INSTRUMENTATION ET MÉTHODES

Dimension: px

Commencer à balayer dès la page:

Download "INSTRUMENTATION ET MÉTHODES"

Andrée Solange Pierre
il y a 6 ans
Total affichages :

1 INSTRUMENTATION ET MÉTHODES * Gélose nutritive en Pétri (EMD) * Plateau (transport) * Anse de platine (petite et moyenne) * Brûleur et briquet * Bouillon stérile (BP) * Tubes pour milieu de culture en bouillon * Support à tubes * Désinfectant * Papier buvard * Crayon gras * Pipette de 1ml (Costar) * Flacon laveur * Lames de microscope * Solution de bleu de méthylène (colorant basique) * Colorants de Gram * Culture bactérienne de Bacillus subtilis (preceptrol culture) * Culture bactérienne de Serratia marcescens (preceptrol culture) * Microscope (Leica) * Étuve (50 o C) (Boekel) * Réfrigérateur * Étuve (37 o C) (Precision) * Compteurs de colonies (American Optical Corporation) * Compteur manuel * Solution saline pour dilutions * Essuie-tout

2 PROTOCOLE Manipulations À l origine (culture pure), faire croître Bacillus subtilis dans l étuve à 37 o C pendant 4 heures pour s assurer d avoir un nombre suffisant de bactéries pour l expérimentation. Faire de même avec Serracia marcenscens mais les faire croître pendant 16 heures dans l étuve à 37 o C. Dilution des bouillons (test) : Faire huit dilutions (4 pour chaque type de bactéries) afin de déterminer laquelle est la plus efficace. Identification des boîtes de Pétri - Identifier chacune des boîtes de Pétri, et la dilution, à l'aide d'un crayon gras sur la portion contenant la gélose : Boîte #1 1/10 Boîte #2 1/100 Boîte #3 1/1 000 Boîte #4 1/ Préparation des dilutions de l échantillon : - Mélanger la culture bactérienne en bouillon de façon à ce qu'elle soit complètement homogène (effectuer 25 inversions). - À l'aide de la première pipette stérile, prélever 1 ml de culture et l'introduire dans un premier tube contenant 9 ml de solution saline isotonique. - Agiter par inversion (dilution du bouillon 1/10). - À l'aide de la seconde pipette stérile, prélever 1 ml de la dilution 1/10 et l'introduire dans un deuxième tube contenant 9 ml de solution saline isotonique. - Agiter par inversion (dilution du bouillon 1/100). - À l'aide de la troisième pipette stérile, prélever 1 ml de la dilution 1/100 et l'introduire dans un troisième tube contenant 9 ml de solution saline isotonique - Agiter par inversion (dilution du bouillon 1/1 000). - À l'aide de la quatrième pipette stérile, prélever 1 ml de la dilution 1/1 000 et l'introduire dans un quatrième tube contenant 9 ml de solution saline isotonique - Agiter par inversion (dilution du bouillon 1/10 000). Ensemencement de la gélose : Préparation de l aire de travail : - Laver les mains

3 - Laver la surface de travail avec le désinfectant - Disposer sur l aire de travail tout le matériel nécessaire en prenant soin d être à l aise pour travailler. - Allumer le brûleur Afin d'ensemencer les géloses, procéder comme suit pour chacune des 4 dilutions et ce, pour chaque type de bactéries, en prenant soin de bien ensemencer la boîte identifiée avec la dilution correspondante. Prélever 0,5ml de culture bactérienne diluée à l'aide d'une pipette stérile et déverser son contenu dans la boîte de Pétri, sans toucher celle-ci avec le bout de la pipette. Faire un étalement de la culture diluée déposée sur la gélose, à l aide d une anse de platine stérile. Après 24h d incubation à 37 C dans l étuve, déterminer laquelle des dilutions est la plus efficace pour chaque type de bactéries en dénombrant le nombre de colonies. Procédure expérimentale : Ensemencer (12) cultures bactériennes en bouillon de Bacillus subtilis et (12) de Serratia en respectant les mêmes procédures que pour le test de dilution. dans le réfrigérateur à 10 C. Laisser incuber pendant 24h. dans le réfrigérateur à 24 C. Laisser incuber pendant 24h dans l étuve à 37 C avec lumière et la même chose sans lumière. Laisser incuber pendant 24h. dans l incubateur à 50 C. Laisser incuber pendant 24h. Prélever un échantillon de 1ml pour chaque culture et effectuer les dilutions choisies (1/10, 1/100 et 1/1000) dans 9 ml de solution saline isotonique. Commencer à ensemencer en gélose, qui ont été préalablement identifiées selon les bactéries, la dilution et les facteurs expérimentaux, comme indiqué précédemment. Laisser incuber 24h et déterminer le nombre de colonies pour chacune des géloses.

4 COLORATIONS Coloration simple : Faire cette technique avec les différentes bactéries Étalement - Identifier les lames en y inscrivant le nom de la bactérie concernée ou inconnu - Stériliser la lame en la passant dans la flamme. - Laisser refroidir une dizaine de secondes. - Ajouter une goutte d'eau stérile sur la lame. - Stériliser l'anse de platine en la passant dans la flamme. - Laisser refroidir une dizaine de secondes. - Après avoir soulevé le couvercle de la boîte de Pétri contenant les bactéries, prélever une colonie à la surface de la gélose à l'aide de l'anse stérilisée. - Déposer le prélèvement sur la lame et l'étendre délicatement en imprimant un mouvement circulaire à l'anse de platine pour bien disperser les bactéries. - Laisser sécher le frottis à l air libre. Fixation - Fixer le frottis bactérien en passant la lame à travers la flamme. La température de la lame doit s'endurer sur le dos de la main (70 C). - Répéter cette opération deux à trois fois. - Déposer la lame sur le support à coloration et laisser refroidir. Coloration - Inonder la lame avec la solution de bleu de méthylène pendant 60 secondes. - Laver la préparation sous un mince filet d'eau stérile à l'aide du flacon laveur. - Assécher complètement la lame colorée à l'aide du papier buvard. Coloration de Gram : Faire la technique d étalement et de fixation comme vue avec la coloration simple avec les différentes bactéries et l échantillon inconnu Coloration - Inonder la lame avec la solution de cristal violet pendant 30 secondes. - Rincer la préparation avec l'iode de Gram - Recouvrir la lame avec l'iode de Gram pendant 30 secondes pour mordancer (fixer) le colorant. - Rincer la préparation avec un jet d'eau stérile. - Décolorer la préparation avec l'alcool-acétone jusqu'à ce que le solvant n'entraîne plus de colorant. Attention de ne pas trop décolorer, 5 à 10 secondes de décoloration suffisent normalement. - Rincer la préparation avec un jet d'eau stérile. - Couvrir le frottis avec le colorant fuschine basique pendant 15 secondes. - Rincer la préparation avec un jet d'eau stérile - Assécher complètement la lame colorée à l'aide du papier buvard.

5 RÉSULTATS Exemples de calculs Calcul du nombre total de bactéries (unités viables) en fonction du nombre de colonies dénombrées dans les géloses selon les résultats de la culture Bacillus subtilis pour 10 o C. 1. Facteur de conversion Nombre de colonies en gélose = nombre total de bactéries = 1160 bactéries Explication du «facteur de conversion» : Puisque nous avons ensemencé en gélose les bactéries avec 0,5 ml de bouillon, le facteur de conversion doit tenir compte de cela et doit donc inclure le multiple «2» pour avoir le nombre correspondant de bactéries dans 1 ml. Par la suite, il suffit de multiplier par «10» ce facteur pour obtenir le nombre de bactéries dans 10 ml, soit la quantité initiale de bouillon soumis aux facteurs expérimentaux. Tableau des résultats Tableau 1 : Culture de Bacillus subtilis en fonction de la température 1 (10 C) 1/10 (10-1 ) (10 C) 1/100 (10-2 ) - 3 (10 C) 1/1000 (10-3 ) - 4 (24 C) 1/10 (10-1 ) (24 C) 1/100 (10-2 ) - 6 (24 C) 1/1000 (10-3 ) - 7 (37 C) 1/10 (10-1 ) (37 C) 1/100 (10-2 ) - 9 (37 C) 1/1000 (10-3 ) - 10 (50 C) 1/10 (10-1 ) (50 C) 1/100 (10-2 ) - 12 (50 C) 1/1000 (10-3 ) -

6 Tableau 2 : Culture de Serratia marcescens en fonction de la température 1 (10 C) 1/10 (10-1 ) 0 2 (10 C) 1/100 (10-2 ) - 3 (10 C) 1/1000 (10-3 ) - 4 (24 C) 1/10 (10-1 ) (24 C) 1/100 (10-2 ) - 6 (24 C) 1/1000 (10-3 ) - 7 (37 C) 1/10 (10-1 ) (37 C) 1/100 (10-2 ) - 9 (37 C) 1/1000 (10-3 ) - 10 (50 C) 1/10 (10-1 ) 0 11 (50 C) 1/100 (10-2 ) - 12 (50 C) 1/1000 (10-3 ) - Tableau 3 : Culture de Bacillus subtilis en fonction de la température 1 (37 C avec lumière) pure 16 2 (37 C avec lumière) 1/10 (10-1 ) - 3 (37 C avec lumière) 1/100 (10-2 ) - 4 (37 C sans lumière) pure 12 5 (37 C sans lumière) 1/10 (10-1 ) - 6 (37 C sans lumière) 1/100 (10-2 ) - Tableau 4 : Culture de Serratia marcescens en fonction de la température 1 (37 C avec lumière) pure - 2 (37 C avec lumière) 1/10 (10-1 ) - 3 (37 C avec lumière) 1/100 (10-2 ) (37 C sans lumière) pure - 5 (37 C sans lumière) 1/10 (10-1 ) - 6 (37 C sans lumière) 1/100 (10-2 ) 27000

Documents pareils

Test d immunofluorescence (IF)

Test d immunofluorescence (IF) 1.1 Prélèvement du cerveau et échantillonnage Avant toute manipulation, il est fondamental de s assurer que tout le personnel en contact avec un échantillon suspect soit