Résistance aux antibiotiques Rôle du laboratoire de bactériologie. Vincent Jarlier DIU Mal Inf
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1 Résistance aux antibiotiques Rôle du laboratoire de bactériologie
2 Evaluation de l activité in vitro d un antibiotique Mesure de l inhibition de la multiplication des bactéries (effet bactériostatique) : antibiogramme et ses dérivés Mesure de la mort des bactéries (effet bactéricide)
3 Concentration minimale inhibitrice Définition : CMI plus faible concentration d'antibiotique qui inhibe toute croissance visible d'un organisme après 24h d'incubation dans un milieu de croissance spécifique. approche la plus utilisé pour évaluer in vitro l activité bactériostatique d un antibiotique. Méthode mettre en présence un inoculum bactérien défini et des dilutions sérielles de l antibiotique. La concentration à laquelle il n'y a pas de croissance visible dans le milieu de culture est appelée la CMI.
4 Mesure directe de la CMI Dilution en milieu liquide de Mueller-Hinton Dilution en milieu gélosé de Mueller-Hinton Diffusion en milieu gélosé de Mueller-Hinton par technique de E-test
5 Concentration minimale inhibitrice : CMI Dilution en milieu liquide de Mueller- Hinton Dilution en milieu gélosé de Mueller- Hinton
6 CMI : dilution en milieu liquide (tube) 1. ensemencement
7 CMI : dilution en milieu liquide (tube) 2. Résultat après 24 heures
8 CMI : dilution en milieu liquide (microplaque)
9 CMI : dilution en milieu solide (boite) Témoin 64 mg/l 512 mg/l Antibiotiques à concentration croissante
10 CMI : méthode du E-test Zone de croissance Zone d inhibition CMI Bandelettes imprégnées d'un gradient exponentiel continu de l'antibiotique Le gradient couvre un évantail de concentrrations ade hoc en fonction des molécules : 0,016 à 256 mg/l, 0,002 à 32 mg/l... Le Etest associe les caractéristiques des méthodes de diffusion et de dilution en milieu solide.
11 Antibiogramme standard Mesure de l activité bactériostatique des antibiotiques sur une souche bactérienne Méthode: diffusion en milieu gélosé Milieu standard : gélose de Mueller Hinton Inoculum standard : 10 6 bactéries/ml Disques imprégnés d une quantité définie d antibiotique Mesure du diamètre de la zone d inhibition autour du disque : approche de la CMI Interprétation des résultats en fonction de données pharmacocinétiques et pharmacodynamiques
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13 Antibiogramme standard en milieu gélosé : concordance avec les CMI
14 Antibiogramme standard : interprétation des résultats Comparaison des CMI déduites de la mesure des diamètres obtenus avec des concentrations «critiques» définies en fonction : de la distribution des CMI sur des souches des espèces les plus fréquentes des concentrations sériques et tissulaires des antibiotiques aux posologies recommandées des résultats des essais cliniques => Concentrations critiques hautes (C) définit la résistance => Concentrations critiques basses (c) définit la sensibilité
15 Paramètres pharmacocinétiques utilisés pour l interprétation des tests de sensibilité PIC Cmax Demi-vie plasmatique Cmax/2 RESIDUEL
16 Antibiogramme standard. les catégories cliniques S, I, R S = probabilité forte de succès thérapeutique si voie systémique et posologie recommandée CMI <<<< Concentrations in vivo R = forte probabilité d échec thérapeutique quels que soient le type d administration et la dose administrée CMI > Concentrations in vivo I = succès thérapeutique imprévisible CMI >=< Concentrations in vivo
17 Antibiogramme Diamètre S I R S I R CMI
18 Antibiogramme standard catégorisation selon les valeurs critiques Catégorie S R I CMI (mg/l) CMI c CMI > C c < CMI C Diamètre Diam. D Diam < d d CMI < D
19 Test de sensibilité aux antibiotiques ou Antibiogramme sensible intermédiaire résistant
20 Concentration minimale bactéricide : CMB Définition plus faible concentration d'antibiotique capable de tuer les bactéries après 24 h d'incubation dans un milieu de croissance spécifique en laissant un pourcentage de bactéries survivantes < 0,01% (- 4 Log) de l inoculum de départ. Méthode dilution en milieu liquide de Mueller-Hinton lecture de la CMI à 24 h et dénombrement bactérien dans l inoculum de départ repiquage des tubes sans croissance visible dénombrement bactérien après 24 h et comparaison avec l inoculum de départ
21 Effet bactériostatique et bactéricide Carryn AAC 2002;46:
22 Concentration minimale bactéricide (CMB) : interprétation CMI # CMB => ATB bactéricide ex : B-lactamines, aminosides CMI <<< CMB => ATB bactériostatique ex : tétracyclines, chloramphénicol, macrolides
23 Concentration (mg / L) INH RMP PZA EMB SM TH Concentration sérique des antituberculeux et CMI (o)
24 Bactéricidie concentration dépendante - Définition : activité bactéricide augmente avec la concentration, effet postantibiotique important et dépendant de la dose - Pic sérique (Cmax) = concentration maximale d'antibiotique obtenue dans le sérum - Cmax/CMI: indicateur d'efficacité - Apport important en antibiotique permet une réduction drastique de l'inoculum bactérien qui se maintient jusqu'à une nouvelle administration grâce à l'effet postantibiotique - Exemple : aminosides
25 Optimisation des traitements antibactériens sur base des propriétés PK/PD: les aminoglycosides
26 Bactéricidie temps dépendante - Définition : activité qui ne présentent pas ou peu d'effet postantibiotique et dont l'effet bactéricide dépend du temps d'exposition mais pas de la concentration - T (temps d exposition) > CMI : temps pendant lequel la concentration de l'antibiotique se situe au-delà de la CMI - Exemple: beta-lactamines
27 Optimisation des traitements bactériens sur base des propriétés PK/PD: les béta-lactamines A. Augmenter la dose unitaire B. Augmenter la fréquence d'administration NON OUI
28 Bactéricidie temps et concentration dépendante - Définition : bactéricidie rapide et dépendante de la concentration et effet postantibiotique dépendant de la dose et du temps d'exposition - AUC (aire sous la courbe) : donne une mesure globale de la quantité totale de médicament auquel est exposé l'organisme - AUC/CMI : paramètre déterminant dans l'activité de ces antibiotiques - Exemples : fluoroquinolones, cyclines, azithromycine
29 AUIC : paramètre prédictif du succès bactériologique et clinique des infections pulmonaires à BGN (exemple de la ciprofloxacine) AUIC (intervalle) Eradication bactérienne (%) Succès clinique (%) D après Forrest AAC 1993, 37 :
30 Caractères de la résistance aux Naturel ou acquis antibiotiques support génétique de la résistance caractère transférable ou non transférable : mode d acquisition Mécanisme proprement dit («physiologie)
31 Résistance naturelle Caractéristiques propre à une espèce bactérienne Partagée par toutes les souches dites normales de l espèce dit «phénotype sauvage» Définie les espèces habituellement sensibles, et modérement sensibles (RCP) Exemples : Escherichia coli : résistance aux macrolides, aux glycopeptides Staphylococcus aureus: résistance aux imidazolés, à la colistine streptocoques : résistance aux aminosides
32 Résistance acquise Caractéristiques propre à certaines souches au sein d une espèce bactérienne naturellement sensible «Phénotype résistant» Résulte d une modification génétique: Mutation Acquisition d un gène de résistance Exemples : E. coli résistant à l ampicilline S. aureus résistant à la pénicilline Pneumocoque résistant à l érythromycine
33 Support génétique de la résistance Chromosome: Responsable de la résistance naturelle Responsable d une partie des résistances acquises : sélection de mutant résistant => transmission verticale (par filiation) Transformation et recombinaison par gènes de résistance étrangers chez espèces naturellement transformables (pneumocoque, gonocoque) => transmission horizontale (d une bactérie à une autre) Plasmide ou élément génétique transférable (contenant transposon, integron ) Responsable d une partie des résistances acquises Transmission par conjugaison ou transposition Transmission horizontale et verticale Épidémie de souches et épidémie de support
34 Mode d acquisition de la résistance aux antibiotiques 1. sélection de mutants résistants 2. transmission du gène résistant d une bactérie à 1 autre
35 Shéma de sélection de mutants Foyer infectieux ou flore commensale résistants ATB opulation bactérienne sensible [C] locale bactérie sensible bactérie résistante à l antibiotique Reconstitution de la population Population bactérienne résistante
36 Mode d acquisition de la résistance aux quinolones = mutation chromosomique Mutation ponctuelle dans le gène d une cible (Thr) A (Ala) G (Pro) C Ex : Serine-83 gyra T C G (Trp) G (Stop) A (Leu) T (Ser) A (Ser) C (Ser) T Mutation ponctuelle dans un gène régulateur de l accumulation Ex : marr, mexr marc _ maro marr + mara marb proportion de mutants : 1 pour 10 à 100 millions de bactéries
37 Sélection de mutants résistants Couples antibiotiques-bactéries Toutes espèces et Quinolones Rifamycines Acide fusidique Fosfomycine antimycobactériens B-lactamines et Enterobacter Serratia Morganella Citrobacter Providencia Pseudomonas Acinetobacter etc..
38 Imperméabilité PENETRATION PAROI Bactérienne Inactivation INACTIVATION Activation Isoniazide, imidazoles ACTION sur la CIBLE Hyper efflux Blactamines Aminosides EFFLUX Quinolones, cyclines Modification ou protection de la cible Facteurs d activité des antibiotiques Mécanismes de résistance
39 Mécanismes de résistance aux antibiotiques 1. Défaut de perméabilité de la paroi bactérienne vis-à-vis de l antibiotique 2. Excrétion de l antibiotique 3. Inactivation de l antibiotique 4. Défaut d affinité de la cible pour l antibiotique
40 Défaut de perméabilité Origine chromosomique Résistance naturelle Bacilles à Gram négatif entériques et pénicilline, macrolides, glycopeptides Bacilles à gram négatif saprophytes (Pseudomonas) et tous les antibiotiques Anaérobies et streptocoques / aminosides Résistance acquise Pseudomonas aeruginosa / imipénème Entérobactéries / B-lactamines, quinolones, cotrimoxazole, cyclines, chloramphénicol
41
42 Excrétion de l antibiotique Systèmes d efflux naturels chromosomiques Excrètent de nombreux substrats (antibiotiques...) Production normale => résistance naturelle Hyperproduction => résistance acquise
43 Hypothetical model of efflux systems in P.aeruginosa Nikaido J. Bacteriol ,
44 Pompes d efflux bactériennes H + H + H + substrate substrate substrate ATP ADP substrate MFS SMR ABC RND
45 Inactivation de l antibiotique Exemple des B-lactamases Mécanisme le plus fréquent Enzymes qui hydrolysent les β-lactamines ( )
46 Inactivation de l antibiotique Exemple des B-lactamases Origine chromosomique => R naturelle aminopénicillines (céphalosporines) Gram - : Klebsiella (classe A) Enterobacter, Serratia, Pseudomonas, Acinetobacter (classe C) Gram + : Bacillus, Nocardia Origine chromosomique => R acquise aux C3G Enterobacter, Serratia, Pseudomonas, Acinetobacter (classe C) : hyperproduction par mutation Origine plasmidique => R acquise aux pénicillines entérobactéries, Pseudomonas, Acinetobacter, gonocoque, Haemophilus classe A ex TEM-1, classe D oxacillinases) Origine plasmidique : R acquise aux, céphalosporines (y compris C3G) et aztréonam entérobactéries, Pseudomonas, Acinetobacter (BLSE classe A ex TEM-3, SHV-2, CTX...) Origine plasmidique : R acquise pénicillines céphalosporines (y compris C3G) et aux pénèmes entérobactéries, Pseudomonas, Acinetobacter (imipéménases classe A, métalloblactamases classe B)
47 Défaut d affinité de la cible Origine chromosomique Résistance naturelle Entérobactéries et cefsulodine Bactéries à Gram positif et aztréonam Streptocoques, mycobactéries et anaérobies et quinolones Résistance acquise Toutes espèces et quinolones, rifampicine Gène étranger : résistance acquise Staphylocoques et B-lactamines Pneumocoque et B-lactamines Résistance aux macrolides (méthylation ribosome)
48 Relation entre les CMI et l inhibition du surenroulement de l ADN gyrase de M.tuberculosis par les quinolones CI50 (mg/l) Gat Sit Spx Gré Ofl Lév Mox Cip Cli Tro Flé Eno Pe Tem Tos Nor BMS Gém Oxo Nal Pip R 2 = 0,9 0, CMI (mg/l) Flu
49 Résistance acquise du pneumocoque aux B-lactamines - Résistance par gènes étrangers intégrés au chromosome - transformation de morceaux de gènes codant pour des PLP de faible affinité (gènes mosaïques) provenant d autres streptocoques commensaux) niveaux de résistance et cractère croisé entre b-lactamines imprévisibles (CMI ampi, C3G)
50 Pneumocoque : résistance acquise Définition de la moindre sensibilité et de la résistance au béta-lactamines chez le pneumocoque : Pénicilline G : S < 0,125mg/l 0,1 I 1mg/l R > 1mg Amoxicilline : S 0,5mg/l R > 2mg/ Cefotaxime : S 0,5mg/l R> 2mg/l
51 Mecanismes de resistance aux quinolones chez les entérobactéries Modification des cibles : gyra... Efflux Diminution de la perméabilité Qnr gyrase topoisomerase IV Protection des cibles : qnr N-acetyl- Acétylation
52 Retombées pratiques au laboratoire de l étude de la résistance Test moléculaire pour la détection de la résistance acquise Prévention de l acquisition de la résistance Surveillance et Epidémiologie de la résistance Aide au choix thérapeutique Alerte de santé publique
53 Mécanisme de résistance à la rifampicine chez Mycobacterium tuberculosis Mutations ponctuelles dans la région * de rpob, codant la sous-unité b de l ARN polymérase Leu Gln Asp Ser His Ser Leu Pro Pourcentage des mutations Leu Pro Tyr Val Leu Tyr Asp Arg Leu Leu Trp parmi souches Rif-R 10% 35% 45% Pro *numérotation des codons utilisée chez E.coli Telenti 1993, Honore 1993, Williams 1994 et 1998, Musser 1995, 1998
54 Nombre de cas de tuberculose multirésistante en France et Ile de France : Cas / an France Ile de France année
55
56
57 Sélection* in vivo de mutants résistants lors du traitement par fluoroquinolones * Dépend de l espèce bactérienne, de la souche, la taille de la population bactérienne, de la localisation de l'infection, de l'état des défenses immunitaires
58 Etapes d acquisition de la résistance aux quinolones chez E. coli CMI [mg/l] Ciprofloxacine acide nalidixique sauvage Mécanisme (mutation) Nal R 2 1,024 Cip I Mutant 1ère étape Mutant 2ème étape mutation ADN gyrase (gyra ou gyrb) Efflux ou pénétration (acrb ou marr) 64 >2,048 Cip R Mutant 3ème étape 2ème mutation gyrase ou topoisomérase IV (parc ou pare)
59 Quinolones E.coli sauvage
60 Quinolones E.coli mutant accumulation
61 Quinolones E.coli mutant gyra
62 Quinolones E.coli mutant gyra + parc
63 Quinolones E.coli mutant 2 gyra + parc
64 E.coli Susceptibility to Ciprofloxacin Network : REUSSIR (9,767 strains, 1998) 500 Nal S Nal R 400 N strains diameters in mm
65 Sensibilité à la ciprofloxacine (diamètres en mm) des souches de E. coli résistantes à l acide nalidixique Pitié-Salpêtrière hospital, Paris
66 Sensibilité à la ciprofloxacine (CMI en mg/l) des souches de E. coli résistantes à l acide nalidixique E.coli 1992 (n=66) E.coli 1998 (n=100) 20 S I R Nombre de souches ,015 0,03 0,06 0,12 0,25 0, CMI Robert et al. CMI 2001, 7:1-9
67 Prévention de la résistance ex. Quinolones Modèle des antibiotiques pour lesquels la résistance est acquise par sélection de mutant résistant : Pas de monothérapie sur staphylocoques, streptocoques, pyocyanique, Acinetobacter, mycobactéries, entérobactéries nal-r Résistance croisée entre les différentes quinolones Utiliser la quinolone la plus active sur la bactérie en cause et à une posologie élevée (Cmax /CMI > 10 ou AUC/CMI > 100)
68 Une menace SARM-PVL
69 SARM PVL : enquête rétrospective ONERBA SARM Profil PVL 21 (0.8%) 17 (0.8%) 9 (0,7%) Souches disponibles Souches PVL profil PGFE France autres profils PFGE 2 (USA) 0 0 Robert CMI 2005
70 SARM PVL : enquête prospective France 2004 Laboratoires de ville (n=21) Laboratoires hospitaliers (n=38) Total : 59 laboratoires
71 SARM PVL : enquête prospective France résultats Total Hôpital Ville N % N % N % S. aureus SARM 3901 (28.2) 3249 (29.2) 652 (24.0) Profil PVL 56 (1.4) 55 (1.7) 1 (0.1) PVL + 48* 47 1 * 6 souches non testées : 1,7% de ~ cas de SARM dans les hôpitaux = ~ 1000 cas de SARM PVL/an
72
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