Bio Tech World 2007 «Quelles biotechnologies pour les pays du Sud?» Novembre, Oran, Algérie

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1 Optimisation de la production de la protéase acide par Penicillium camemberti sur milieux à base de lactosérum par la méthode du plan composite centré de Box-Wilson BENLOUNISSI Aïcha et *MECHAKRA-MAZA Aïcha Laboratoire de Biologie et Environnement. Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie, Université Mentouri Constantine, Algérie. * Résumé Penicillium camemberti, une moisissure fromagère, synthétise des enzymes protéolytiques jouant un rôle majeur dans les processus d affinage des fromages à pâte molle et à croûte fleurie. Parmi ces enzymes, la protéase acide représente l activité majeure. La production de la protéase acide (aspartylprotéase) par Penicillium camemberti à été réalisée sur milieu à base de lactosérum. Elle est liée à la présence de 3 facteurs préalablement sélectionnés. Les optima de ces facteurs sont déterminés par le plan composite centré de Box-Wilson. Les fermentations menées selon ce plan permettent une production maximale d enzyme de 7763 unités. L analyse statistique permet le calcul des optima des 3 facteurs et fait ressortir une corrélation significative entre la production de l aspartyl protéase et l addition de trypticase et de sels minéraux. Mots clés: Aspartyl protéase, Penicillium camemberti, optimisation, plan composite centré. Optimization of the acid protease production by Penicillium camemberti on whey medium using the Box-Wilson design model Abstract : Penicillium camemberti, a cheese mould, synthetizes proteolytic enzymes who play a major role in the processes of soft cheeses repining. Among these enzymes, the acid protease represents the major activity. The production of the acid protease (aspartyl-protease) by Penicillium camemberti is accomplished on whey basic medium. It is linked to the presence of 3 beforehand chosen factors. Optimum of these factors is determined by the Box and Wilson composite centered design. Fermentation realized according to this design allows a maximum enzyme production of 7763 units. The statistical analysis permits the counting the optimum of the 3 factors ; it shows a significant correlation between the production of the aspartyl-protease and the addition of trypticase and mineral salts. Key-words: Aspartyl-protease, Penicillium camemberti, optimization, centred composite design. Introduction Penicillium Camemberti possède un système protéolytique bien caractérisé. Son rôle est l accélération et la maîtrise des processus d affinage, en effet, la saveur et l arôme des fromages résultent de leur action (Lenoir et coll., 198). Différents types de plans d expériences sont utilisés en biologie. Dans le domaine des biotechnologies, ils permettent l optimisation de la production d enzymes par les microorganismes. Ces méthodes permettent de faire varier plusieurs facteurs à la fois, de manière à 1

2 étudier leurs effets sur les paramètres à étudier (Cochran et Cox, 199). Materiel et méthodes Matériel biologique et conditions de culture La souche de Penicillium camemberti ('I.N.A.- PG, France) est repiquée et sporulée sur gélose inclinée de PDA. Le milieu de base est du lactosérum dilué et tamponné par du tamponphosphate à ph 4 (v:/v) puis stérilisé. La supplémentation est réalisée avec deux types de composés: bio-trypticase et minéraux (magnésium et fer). Le milieu est réparti en erlenmeyers, stérélisé puis ensemencé à l aide d une suspension de spores à raison de 10 5 spores/ml de milieu. L incubation est faite à 0 C pendant 11 jours avec une agitation à 00 tours/min. Méthode d optimisation Le plan d'expériences adopté est un plan composite centré isovariant (de BOX et WILSON) (Cochran et Cox,199) permettant la détermination des optima de trois facteurs [trypticase, (FeSo 4 et MgSo 4 ) et lactose] sélectionnés dans une étude précédente (MECHAKRA et coll., 1999). Le plan donne une matrice à 17 expériences (voir tableau 1) qui permet d exprimer l effet des facteurs X 1, X et X 3 sur la production de l enzyme sous forme d une équation du second degré. Ce plan permet d étudier chaque facteur à 5 niveaux (Tableau ). Tableau 1 : Plan composite centré à 3 facteurs. N d essai X1 X X α α α α α α Les coefficients de régression sont déterminés par un programme statistique (MINITAB version 13., 000). Les résultats sont traités par le programme statistique (STATISTICA version 5.0, 97 éd.). Mesure de l activité enzymatique L activité de l Aspartyl-protéase est mesurée à ph 4.0 avec comme substrat la caséine (Mechakra et al, 1999).

3 Tableau : Relation entre les niveaux codés et les niveaux réels utilisés dans le plan composite centré à 3 facteurs. Facteurs (g/l) Niveaux -α α (-1,68) (+1,68) X 1 : trypticase 1, ,41 X : FeSo 4 0,0066 0,01 0,015 0,0 0,03 MgSo 4 0,33 0,5 0,75 1 1,17 X 3 : lactose 16, , ,5 X= (valeur réelle - valeur au niveau 0) Pas Résultats Les résultats des différents essais sont groupés dans le tableau n 3. Ce tableau fait apparaître l activité maximale dans le milieu correspondant à l essai n 13 (7763 u.) et l activité minimale dans l essai n 3 (386 u.). Tableau 3 : Résultats de l activité protéolytique selon le plan composite centre de Box- Wilson N d essai Réponse Y L'analyse statistique de ces résultats a permis le calcul des coefficients de régression et de détermination, les écarts-types, la statistique de Fischer et la probabilité (tableau 4), ainsi que la détermination des positions des extrema des trois facteurs et le développement du modèle quadratique suivant : Y= X X X 3 93X X X X 1 X X 1 X X X 3 Le calcul des dérivés partielles de cette équation permet la détermination des positions des extrema des trois facteurs. Le point stationnaire est X 0 qui correspond aux valeurs réelles suivantes. X 1 0 = 0.9 X 0 = X 0 =.4 x 10 - X 3 0 = X 1 : 1,14g de trypticase par 100 ml de milieu de culture; 3

4 - X : (0,0015g de FeSo 4 et 0,076g demgso 4 ) par 100 ml de milieu de culture ; - X 3 : 3,45g de lactose par 100ml de milieu de culture. Tableau 4 : Analyse statistique des résultats Coef. SE Coef. T P Constante A B C A*A B*B C*C A*B A*C B*C Coef : coefficient de régression ; SE Coef. : écarts-types, T : statistique de Fischer ; P : probabilité Les surfaces de réponse sont représentées en trois dimensions (figure 1). Elles montrent que les deux facteurs, trypticase et minéraux mis ensembles, favorisent la production de la protéase acide par Penicillium camemberti. Les optima de ces facteurs sont situés dans les intervalles des valeurs utilisées dans le cadre du plan d'expériences. Par contre, le facteur X3 (le lactose) est situé à l'extérieur de l'intervalle des valeurs choisies. Surface Plot of Y vs B; A Hold Values C Y A 0 B Figure n 1: Polynôme tridimensionnel de l effet de la trypticase et du (FeSO 4 +MgSO 4 ) sur l activité protéolytique 4

5 Conclusion L optimisation de la production de l aspartylprotéase par Penicillium camemberti à l aide du plan composite centré de Box et Wilson confirme l importance de la presence des sources azotée et carbonée et des minéraux. Elle a permis de calculer les correlations de 3 facteurs ayant un effet significatif sur la synthèse de l enzyme (la trypticase, le lactose et les minéraux) et la determination de leurs optima. Références bilbliographiques Auberger B., Lamberet G., Lenoir J Les activités enzymatiques de Penicillium camemberti. Sc. Alim., 5 ; Cochran, W.G., Cox, G.M., 199- Experimental designs, nd ed., New York, John Wiley & sons, Inc., p. 44-9; Lenoir J., Auberger B., 198. Action des protéases de Penicillium caseicolum sur les caséines et les caillés de fromagerie. In DUPUY, (P.), Utilisation des enzymes en technologie alimentaire. C.R. 1 e Cong. Int. Lait, Tec. Doc. Lavoisier, Paris ; Mechakra A., Auberger B., Remeuf F., Lenoir J (1999). Optimisation d un milieu de culture pour la production d enzymes protéolytiques acides par Penicillium camemberti. Sc. Aliments 19(6),