TABLE DES MATIERES AVANT-PROPOS..19 ABREVIATIONS RESUME.23 ABSTRACT...24 INTRODUCTION..25 ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE...31
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- Geoffroy St-Georges
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1 TABLE DES MATIERES Page AVANT-PROPOS..19 ABREVIATIONS.. 21 RESUME.23 ABSTRACT...24 INTRODUCTION..25 ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE Le diabète et la rétinopathie diabétique I. Le diabète sucré et ses complications Le diabète sucré Le diabète insulino-dépendant Le diabète non insulino-dépendant Les complications liées au diabète Les complications aiguës Les complications chroniques Les complications macrovasculaires Les complications microvasculaires
2 II. La rétinopathie diabétique: altération des microvaisseaux rétiniens Structure et fonction des microvaisseaux rétiniens La rétine Les microvaisseaux rétiniens Altération de la structure et de la fonction des microvaisseaux rétiniens au cours du diabète Altérations cellulaires Les pericytes Les cellules endothéliales Les cellules circulantes Les cellules de la rétine neuronale...44 III. La rétinopathie diabétique: mécanismes physiopathologiques L'hypothèse hémodynamique Les hypothèses biochimiques La voie des polyols Activation de la protéine kinase C Voie de l'hexosamine L'augmentation du stress oxydant Production accrue de radicaux libres au cours du diabète et de la rétinopathie Altération des défenses anti-oxydantes au cours du diabète et de la rétinopathie Augmentation des marqueurs du stress oxydant au cours du diabète et de la rétinopathie Implication du stress oxydant dans le diabète et la rétinopathie? La formation des produits avancés de glycation (AGEs) Formation des AGEs Caractérisation des AGEs Cibles de la glycation au cours du diabète AGEs et rétinopathie diabétique La mitochondrie: le lien unificateur?
3 Les glycosphingolipides I. Structure et localisation Structure Classification et nomenclature Localisation Localisation tissulaire Localisation cellulaire...72 II. Métabolisme La biosynthèse Schéma de biosynthèse Localisation intracellulaire de la biosynthèse Le catabolisme Régulation du métabolisme Disponibilités des substrats Régulation des enzymes au niveau transcriptionnel Régulation des enzymes au niveau post-transcriptionnel Autres facteurs de régulation...83 III. Fonctions Reconnaissance cellulaire Reconnaissance par des glycoprotéines Modulation des récepteurs intégrines Interactions entre glycosphingolipides Interactions avec certaines toxines, bactéries ou virus Modulation de la signalisation transmembranaire Récepteurs à canaux ioniques Récepteurs tyrosine-kinases Modulation de la protéine kinase C Prolifération cellulaire Apoptose Autres fonctions
4 IV. Glycoconjugués et diabète Glycoprotéines et diabète Glycosphingolipides et diabète Glycosphingolipides et auto-immunité Glycosphingolipides et microangiopathie diabétique Autres implications des glycosphingolipides dans le diabète...98 MATERIEL ET METHODES.99 I. Matériel Réactifs Appareils II. Animaux Induction du diabète chez les rats Sacrifice des animaux et prélèvement des rétines Purification des microvaisseaux des rétines III. Cultures cellulaires Culture des pericytes rétiniens de bœuf (BRP) Culture de cellules endothéliales rétiniennes de bœuf (BREC) Modification des conditions de culture Incubation avec différents agents Cinétique des effets des AGEs Effets de l'état de confluence des cellules Sevrage des cellules IV. Analyse des glycosphingolipides Marquage métabolique des glycosphingolipides des cellules microvasculaires Extraction et séparation des différentes classes lipidiques Pour les cellules microvasculaires et les microvaisseaux Pour les rétines
5 4.3. Analyse par chromatographie sur couche mince haute performance (HPTLC) Migration Révélation Analyse des plaques d'hptlc Analyse des gangliosides par chromatographie liquide haute pression (HPLC) V. Purification du GM3 à partir de la rate de boeuf VI. Analyse des acides gras du GM3 des cellules microvasculaires Purification du GM Obtention des acides gras Dérivation Analyse par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS) VII. Dosages biochimiques Dosage des protéines Dosage de la sphingosine Dosage du glucose sanguin Mesure du stress oxydant VIII. Dosages d'activités enzymatiques Dosage des activités α2,3 et α2,8-sialyltransferase (GM3 et GD3-synthase) Détermination des paramètres cinétiques de l'α2,8-sialyltransferase (GD3- synthase) Activité enzymatique en fonction du temps d'incubation Détermination des paramètres cinétiques pour le CMP-acide N-acétyl neuraminique Détermination des paramètres cinétiques pour le GM IX. Techniques de biologie moléculaire Séquençage d'un fragment de l'adnc de l' α2,8-sialyltransferase Dessin des amorces
6 Extraction des ARNm des cellules Transcription inverse à partir des amorces spécifiques Purification de la RT-PCR Séquençage Technique de PCR quantitative...erreur! Signet non défini Choix des paires d'amorces Extraction des ARN des cellules Transcription inverse PCR quantitative X. Analyse statistique des résultats XI. Récapitulatif des techniques utilisées RESULTATS-DISCUSSION. 137 Première partie:analyse des glycosphingolipides des cellules microvasculaires rétiniennes dans un environnement normal et diabétique.139 I. Choix techniques Culture de cellules microvasculaires rétiniennes Comparatif de différentes techniques d'analyse des glycosphingolipides HPTLC avec révélation colorimétrique HPTLC avec révélation fluorimétrique HPTLC avec révélation immunologique HPTLC avec marquage métabolique des glycosphingolipides au 14 C HPLC Conclusion
7 II. Profil des glycosphingolipides présents dans les cellules microvasculaires rétiniennes Composition des cellules microvasculaires rétiniennes en glycosphingolipides neutres Composition des cellules microvasculaires rétiniennes en gangliosides Profil des acides gras du GM3 des cellules microvasculaires rétiniennes Discussion III. Effets d'un environnement diabétique sur les glycosphingolipides des cellules microvasculaires rétiniennes Effets d'une forte concentration de glucose Effets des AGEs faiblement modifiés Effets des AGEs fortement modifiés Effets des AGEs fortement modifiés sur les glycosphingolipides des cellules microvasculaires rétiniennes Cinétique des effets des AGEs fortement modifiés sur les glycosphingolipides des pericytes Effets des AGEs fortement modifiés sur les acides gras du GM3 des cellules microvasculaires rétiniennes Discussion Deuxième partie: effets des AGEs sur les glycosphingolipides des pericytes rétiniens: recherche des mécanismes mis en jeu et des conséquences biologiques..175 I. Effets des AGEs fortement modifiés sur les enzymes de biosynthèse des glycosphingolipides Effet des AGEs sur la GD3-synthase des pericytes Effets des AGEs sur l'activité de la GD3-synthase Effets des AGEs sur l'expression de la GD3-synthase Effets des AGEs sur l'activité de la GM3-synthase des pericytes Discussion
8 II. Mécanismes impliqués dans les effets des AGEs sur le métabolisme des glycosphingolipides: implication du stress oxydant? Effets des AGEs sur le stress oxydant Effets de différents antioxydants Induction d'un stress oxydant Discussion III. Effets biologiques des modifications des glycosphingolipides: modification de la prolifération? Corrélations entre modifications de la quantité de cellules et modifications des glycosphingolipides Influence de l'état de confluence des pericytes sur les gangliosides Ajout de GM3 exogène et incidence sur la quantité de cellules Discussion Troisième partie: incidence du diabète sur les glcosphingolipides rétiniens "in vivo" I. Etude des glycosphingolipides de la rétine de rats diabétiques Caractéristiques des animaux Analyse des sphingolipides et des glycosphingolipides neutres Analyse des gangliosides II. Etude des glycosphingolipides de microvaisseaux rétiniens d'animaux diabétiques Purification des microvaisseaux rétiniens Gangliosides des microvaisseaux rétiniens Discussion CONCLUSIONS - PERSPECTIVES REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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