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1 16/11/12 TYPAGE HLA CROSSMATCH ANTICORPS ANTI-HLA Chantal GAUTREAU LABORATOIRE HLA S E R V I C E D I M M U N O L O G I E E T D H I S T O C O M PAT I B I L I T É, A P - H P, HÔPITAL SAINT LOUIS, PARIS, FRANCE Généralités Définitions CMH : Complexe Majeur d Histocompatibilité (chr 6) Organisation conservée dans les espèces animales Chez l homme : Système HLA : Human Leucocyte Antigen Découverte Jean DAUSSET en 1958 met en évidence des antigènes leucocytaires pouvant entraîner la synthèse d anticorps spécifiques 1

2 Chromosome 6: Région HLA DP DQ DR 21oh C4 Bf C2 hsp TNF B C A HLA Classe II 32 gènes HLA classe III HLA classe I 17 gènes Bras court du chr 6 (6p21.3) Polymorphisme Liaison haplotypique Codominance Structure moléculaire Protéines transmembranaires appartenant à la superfamille des Immunoglobulines Organisation en domaines Peptide binding groove 2

3 classe II DE NOUVEAUX ALLELES SONT SANS CESSE DECOUVERTS 3

4 Polymorphisme Système hautement polymorphe Plus de 7000 allèles! Rôle physiologique de défense immunitaire Localisation du polymorphisme : au niveau de la niche à peptide HLA classe I : exons 2 et 3 (α1 α2) HLA classe II : exon 2 (β1) Gènes Allèles Protéines Spécificités sérologiques A B C DRB DQB DPB Non définis sérologiquement (Chiffres 10/2011) Les epitopes HLA sont des structures tridimensionnelles de surface reconnues par les anticorps anti-hla 4

5 Nomenclature HLA sérologique A1 A43 B5 B42 B62(15) DR1 DQ1 A2 A66(10) B7 B44(12) B63(15) DR2 DQ2 A3 A68(28) B8 B45(12) B64(14) DR3 DQ3 A9 A69(28) B12 B46 B65(14) DR4 DQ4 A10 A74 B13 B47 B67 DR5 DQ5(1) A11 A80 B48 B70 B14 DR6 DQ6(1) A19 B15 B49(21) B71(70) DR7 DQ7(3) A23(9) B16 B50(21) B72(70) DR8 DQ8(3) A24(9) B17 B51(5) B73 DR9 DQ9(3) A25(10) B18 B52(5) B75(15) DR10 A26(10) B21 B53 B76(15) DR11(5) A28 B22 B54(22) B77(15) DR12(5) A29(19) B27 B55(22) B78 DR13(6) A30(19) B35 B56(22) B81 DR14(6) A31(19) B37 B56(17) B82 DR15 (2) A32(19) B38(16) B58(17) B83 DR16(2) A33(19) B39(16) B59 DR17(3) A34(10) B40 B60(40) DR18(3) A36 B41 B61(40) Nomenclature HLA 2010 HLA-A * 24: 02: 01: 02 L Locus BM Série allélique = Sérologie Allèle Mutation synonyme Mutation introns Expression Mise en place à partir du 1er avril

6 Détermination du nombre d incompatibilités entre le donneur et le receveur Détermination du MM=mismatch=incompatibilité R: A01 A02 B08 B44 DR03 DR04 D1: A01 A02 B08 B44 DR03 DR04 6 Id 0 MM D2: A01 A29 B08 B44 DR03 DR04 5 Id 1 MM D3: A01 A - B08 B44 DR03 DR04 5 Id 0 MM EFFET DE LA COMPATIBILITÉ HLA EN GREFFE RÉNALE 6

7 BILAN D HISTOCOMPATIBILITE PRE-GREFFE R E C E V E U R Typage HLA A, B, (C), DR, DQ, (DP) Identification des anticorps anti-hla pour déterminer les antigènes permis et les antigènes interdits DONNEUR Typage HLA A, B, (C), DR, DQ, (DP) CROSSMATCH Crossmatch (CM) par LCT ou CM FACS CM «virtuel» par l analyse des anti-hla: identification des anti-hla spécifiques du greffon (donor specific antibody:dsa) 7

8 Typage HLA Par sérologie: identification des antigènes HLA Par biologie moléculaire: identification des allèles HLA au niveau des gènes HLA Classe I HLA classe II LymphoCytoToxicité (LCT) PRINCIPE DU TYPAGE HLA SEROLOGIQUE PAR LYMPHOCYTOTOXICITE (LCT) Basée sur une réaction Ag-Ac entre les cellules à tester et des sérums de spécificité anti-hla connue Lyse cellulaire molécule HLA Ac Anti HLA (spécificité connue) Ajout de Complément de lapin Colorant lymphocyte À typer 8

9 Typage HLA par biologie moléculaire 3 techniques sont utilisées: -PCR-SSO (sequence specific oligoprobes) -PCR-SSP (sequence specific primers) -PCR-SBT (sequencing based typing) PCR-SSO : «sequence specific oligoprobes» Amplification de l ADN par PCR HLA classe I Exons 2 et 3 HLA classe II Exon 2 Hybridation des amplicons sur des sondes complémentaires fixées sur différents supports (membrane de nylon, billes, puits d une plaque ELISA, puces) Révélation des hybrides Réaction colorimétrique Fluorescence 9

10 PCR-SSP 2 étapes: -amplification avec des amorces spécifiques -migration sur gel et interprétation GEL DE TYPAGE SSP NEG POS 10

11 Identification des Ac Anti HLA 1) Sérum du patient testé contre un panel d antigènes HLA LCT Panel de lymphocytes Deux types d information PRA: % de cellules positives dans le panel Ac identifiés déterminés par corrélation statistique Techniques utilisant des Ag HLA purifiés (solid phase assay) ELISA: Ag fixés dans des puits Luminex: Ag fixés sur des billes Identification d Ac anti HLA de classe I et II 2) Techniques Haute Définition utilisant des Ag HLA purifiés et clônés: 1 Ag par puits ou bille ELISA LUMINEX SINGLE ANTIGEN 11

12 AC ANTI-HLA PAR TECHNIQUE LUMINEX SINGLE ANTIGEN Molécules HLA purifiées, isolées par clonage et fixées sur des billes de polystirène 1 antigène par bille Chaque bille est caractérisée par une fluorescence interne spécifique ce qui permet dans un même puits de tester tous les antigènes HLA (1 serum par puits) Détermination d une intensité moyenne de fluorescence (MFI=medium fluorescence intensity) = signal de positivité Identification d anti-hla classe I par luminex single antigen Intensité moyenne de fluorescence (mfi) en ordonnée 12

13 LE CROSSMATCH PAR MICROLYMPHOCYTOTOXICITÉ (LCT) Cellules du donneur exprimant les molécules HLA + sérum de patient SANS anticorps anti-hla + complément Pas de lyse Cross-Match négatif + sérum de patient AVEC anticorps anti-hla + complément Lyse Cross-Match positif 26 13

14 CROSS-MATCH PAR CYTOMÉTRIE DE FLUX Lymphocytes du donneur Sérum du receveur CD45 T B CD45 Anticorps monoclonaux CD3 CD19 Analyse au cytomètre de flux 27 Transplantation rénale Suivi immunologique des patients en pré et post greffe PRE-GREFFE Typage HLA Prélèvements tous les 3 mois Pour la recherche d anti-hla POST-GREFFE Suivi post greffe Prélèvements Pour la recherche d anti-hla J0 GREFFE Rejet Suivi de traitement Apparition de DSA Suivi de DSA 14

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