f(pm) Electrophorèse sur Gel de PolyAcrylamide en milieu dénaturant Sodium DodécylSulfate : SDS PAGE - - MW

46 Identification de protéines Séparation par Electrophorèse bi-dimensionnelle (2-DE) 1 ère Dimension: séparation = f(pi) Focalisation isoélectrique: IEF Charge nette ph<pi Point isoélectrique (pi) - - Toute protéine possède une charge nette électrique dont le signe et l intensité varient en fonction du ph de la solution et de son point isoélectrique : si ph<pi charge + si ph>pi charge - + ph=pi ph>pi Gradient de ph immobilisé Strip - Polymérisation de dérivés d acrylamide contenant des Immobilines (acide ou base faible défini par son pk); Gradient obtenu par variation continue du rapport des Imm Strips: gamme de ph 3-10; 6-11, 4-7, 5-6 Les protéines migrent dans un gradient de ph jusqu à ce qu elles rencontrent une zone de ph où elles sont électriquement neutres : ph=pi La séparation des protéines est basée sur leur différence de charge nette électrique.

47 Identification de protéines Séparation par Electrophorèse bi-dimensionnelle (2-DE) 2 nde Dimension: séparation = f(pm) Electrophorèse sur Gel de PolyAcrylamide en milieu dénaturant Sodium DodécylSulfate : SDS PAGE - + Gel à porosité fixe ou variable SDS: charge négative protéines Acrylamide SDS N,N méthylène -bis acrylamide Liaison SDS-Protéine stoechiométrique Taille des pores du gel = f(concentration en Acrylamide) Toutes les protéines vont se charger négativement, la séparation va se faire en fonction de la taille uniquement. T = 2,5% séparation de protéines de tailles élevées 10 6 Da T = 30% faibles 3000 Da Gradient 5-20%: augmentation de la résolution

48 48 Electrophorèse bi-dimensionnelle (2-DE) Très faible ampérage (50µA) Gradient fort voltage (10000V) Equilibration du strip: réduction, alkylation - SDS-PAGE Colorations: Bleu de Coomassie : ng/spot Sypro : 1-2 ng/spot Argent : ng/spot Résolution 5000 spots / gel +

49 49 Echantillon 1.Extrait protéique 2.Focalisation IsoElectrique 3.SDS PAGE 4.Coloration ph MW Spectrométrie de masse 5. Piquage des spots

50 Identification de protéines : Protéomique Descriptive Principe et exemple de «peptide mass fingerprint» Identifier une protéine, connaissant son origine (génome), revient à lui attribuer une séquence en acides aminés Bien qu il existe des méthodes physicochimiques de séquençage de protéines, ces méthodes sont peu sensibles et limitées (N-term bloqué, AA modifié ). En revanche, il est plus facile de séquencer des acides nucléiques et d en déduire la séquence en acides aminés des protéines encodées (ORF). On dispose à l heure actuelle de banques de séquences (databases) regroupant les séquences de plusieurs millions protéines de différentes espèces. Expérimentation Mesures de masses d une protéine à identifier Banques de séquences Calculs «in silico» Comparaison

51 Identification de protéines : Protéomique Descriptive Principe de «peptide mass fingerprint» Identifier une protéine, connaissant son origine (génome), revient à lui attribuer une séquence en acides aminés Expérimentation Banques de séquences Mesure de la masse d une protéine à identifier Comparaison Calculs «in silico» m/z différents m/z Résultat : masses identiques m/z identiques mais séquences différentes Mesure de m/z de protéines peu précis: identification de protéine impossible!

52 Identification de protéines : Protéomique Descriptive Principe de «peptide mass fingerprint» Protéase Expérimentation Coupure endoprotéolytique Mesure de la masse des peptides obtenus Comparaison Banques de séquences Calculs «in silico» «Fingerprint» différents Plusieurs m/z «Fingerprint = empreinte» «Fingerprint» identiques Résultat : peptides : m/z précis empreinte de coupure spécifique: Identification de la Protéine fiable!

53 Identification de protéines : Protéomique Descriptive Principe et exemple de «peptide mass fingerprint» Prot c Basée sur «peptide mass fingerprint» Compare ± Tolérance de Masse Prot a Prot b Prot c Prot e Prot d Prot g Prot f Moteurs bio-informatiques de recherche : Algorithmes de calculs des scores basés sur des probabilités Masses Expérimentales mesurées Masses Théoriques des Banques de séquences

54 Identification de protéines : Protéomique Descriptive Exemple de «peptide mass fingerprint» Exemple : Protéine adhésive CupB5 de Pseudomonas aeruginosa «peptide mass fingerprint» Probabilité très faible que cette identification soit due uniquement au hasard (10-15 ) Nombre de peptides identifiés

55 Identification de protéines : Protéomique Descriptive Exemple de «peptide mass fingerprint» Exemple : Protéine adhésive CupB5 de Pseudomonas aeruginosa avec 24 peptides identifiés expérimentalement : 29% de couverture de la séquence théorique

56 Identification de protéines : Protéomique Descriptive Exploitation de la fragmentation MS-MS La MS/MS donne une information structurale renseigne sur l enchaînement séquentiel d acides aminés

57 57 m/z= Expérimentation Mesures de MS et MS/MS des peptides Trypsiques d une protéine Comparaison Banques de séquences Calculs «in silico» 1 Masse Expérimentale MS 1 Spectre Expérimental MS/MS 1. Choix dans la banque des 500 m/z les plus proches du m/z expérimental (MS) 2. Comparaison des 500 spectres MS/MS théoriques associés au spectre expérimental 3. Classe 10 spectres MS/MS en fonction de leur score 4. Classe les peptides par protéine Masse Théorique MS Spectres Théoriques MS/MS

58 Identification de protéines : Protéomique Descriptive de la protéine au Protéome Complexes protéiques purifiés Lysats cellulaires Digestion protéolytique (Trypsine) Gel 2D coloré au Nitrate d argent Collecte de spectres MS et MS/MS Gel 1D SDS coloré au Bleu de Coomassie MALDI TOF en mode Réflectron m/z nano-lc ESI-Trappe à Ions Comparaison avec données in silico des banques de séquences Protéine X Protéine Y Protéine Z

59 59 Identification des constituants d un complexe protéique chez une bactérie extrêmophile par spectrométries de masse et ESI-IT

60 60 Identification de mélanges très complexes de protéines par spectrométrie de masse ESI-IT Orbitrap Chromatographie en configuration 1D Chromatographie en configuration 2D Identification 20 protéines (run HPLC 1h) Identification >200 protéines (1h) Spectromètres de masse de dernière génération de type Orbitrap Identification 50 protéines (4 steps de sels 4x 1h)

61 61 Identification de 45 protéines uniques et de 8 complexes individuels organisés en un édifice supramoléculaire M. Guiral et al. New Insights into the Respiratory Chains of the Chemolithoautotrophic and Hyperthermophilic Bacterium Aquifex aeolicus Journal of Proteome Research, vol. 8, Avr. 2009, pp

62 Identification de Protéomes de micro-organismes 62 Analyse du Protéome de Rickettsia felis Analyse du Protéome de Mimivirus géant 21.5 Approche par 2DGel+ MS par nlc MS/MS par les 2 approches Total Total M. Ogawa et al, Proteomics, produits de gène(13%) 66 inconnues 45 ORFans (11%) 5 protéines structurales (Major Capsid protein ) 12 protéines impliquées dans la Transcription (DNA repair, topoisomerases) 9 protéines de la voie du métabolisme oxidatif 7 protéines de modification P. Renesto et al, Journal of Virology, 2006

63 Quantification de protéines: Protéomique Quantitative quantification relative quantification absolue quantification «label free» But: Comparer et Quantifier des variations d expression de protéines dans des situations biologiques variées : conditions de contrôle vs conditions de stress, pathologiques, avec stimuli chimiques Quantification Relative par Spectrométrie de masse après marquage - marquage métabolique: SILAC - étiquettes chimiques : ICAT, itraq, Quantification Relative par Electrophorèse 2-DiGE après marquage Quantification Absolue marqueur interne ex: Aqua-Peptides, Quantification sans marquage : «label free»

64 2.3. Quantification de protéines : Protéomique Quantitative quantification relative par Spectrométrie de masse après marquage 64 Pour comparer deux situations expérimentales Introduction d un marquage des protéines, dans l une des deux conditions à comparer Condition 1 Condition 2 Comparaison du protéome Cellules, tissus, organisme Purification, fractionnement Protéines Peptides Mesures MS MS-MS Analyse des données Pas de marquage et 2 Marquage métabolique et 2 1 et 2 1 et 2 1 et 2 1 et 2 Marquage chimique et 2 1 et 2 1 et et 2 1 et 2

65 2.3. Quantification de protéines : Protéomique Quantitative quantification relative par Spectrométrie de masse après marquage 65 SILAC : Marquage d acides aminés par incorporation d isotopes stables lourds (13C ou 15N) en culture de cellules (:Stable Isotope Labeling by Aminoacids in cell Culture) 6x 12 C de l Arginine 6x 13 C de l Arginine m =6 Quantification relative des pics MS d un même peptide m =6

66 2.3. Quantification de protéines : Protéomique Quantitative quantification relative par Spectrométrie de masse après marquage 66 ICAT : Etiquettes chimiques d isotopes stables légers ou lourds greffés sur les Cystéines (: Isotope-Coded Affinity Tag) -SH (Cys) 8xX= 1 H 8xX= 2 D m =8 ICAT léger Marquage de protéines Digestion Ti Quantification relative des pics en MS m =8 ICAT lourd Purification par affinité Identification par Spectre MS/MS

67 2.3. Quantification de protéines : Protéomique Quantitative quantification relative par Spectrométrie de masse après marquage 67 Rapporteur Balance itraq : Etiquettes isobariques pour la quantification relative (: isobaric Tagging Reagents for Quantitative proteomic Analysis) 4 étiquettes = 4 situations expérimentales à tester α-nh 2- peptide p e p t i d e α-nh 2- peptide p e p t i d e α-nh 2- peptide p e p t i d e α-nh 2- peptide p e p t i d e Total 145 Da Analyse MS : tous les peptides Masse +145 Da quantification Analyse MS/MS Identification peptide

68 2.3. Quantification de protéines et étude de protéomes quantification relative par Spectrométrie de masse après marquage 68 quantification relative par ITRAQ Analyse MS et MS/MS de tous les peptides marqués quantification Identification peptide Quantification relative par la mesure de l intensité des «rapporteurs» spécifiques à chaque situation expérimentale testée, et associé à chaque peptide (quantités moyennées par les différents peptides qui identifient une protéine)

69 Quantification de protéines : Protéomique Quantitative quantification relative par Electrophorèse 2D-DiGE après marquage variations inter-gel 1000 Colloïdal Coomassie SYPRO Ruby - sensibilité Coloration - homogénéité - dynamique Proteine (ng) ,1 Silver Nitrate

70 70 1) Marquage des extraits avec des colorants fluorescents: Cy2, Cy3, Cy5 2)Mélange des 3 échantillons 3) Séparation 2-DE 3 ph 11 S IEF - - MM -200 S Mélange = Standard interne 4) Scan sur les 3 longueurs d onde Cy5 Cy3+Cy SDS PAGE -10 5) Analyse quantitative informatisée Cy3 Cy2 Cy2+Cy3+Cy5 STD-cy2 S1-cy3 S2-cy5 Rapport d abondance du spot Std S1 S2

71 70b sans standard interne Gel 1 extrait 1 (Cy3) extrait 2 (Cy5) Standard (Cy2) - Corrélation spot à spot - Normalisation de l abondance par rapport à chaque spot du standard Gel 2 avec standard interne extrait 3 (Cy3) extrait 4 (Cy5) Standard (Cy2)

72 71 Impératifs:. 4 réplicats biologiques obligatoires par extrait avec inversion des marquages dye. l extrait «Std» obligatoire par gel : corrélation normalisation intra-gel et inter-gel ph du tampon de marquage: 8.5 pas d amines primaires/pas d agent réducteur pas de détergent autre que le CHAPS concentration de l échantillon entre 2.5 et 10µg/µl marquage sur 50µg de protéines/400pmol de dye STD SS N

73 72 Analyse informatisée: test sur Asterionella formosa; comparaison en culture standard (N) et sans silice (SS) Spot détection: spots demandés exclusion filter: volume<30000 Sans filtre: 4500 spots Superposition des images Dige. Cy3-vert=N; Cy5-rouge=SS Avec filtre: 1150 vrais spots STD SS N SS STD N

74 73 Superposition des images Dige. Cy3-vert=N; Cy5-rouge=SS SS STD N

75 Quantification de protéines : Protéomique Quantitative quantification absolue Dosage d une protéine connue dans un mélange Synthèse d un peptide marqué ( 13 C, 15 N, Δm 6-10 Da) Caractérisation par spectrométrie de masse Ajout d une quantité connue de ce peptide de synthèse dans l échantillon biologique Digestion protéolytique Analyse en Spectrométrie de Masse LC-MS et SRM Comparaison de l abondance Peptide marqué/peptide natif

76 Quantification de protéines : Protéomique Quantitative «label free» Pour comparer deux situations expérimentales (ou plus!) Condition 1 Condition 2 Comparaison du protéome Cellules, tissus, organisme Purification, fractionnement Protéines Peptides Mesures MS MS-MS Analyse des données Pas de marquage et 2 Nécessité de répéter chaque situation : expériences biologiques et techniques (n=3 à 10) et rassembler les données : Go-To! Et exploitation avec divers outils bioinformatiques travail de longue haleine!

77 Protéomique quantitative «label free» La protéomique à la recherche de Biomarqueurs HUPO : HUman Proteom Organization 2002 PPP: Plasma Proteome Project Le sang humain peut contenir des protéines provenant de différentes parties du corps Un répertoire le plus complet des protéines du plasma humain et de leur quantité peut permettre la découverte de biomarqueurs de maladies Chercheurs du consortium se sont entendus pour multiplier les mesures à partir de différentes préparations et différents spectromètres de masse avec différentes méthodes de quantification Par intégration de ces multiples résultats et du développement d outils bioinformatiques : Établissement d un atlas de peptides (20433) quantifiés qui réfère à un set non-redondant de 1929 protéines du plasma humain, publiquement accessible.

78 77 Plusieurs déclinaisons de spectromètres de masse pour répondre aux questions sur la Protéomique Orbitrap Mass spectrometry and protein analysis. Domon B, Aebersold R. Science Apr 14;312(5771):212-7.

79 78 Fin du cours