Manuel du kit Investigator Quantiplex

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1 Octobre 2012 Manuel du kit Investigator Quantiplex Pour la quantification de l ADN humain dans les échantillons médicolégaux Sample & Assay Technologies

2 Technologies d échantillons et d analyses QIAGEN QIAGEN est le premier fournisseur de technologies novatrices d échantillons et d analyses, permettant d isoler et de détecter le contenu de n importe quel échantillon biologique. Nos produits et services ultramodernes de grande qualité garantissent un succès total, de l échantillon jusqu au résultat. QIAGEN fixe les normes en matière de : purification d ADN, d ARN et de protéines ; analyses d acides nucléiques et de protéines ; recherche micro-arn et interférence ARN ; automatisation des technologies d échantillons et d analyses. Notre mission est de permettre à notre clientèle de réussir et d accomplir des progrès décisifs. Pour plus d informations, visiter

3 Table des matières Contenu du kit 4 Stockage 4 Utilisation prévue 4 Informations de sécurité 4 Introduction 6 Principe et procédure 6 Description des protocoles 10 Équipement et réactifs devant être fournis par l utilisateur 11 Remarques importantes 12 Choix des kits et des protocoles 12 Risques de contamination 12 Témoins 12 Protocoles Quantification d ADN sur Rotor-Gene Q 14 Quantification d ADN sur le thermocycleur Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System 34 Quantification d ADN sur le thermocycleur Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System for Human Identification 46 Quantification d ADN sur le thermocycleur Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System 61 Interprétation des résultats 73 Résolution des principaux problèmes rencontrés 76 Références 80 Pour commander 81 Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012 3

4 Contenu du kit Kit Investigator Quantiplex (200) Référence Nombre de réactions de 25 µl 200 Reaction Mix FQ (Mélange réactionnel FQ) 2 x 1,15 ml Primer Mix IC FQ (Mélange d amorces IC FQ) ADN témoin Z1 (20 ng/µl) QuantiTect Nucleic Acid Dilution Buffer (Tampon de dilution des acides nucléiques QuantiTect) 2 x 1,15 ml 0,2 ml 1 flacon Manuel 1 Stockage Stocker le Reaction Mix FQ (Mélange réactionnel FQ), le Primer Mix IC FQ (Mélange d amorces IC FQ) et l ADN témoin Z1 entre 2 et 8 C. Éviter de congeler les composants de ce kit. Stocker le QuantiTect Nucleic Acid Dilution Buffer (Tampon de dilution des acides nucléiques QuantiTect ) à 20 C. Éviter la congélation et la décongélation répétées. Le Primer Mix IC FQ (Mélange d amorces IC FQ) doit être tenu à l abri de la lumière. Il convient de stocker les échantillons d ADN séparément des réactifs de PCR. Dans ces conditions, les composants sont stables jusqu à la date limite d utilisation figurant sur le kit. Utilisation prévue Le kit Investigator Quantiplex est prévu pour des applications de biologie moléculaire dans les domaines des analyses médicolégales, de la recherche d identité et de la recherche de paternité. Ce produit n est pas destiné au diagnostic, à la prévention ni au traitement d une maladie. Les produits doivent être manipulés avec le plus grand soin et la plus grande attention. Nous recommandons à tous les utilisateurs des produits QIAGEN de respecter les recommandations NIH concernant les expériences relatives à l ADN recombiné, ou toute autre recommandation applicable. Informations de sécurité Lors de la manipulation des produits chimiques, toujours porter une blouse de laboratoire, des gants jetables et des lunettes de protection adéquats. Pour plus d informations, veuillez consulter les fiches de données de sécurité (FDS) appropriées. Elles sont disponibles en ligne au format PDF (pratique et 4 Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012

5 compact) à l adresse où il est possible de trouver, consulter et imprimer les FDS pour chaque kit et élément de kit QIAGEN. Informations d urgence 24 heures sur 24 Des informations médicales d urgence en anglais, français et allemand peuvent être obtenues 24 heures sur 24 auprès du : Centre d information Antipoison, Mayence, Allemagne Tél. : Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012 5

6 Introduction L identification humaine repose généralement sur l analyse de marqueurs microsatellites (STR), de polymorphismes mononucléotidiques (SNP) ou de polymorphismes insertion/délétion (DIP), selon la demande d examen ou la qualité de l échantillon. Ces analyses multiplexes sont complexes et nécessitent l utilisation d une plage de matrices définie. Le kit Investigator Quantiplex a été développé pour la quantification de l ADN génomique humain dans un échantillon par PCR quantitative en temps réel. Le kit a pour but de confirmer la présence d une quantité suffisante d ADN dans un échantillon afin de permettre une analyse des empreintes génétiques (telle que l analyse des STR, des DIP et des SNP) et d y établir la présence d inhibiteurs susceptibles d interférer avec ce genre d applications, indiquant dans ce cas la nécessité d une purification supplémentaire de l échantillon. Principe et procédure Le kit Investigator Quantiplex est un kit de détection de l ADN humain par PCR prêt à l emploi. Il permet une quantification rapide et fidèle de l ADN humain dans les échantillons des bases de données médicolégales et lors d enquêtes. La sensibilité de l analyse atteint une valeur < 1 pg/µl, avec une quantification fidèle de moins de 4,9 pg/µl, valeur pour laquelle la courbe standard est linéaire. Le kit contient des réactifs et de l ADN polymérase pour l amplification spécifique d une région exclusive de 146 pb présente sur plusieurs autosomes du génome humain (brevet en instance) et la détection de produits de PCR spécifiques sur les cycleurs thermiques en temps réel Rotor-Gene Q ou Applied Biosystems La région cible de quantification de l ADN humain a été sélectionnée pour fournir une grande sensibilité et une grande fiabilité de résultats parmi différents individus et différentes populations. Elle a été validée au cours d une étude indépendante par plusieurs laboratoires de médecine légale qui ont analysé le maintien du nombre de copies parmi la population humaine. Une PCR quantitative en temps réel a été réalisée afin de comparer une seule copie humaine spécifique aux nombreuses copies de la cible du kit Investigator Quantiplex. Dans les deux cas, la valeur de Delta-C T était comparable au sein de différentes populations et pour les échantillons d ADN issus d hommes et de femmes, ce qui prouve le maintien du nombre de copies cible entre les genres et entre les groupes ethniques. La région cible de quantification de l ADN humain est détectée par le canal vert du Rotor-Gene Q ou le canal à colorant FAM des appareils Applied Biosystems. De plus, le kit Investigator Quantiplex contient un témoin interne d amplification équilibré qui sert à valider l amplification et à détecter les inhibiteurs de PCR. Ce témoin d amplification hétérologue est détecté sous forme d un témoin interne (IC) de 200 pb par le canal jaune du Rotor-Gene Q ou le canal à colorant VIC des appareils Applied Biosystems. 6 Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012

7 L amplification est détectée à l aide d amorces Scorpions et d une réaction chimique de PCR rapide innovante. Les amorces Scorpions sont des molécules bifonctionnelles qui contiennent une amorce de PCR liée par liaison covalente à une sonde (Figure 1). Le fluorophore de cette sonde réagit avec un désactivateur, également présent sur la sonde, qui réduit la fluorescence. Au cours de la PCR, lorsque la sonde se lie aux produits de PCR, le fluorophore et le désactivateur sont séparés. On observe alors une augmentation de la fluorescence dans le tube de réaction. Sonde Fluorophor Désactivateur Bloqueur de PCR Amorce Sonde Amorce ADN polymérase Amorce Amorce Sonde Amorce Figure 1. Amorces Scorpions et leur rôle. Les amorces Scorpions sont connues pour leur hybridation rapide avec la séquence cible par une réaction intramoléculaire (Whitcombe, 1999). Cette Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012 7

8 réaction chimique a été optimisée avec soin afin de rendre le mécanisme encore plus rapide. Témoin interne Le témoin interne (IC) est amplifié et détecté par le canal jaune du Rotor-Gene Q ou le canal à colorant VIC des appareils Applied Biosystems. Le fluorophore peut être détecté avec l étalonnage actuel du canal VIC. Le témoin interne est volontairement plus sensible aux inhibiteurs que la cible de quantification humaine. La comparaison de la valeur C T du témoin interne utilisé avec les ADN étalons avec les valeurs C T du témoin interne utilisé avec des échantillons inconnus peut fournir une indication de l inhibition potentielle de la réaction dans les échantillons inconnus. Par conséquent, même si le témoin interne indique la présence d inhibiteurs dans l échantillon, la quantification d ADN fournit généralement un résultat fiable. La présence d inhibiteurs dans l échantillon peut affecter les applications en aval et doit être prise en compte. L amplification réussie du témoin interne génère une valeur C T d environ 31*. On peut s attendre à une variation de ±1 des valeurs C T du témoin interne pour les échantillons utilisés pour la courbe standard. L utilisation d une grande quantité d ADN humain (> 150 ng/réaction) peut fournir une valeur C T plus élevée pour le témoin interne. Une validation par le laboratoire avec des inhibiteurs pertinents est recommandée afin de déterminer les critères de détection de l inhibition. Reaction Mix FQ (Mélange réactionnel FQ) La formule unique du Reaction Mix FQ (Mélange réactionnel FQ) contient une ADN polymérase et un tampon de réaction. La réaction chimique de PCR innovante et l enzyme, spécifiquement développées pour l identification humaine, présentent une sensibilité et une vitesse de réaction élevées. La nouvelle formule du mélange d enzyme et de tampon de réaction favorise un mécanisme d action rapide des amorces Scorpions. De plus, le tampon de PCR contient l additif Q-Bond qui permet de réduire la durée de cycle sur les thermocycleurs classiques et les thermocycleurs rapides à vitesse de chargement élevée. Le Q-Bond renforce l affinité entre l ADN polymérase et les courts segments d ADN monobrin, ce qui réduit le temps nécessaire à l hybridation entre l amorce et la sonde à quelques secondes seulement. De plus, la composition unique du tampon favorise la fusion de l ADN, ce qui réduit les durées de dénaturation et d hybridation/élongation. Le Reaction Mix FQ (Mélange réactionnel FQ) est également dérivé du tampon de PCR unique de QIAGEN. Le tampon contient du KCl et du NH 4 Cl en quantités équilibrées, ce qui permet l obtention d un rapport élevé de liaisons * Cette valeur peut varier selon l appareil utilisé. 8 Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012

9 spécifiques d amorce sur les liaisons non spécifiques d amorce au cours de l étape d hybridation de chaque cycle de PCR. Les conditions stringentes d hybridation de l amorce ainsi créées entraînent une plus grande spécificité de la PCR. ADN témoin et courbe standard Les étalons de quantification d ADN sont très importants pour une analyse fidèle. L utilisation de dilutions en série au 1/4 et d une courbe standard à 7 points de concentration est fortement recommandée pour chaque analyse. Afin de garantir la précision du pipetage, il convient que le volume d entrée d ADN minimal pour les dilutions soit de 10 µl. La courbe standard est facilement réalisable avec des dilutions en série au 1/4. Stockées entre 2 et 8 C, les dilutions de l ADN témoin Z1 réalisées avec le QuantiTect Nucleic Acid Dilution Buffer (Tampon de dilution des acides nucléiques QuantiTect) restent stables pendant au moins une semaine. IMPORTANT : L ADN témoin Z1 est optimisé uniquement pour une utilisation avec le kit Investigator Quantiplex. Modèles pour le travail de routine Afin de simplifier la configuration de l appareil et l analyse des résultats sur le thermocycleur Rotor-Gene Q, le thermocycleur en temps réel Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System, le thermocycleur en temps réel pour identification humaine Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System for Human Identification, et le thermocycleur 7500 Fast Real-Time PCR System, QIAGEN a développé une série de fichiers de modèles téléchargeables à partir de l onglet «Resources» de la page Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012 9

10 Tableau 1. Modèles de fichiers pour Rotor-Gene Q Modèle de fichier Objectif «Investigator Quantiplex Kit Cycling» Protocole de préréglage du cycle «Investigator Quantiplex Kit Sample» Nom de l échantillon, type d échantillon et concentration pour la courbe standard et le témoin interne «Investigator Quantiplex Kit Analysis Settings for the Yellow Channel» Paramètres C T Description des protocoles Ce manuel fournit les protocoles pour quatre cycleurs thermiques. Rotor-Gene Q Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System for Human Identification Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System 10 Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012

11 Équipement et réactifs devant être fournis par l utilisateur Lors de la manipulation des produits chimiques, toujours porter une blouse de laboratoire, des gants jetables et des lunettes de protection adéquats. Pour plus d informations, consulter les fiches de données de sécurité (FDS) appropriées, disponibles auprès du fournisseur du produit. Pipettes et cônes de pipettes Consommables exempts de nucléase (sans RNase ni DNAse) : Il convient de prendre des précautions particulières pour éviter la contamination par les nucléases de l ensemble des réactifs et consommables utilisés pour la préparation de la PCR en vue de la détection sensible d ADN humain. Refroidisseur ou glace Thermocycleurs en temps réel (Rotor-Gene Q, Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System, Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System for Human Identification ou Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System) Tubes ou plaques de PCR (utiliser les tubes à paroi fine ou les plaques de PCR recommandés par le fabricant du thermocycleur.) Pour Rotor-Gene Q, les rangées de tubes et de bouchons de 0,1 ml (référence ou ) ou le Rotor-Disc 72 (référence ou ) sont recommandés. Des tubes de 0,2 ml (référence ou ) peuvent également être utilisés. Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/

12 Remarques importantes Choix des kits et des protocoles Ce manuel contient les protocoles et les recommandations relatives à la quantification d ADN à l aide des appareils énumérés dans le Tableau 2. Seuls ces thermocycleurs ont été validés par QIAGEN pour la quantification d ADN avec le kit Investigator Quantiplex. Remarque : Il est également possible de procéder à une préparation manuelle. Les protocoles validés pour le QIAgility sont disponibles gratuitement sous l onglet «User Support» de la page Tableau 2. Protocoles pour le kit Investigator Quantiplex avec différents thermocycleurs en temps réel Thermocycleur en temps réel Protocole Rotor-Gene Q Page 14 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System Page 34 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System for Human Identification Page 46 Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System Page 61 Risques de contamination Ne pas retirer la bandelette d étanchéité des plaques de réaction une fois l amplification terminée. Le retrait de cette bandelette augmente le risque de contamination des réactions ultérieures avec le produit amplifié. Préparer tous les mélanges réactionnels dans une zone séparée de celle utilisée pour l extraction d ADN et l analyse du produit de PCR (post-pcr) afin de minimiser le risque de contamination croisée. Utiliser également des cônes jetables munis de filtres hydrophobes afin de minimiser davantage ce risque. Témoins Témoin sans matrice d ADN (NTC) Il convient d inclure des réplicats des réactions avec le NTC à chaque cycle de quantification afin de détecter toute contamination. Le NTC doit contenir tous les composants de la réaction à l exception de la matrice. La quantification avec le kit Investigator Quantiplex est très sensible. Prendre soin d éviter la contamination lors 12 Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012

13 du pipetage du NTC. Il est recommandé d effectuer au moins deux réactions avec le NTC. Témoin interne positif Un témoin interne positif (détecté par une autre amorce Scorpions marquée différemment) est utilisé pour contrôler si l amplification a réussi et pour rechercher la présence d inhibiteurs de la PCR. L amorce, l amorce Scorpions et la matrice nécessaires au témoin interne sont comprises dans le Primer Mix IC FQ (Mélange d amorces IC FQ). Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/

14 Protocole : Quantification d ADN sur Rotor-Gene Q Ce protocole est optimisé pour une utilisation du kit Investigator Quantiplex sur Rotor-Gene Q. Remarques importantes avant de commencer Préparer tous les mélanges réactionnels dans une zone séparée de celle utilisée pour l extraction d ADN et l analyse du produit de PCR (post-pcr). Utiliser des cônes jetables munis de filtres hydrophobes afin de minimiser le risque de contamination croisée. Toujours respecter les conditions de cycle spécifiées dans le protocole. Le cycle est optimisé pour cette analyse. Toujours respecter le volume de matrice spécifié dans le protocole. La réaction est optimisée pour un volume de matrice d ADN de 2 µl. Ne pas utiliser plus ni moins de 2 µl par réaction de 25 µl. Il est recommandé d utiliser un rotor à 72 puits. Les dilutions des étalons de quantification d ADN dans le QuantiTect Nucleic Acid Dilution Buffer (Tampon de dilution des acides nucléiques QuantiTect) peuvent être stockées à 4 C pendant au moins une semaine. Les paramètres d analyse doivent être optimaux pour obtenir des données de quantification fidèles. Toujours régler à nouveau les paramètres d analyse (c est-à-dire paramètres de la ligne de base et valeurs seuils) pour l analyse de tous les canaux à colorants rapporteurs de tous les cycles. Avant de commencer Télécharger les modèles de fichiers «Investigator Quantiplex Kit Cycling», «Investigator Quantiplex Kit Sample» et «Investigator Quantiplex Kit Analysis Settings for the Yellow Channel» à partir de l onglet «Resources» à l adresse 14 Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012

15 Procédure 1. Décongeler l ADN témoin Z1 et le QuantiTect Nucleic Acid Dilution Buffer (Tampon de dilution des acides nucléiques QuantiTect). Homogénéiser soigneusement toutes les solutions avant usage afin d éviter les différences de concentration en sel. Ne pas décongeler l ADN témoin Z1 à une température supérieure à la température ambiante (15 à 25 C). 2. Préparer fraîchement des dilutions en série de l ADN témoin Z1 telles que décrites au Tableau 3. Passer au vortex pendant au moins 5 s puis centrifuger chaque solution brièvement avant de prélever une aliquote pour la dilution suivante. Utiliser un cône de pipette neuf pour chaque dilution. Veiller à éviter toute contamination croisée. Tableau 3. Dilutions en série de l ADN témoin Z1 Dilution en série de l ADN témoin Z1 ADN témoin Z1 Tampon de dilution des acides nucléiques QuantiTect 20 ng/µl ADN non dilué 5 ng/µl 10 µl 30 µl 1,25 ng/µl 10 µl 30 µl 0,3125 ng/µl 10 µl 30 µl 0, ng/µl 10 µl 30 µl 0, ng/µl 10 µl 30 µl 0, ng/µl 10 µl 30 µl 3. Décongeler le Reaction Mix FQ (Mélange réactionnel FQ), le Primer Mix IC FQ (Mélange d amorces IC FQ) et les matrices d acides nucléiques. Homogénéiser en retournant les tubes plusieurs fois. Homogénéiser soigneusement toutes les solutions avant usage afin d éviter les différences de concentration en sel. Ne pas décongeler le Reaction Mix FQ (Mélange réactionnel FQ) et le Primer Mix IC FQ (Mélange d amorces IC FQ) à une température supérieure à la température ambiante (15 à 25 C). Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/

16 4. Préparer un mélange maître tel que décrit au Tableau 4. Ce mélange contient tous les composants nécessaires à la PCR à l exception de la matrice d ADN (échantillon) et de l eau exempte de nucléase. Préparer un volume de mélange maître supérieur de 10 % au volume requis pour le nombre total de réactions de PCR à réaliser. Ce nombre doit comprendre les réactions avec les témoins positif et négatif. La réaction peut généralement être préparée à température ambiante (15 à 25 C). Toutefois, il est recommandé de conserver les réactifs, les échantillons et les témoins sur de la glace ou un refroidisseur. Tableau 4. Mélange maître pour la quantification d ADN Composant Reaction Mix FQ (Mélange réactionnel FQ), 2,18 x Primer Mix IC FQ (Mélange d amorces IC FQ), 2,18 x Volume total du mélange maître Volume par réaction de 25 µl Concentration finale 11,5 µl 1 x 11,5 µl 1 x 23 µl 5. Mélanger soigneusement le mélange maître et en transférer 23 µl dans des rangées de tubes pour Rotor-Gene Q ou dans le Rotor-Disc Ajouter 2 µl de QuantiTect Nucleic Acid Dilution Buffer (Tampon de dilution des acides nucléiques QuantiTect) dans les tubes de NCT. Veiller à ce que les tubes de NCT n entrent pas en contact avec l ADN humain. 7. Ajouter 2 µl de dilution d ADN témoin ou 2 µl d ADN de l échantillon inconnu à chaque tube de PCR et mélanger soigneusement. Il est très important de bien homogénéiser afin d éviter les différences de concentration en sel et en ADN. Le Tableau 5 donne un exemple de configuration de plaque. S assurer que le mélange maître et la matrice sont parfaitement mélangés. Il est nécessaire d inclure les dilutions d ADN témoin en deux exemplaires pour chaque analyse et chaque plaque de réaction. 16 Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012

17 Tableau 5. Configuration possible de la plaque de réactions sur Rotor- Gene Q Contenu des puits , UNK 25 UNK 33 UNK 41 UNK 49 UNK 57 UNK 65 UNK , UNK 26 UNK 34 UNK 42 UNK 50 UNK 58 UNK 66 UNK , UNK 27 UNK 35 UNK 43 UNK 51 UNK 59 UNK 67 UNK , UNK 28 UNK 36 UNK 44 UNK 52 UNK 60 UNK 68 UNK 5 1, , UNK 29 UNK 37 UNK 45 UNK 53 UNK 61 UNK 69 UNK 6 1, , UNK 30 UNK 38 UNK 46 UNK 54 UNK 62 UNK 70 UNK 7 0, NTC 23 UNK 31 UNK 39 UNK 47 UNK 55 UNK 63 UNK 71 UNK 8 0, NTC 24 UNK 32 UNK 40 UNK 48 UNK 56 UNK 64 UNK 72 UNK Toutes les quantités sont exprimées en ng/µl. UNK : échantillon inconnu. 8. Fermer les tubes de PCR, les placer dans le rotor à 72 puits de Rotor- Gene Q et attacher l anneau de blocage. Si le nombre de réactions est inférieur à 72, placer des tubes de PCR vides aux emplacements libres du rotor à 72 puits. 9. Lancer le logiciel Rotor-Gene. Dans l assistant Advanced Wizard, sélectionner «Open A Template In Another Folder...» (Ouvrir le modèle dans un autre dossier) puis charger le fichier «Investigator Quantiplex Kit Cycling». Pour configurer le cycle manuellement, sélectionner le profil «Two Step» (Deux étapes) puis cliquer sur «New» (Nouveau). Afin de faciliter la configuration des réactions, il est recommandé d utiliser le modèle de fichier fourni (voir page 14 pour les consignes de téléchargement). Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/

18 Assistant Advanced Wizard du logiciel Rotor-Gene. 10. Sélectionner «72-Well Rotor» (Rotor à 72 puits) puis confirmer que l anneau de blocage est fixé en cochant la case. Cliquez sur «Next» (Suivant) pour continuer. Confirmation de la fixation de l anneau de blocage. 18 Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012

19 11. Vérifier que le volume de réaction est de 25 µl et que la case «Apply Ambient Air Correction» (Appliquer la correction pour l air ambiant) est cochée. Cliquez sur «Next» (Suivant) pour continuer. Remarque : La fonction de correction pour l air ambiant n est pas disponible sur toutes les versions du logiciel. Si elle est absente, cliquer simplement sur «Next» (Suivant) pour continuer. Saisir le volume de réaction puis cocher la case «Apply Ambient Air Correction» (Appliquer la correction pour l air ambiant), le cas échéant. 12. Cliquer sur «Edit Profile» (Modifier profil) et programmer le thermocycleur Rotor-Gene tel que décrit au Tableau 6. Voir également les figures pages 20 et 21. L acquisition des données doit être réalisée pendant l étape d hybridation/élongation. Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/

20 Tableau 6. Conditions de cycle pour Rotor-Gene Q Étape Activation initiale de la PCR Temp. Durée Nombre de cycles Commentaires additionnels 95 C 1 min La PCR exige une incubation initiale à 95 C pendant 1 minute afin d activer l ADN polymérase. Cycle à deux étapes : Dénaturation Hybridation/élongation combinées 95 C 60 C 1 s 10 s 40 cycles Recueillir les données de fluorescence à l aide des canaux vert et jaune avec une optimisation automatique du gain. Activation initiale de la PCR. La PCR exige une incubation initiale à 95 C pendant 1 minute afin d activer l ADN polymérase. 20 Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012

21 Cycle à deux étapes. 40 cycles de PCR sont nécessaires. Chaque cycle comporte 2 étapes : 95 C pendant 1 s (étape de dénaturation) et 60 C pendant 10 s (étape d hybridation/élongation). 13. Pour configurer les paramètres d optimisation du gain pour les canaux vert et jaune, sélectionner d abord le canal vert puis cliquer sur «Gain Optimisation» (Optimisation du gain) suivi de «Optimise Acquiring» (Optimiser l acquisition). Dans la boîte de dialogue qui s ouvre, confirmer les paramètres standard des deux canaux. Cliquer ensuite sur OK. 14. Cocher la case «Perform Optimisation Before 1st Acquisition» (Réaliser l optimisation avant la 1e acquisition) puis cliquer sur «Close» (Fermer). Vérifier que le tube en position 1 est rempli. C est sur ce tube qu est réalisée l optimisation du gain. Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/

22 Optimisation du gain. Optimisation de l acquisition. 22 Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012

23 Confirmation des paramètres d optimisation du gain pour le canal vert. Confirmation des paramètres d optimisation du gain pour le canal jaune. 15. Cliquer sur «Next» (Suivant) pour confirmer la configuration du profil de température et des canaux. Vérifier que tous les paramètres sont corrects. Récapitulatif des paramètres. Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/

24 16. Cliquer sur «Start run» (Lancer le cycle) pour lancer le thermocycleur Rotor-Gene. L utilisateur est invité à saisir un nom de fichier et à enregistrer le fichier de cycle. 17. Une fois le cycle lancé et en attendant qu il soit terminé, il est possible de saisir un nom et une description pour chacune des réactions. En cas d utilisation de la configuration de plaque recommandée au Tableau 5, il est également possible de se servir du fichier «Investigator Quantiplex Kit Sample» (voir page 14 pour les consignes de téléchargement). Pour charger le modèle de fichier, cliquer sur «Open» (Ouvrir) et sélectionner le modèle souhaité. Un exemple de modèle de fichier est reproduit ci-dessous. Modèle de fichier pour la création de la courbe standard. 24 Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012

25 Analyse des données Les paramètres d analyse doivent être optimaux pour obtenir des données de quantification fidèles. Toujours régler à nouveau les paramètres d analyse (c est-à-dire paramètres de la ligne de base et valeurs seuils) pour l analyse de tous les canaux à colorants rapporteurs de tous les cycles. Procédure 1. Ouvrir le fichier de cycle dans le logiciel Rotor-Gene Q. Aller à «File» (Fichier) > «Open» (Ouvrir) > «Browse» (Parcourir) pour sélectionner le fichier. 2. Avant de pouvoir créer la courbe standard, il faut définir les étalons. Si les étalons ont été définis avant le lancement d un cycle, passer à l étape 10. En cas d utilisation de la configuration de plaque recommandée au Tableau 5, il est également possible d importer le nom et le type de l échantillon ainsi que la concentration des étalons directement à partir du fichier «Investigator Quantiplex Kit Sample». Il est recommandé d utiliser ce fichier afin de simplifier la préparation des réactions. Voir page 14 pour les consignes de téléchargement. 3. Sélectionner l outil de définition des échantillons en cliquant sur «Samples» (Échantillons). Outil de définition des échantillons du logiciel Rotor-Gene Q. Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/

26 4. Il est possible de charger le fichier «Investigator Quantiplex Kit Sample» en sélectionnant «Open» puis le fichier souhaité. Modèle de fichier pour la création de la courbe standard. 5. Si le modèle de fichier n est pas chargé, définir le type d échantillon dans chaque puits à l aide du menu déroulant, par exemple, «Standard» (Étalon) pour les ADN étalons et «NTC» pour les témoins sans matrice d ADN. Définition des échantillons dans le logiciel Rotor-Gene Q. 26 Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012

27 6. Dans la colonne «Given Conc.» (Concentration donnée), saisir la concentration en ADN de l étalon et sélectionner l unité (ng/µl) dans le menu déroulant. Saisir le nom de l échantillon (par exemple, ADN témoin Z1 20 ng/µl). Choix des unités dans le logiciel Rotor-Gene Q. 7. Créer une nouvelle page en cliquant sur «New» (Nouveau) puis sur «Synchronize pages» (Synchroniser les pages). Dans la colonne «Type», laisser tous les échantillons comme «Unknown» (Inconnu). Création d une nouvelle page d échantillons. Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/

28 8. Ouvrir le menu «More Options» (Plus d options) et définir l applicabilité de la page d échantillons grâce à la commande «Define Suitabilities» (Définir l applicabilité). Choisir l option «Only display this sample page when analyzing data» (Afficher cette page d échantillons uniquement lors de l analyse des données). Applicabilité de la page d échantillons. 9. Sélectionner le canal vert pour la page 1 et le canal jaune pour la page 2. Cliquer sur «Save and Close» (Enregistrer et fermer). Cliquer sur «Close» (Fermer) pour fermer la page «Sample Page Suitabilities» (Applicabilité de la page d échantillons). Sélection des canaux de couleur. 10. Dans l onglet «Edit Sample» (Modifier échantillons), cliquer sur «OK». 28 Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012

29 11. Pour analyser les échantillons, ouvrir l outil d analyse en cliquant sur «Analysis» (Analyse). 12. Dans l onglet «Quantitation» (Quantification), sélectionner «Page 1» pour le canal vert puis cliquer sur «Show» (Afficher). Sélectionner «Page 2» pour le canal jaune puis cliquer sur «Show» (Afficher). Si la fenêtre «Autofind Threshold» (Recherche automatique du seuil) s affiche, cliquer sur «Cancel» (Annuler). Les courbes d amplification des canaux vert et jaune s affichent dans la fenêtre «Quantitation Analysis» (Analyse de quantification). Onglet «Quantitation» (Quantification) de l outil d analyse. Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/

30 13. Activer l outil de correction de la pente pour le canal vert. Outil de correction de la pente. 14. Sélectionner les échantillons dans le tableau de droite. En bas, à droite du volet, sélectionner «Auto-Find threshold» (Recherche automatique du seuil) pour le canal vert. Les valeurs C T sont données dans la fenêtre «Quantitation Results» (Résultats de quantification). La définition d une valeur seuil adaptée peut exiger une validation interne supplémentaire au laboratoire. Définition de la valeur C T pour le canal vert à l aide de la fonction «Auto-Find threshold» (Recherche automatique du seuil). 30 Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012

31 15. Pour le canal jaune, importer les paramètres du fichier «Investigator Quantiplex Kit Analysis Settings for the Yellow Channel» à l aide de l outil d importation situé en bas du volet. Voir page 14 pour les consignes de téléchargement du fichier. En variante, sélectionner une valeur seuil C T de 0,05 et ignorer les 15 premiers cycles. Les valeurs C T sont données dans la fenêtre «Quantitation Results» (Résultats de quantification). La définition d une valeur seuil adaptée peut exiger une validation interne supplémentaire au laboratoire. Définition de la valeur C T pour le canal jaune à l aide de l outil d importation. 16. La courbe standard s affiche dans la fenêtre «Standard Curve» (Courbe standard) pour le canal vert. Afficher la droite de régression, la pente (M), l ordonnée à l origine (B) et la valeur de R 2 calculées. Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/

32 Courbe standard. 17. Afficher la concentration des échantillons inconnus. La fenêtre «Quantitation Results Cycling A. Green» (Résultats de quantification - Cycle A vert) affiche les données des puits sélectionnés et récapitule la quantité d ADN présente dans les échantillons inconnus. L unité est affichée en haut de la colonne. Fenêtre «Quantitation Results Cycling A. Green» (Résultats de quantification Cycle A vert). La fenêtre «Quantitation Results Cycling A. Yellow» (Résultats de quantification - Cycle A jaune) affiche les données des puits sélectionnés et récapitule les valeurs C T du témoin interne. 32 Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012

33 Fenêtre «Quantitation Results Cycling A. Yellow» (Résultats de quantification - Cycle A jaune). 18. Pour exporter les résultats dans Excel, cliquer avec le bouton droit de la souris et sélectionner «Export to Excel» (Exporter vers Excel). Les résultats sont enregistrés au format *.csv. Pour exporter un rapport complet, sélectionner «File» (Fichier) > «Reports» (Rapports) > «Quantitation» (Quantification). 19. Pour interpréter les résultats, voir «Interprétation des résultats», page 73. Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/

34 Protocole : Quantification d ADN sur le thermocycleur Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System Ce protocole est optimisé pour une utilisation du kit Investigator Quantiplex sur thermocycleur Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System avec le logiciel SDS version 1.4. Pour les consignes générales de configuration de l appareil ainsi que des informations sur les autres versions du logiciel, se reporter au manuel d utilisation du thermocycleur. Remarques importantes avant de commencer Préparer tous les mélanges réactionnels dans une zone séparée de celle utilisée pour l extraction d ADN et l analyse du produit de PCR (post-pcr). Utiliser des cônes jetables munis de filtres hydrophobes afin de minimiser le risque de contamination croisée. L étalonnage des colorants neufs est inutile sur le thermocycleur en temps réel Applied Biosystems Toujours respecter les conditions de cycle spécifiées dans le protocole. Le cycle est optimisé pour cette analyse. Toujours respecter le volume de matrice spécifié dans le protocole. La réaction est optimisée pour un volume de matrice d ADN de 2 µl. Ne pas utiliser plus ni moins de 2 µl par réaction de 25 µl. Les dilutions des étalons de quantification d ADN dans le QuantiTect Nucleic Acid Dilution Buffer (Tampon de dilution des acides nucléiques QuantiTect) peuvent être stockées à 4 C pendant au moins une semaine. Les paramètres d analyse doivent être optimaux pour obtenir des données de quantification fidèles. Toujours régler à nouveau les paramètres d analyse (c est-à-dire paramètres de la ligne de base et valeurs seuils) pour l analyse de tous les canaux à colorants rapporteurs de tous les cycles. Procédure 1. Décongeler l ADN témoin Z1 et le QuantiTect Nucleic Acid Dilution Buffer (Tampon de dilution des acides nucléiques QuantiTect). Homogénéiser soigneusement toutes les solutions avant usage afin d éviter les différences de concentration en sel. Ne pas décongeler l ADN témoin Z1 à une température supérieure à la température ambiante (15 à 25 C). 34 Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012

35 2. Préparer fraîchement des dilutions en série de l ADN témoin Z1 telles que décrites au Tableau 7. Passer au vortex pendant au moins 5 s puis centrifuger chaque solution brièvement avant de prélever une aliquote pour la dilution suivante. Utiliser un cône de pipette neuf pour chaque dilution. Veiller à éviter toute contamination croisée. Tableau 7. Dilutions en série de l ADN témoin Z1 Dilution en série de l ADN témoin Z1 ADN témoin Z1 QuantiTect Nucleic Acid Dilution Buffer (Tampon de dilution des acides nucléiques QuantiTect) 20 ng/µl ADN non dilué 5 ng/µl 10 µl 30 µl 1,25 ng/µl 10 µl 30 µl 0,3125 ng/µl 10 µl 30 µl 0, ng/µl 10 µl 30 µl 0, ng/µl 10 µl 30 µl 0, ng/µl 10 µl 30 µl 3. Décongeler le Reaction Mix FQ (Mélange réactionnel FQ), le Primer Mix IC FQ (Mélange d amorces IC FQ) et les matrices d acides nucléiques. Homogénéiser en retournant les tubes plusieurs fois. Homogénéiser soigneusement toutes les solutions avant usage afin d éviter les différences de concentration en sel. Ne pas décongeler le Reaction Mix FQ (Mélange réactionnel FQ) et le Primer Mix IC FQ (Mélange d amorces IC FQ) à une température supérieure à la température ambiante (15 à 25 C). 4. Préparer un mélange maître tel que décrit au Tableau 8. Ce mélange contient tous les composants nécessaires à la PCR à l exception de la matrice d ADN (échantillon) et de l eau exempte de nucléase. Préparer un volume de mélange maître supérieur de 10 % au volume requis pour le nombre total de réactions de PCR à réaliser. Ce nombre doit comprendre les réactions avec les témoins positif et négatif. Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/

36 La réaction peut généralement être préparée à température ambiante (15 à 25 C). Toutefois, il est recommandé de conserver les réactifs, les échantillons et les témoins sur de la glace ou un refroidisseur. Tableau 8. Mélange maître pour la quantification d ADN Composant Reaction Mix FQ (Mélange réactionnel FQ), 2,18 x Primer Mix IC FQ (Mélange d amorces IC FQ), 2,18 x Volume total du mélange maître Volume par réaction de 25 µl Concentration finale 11,5 µl 1 x 11,5 µl 1 x 23 µl 5. Mélanger soigneusement le mélange maître et en transférer 23 µl dans des tubes de PCR ou dans les puits d une plaque de PCR. 6. Ajouter 2 µl de QuantiTect Nucleic Acid Dilution Buffer (Tampon de dilution des acides nucléiques QuantiTect) dans les tubes ou les puits de NCT. Veiller à ce que les tubes de NCT n entrent pas en contact avec l ADN humain. 7. Ajouter 2 µl de dilution d ADN témoin ou 2 µl d ADN de l échantillon inconnu à chaque tube de PCR et mélanger soigneusement. Boucher les tubes de PCR. Il est très important de bien homogénéiser afin d éviter les différences de concentration en sel et en ADN. Le Tableau 9 donne un exemple de configuration de plaque. S assurer que le mélange maître et la matrice sont parfaitement mélangés. Il est nécessaire d inclure les dilutions d ADN témoin en deux exemplaires pour chaque analyse et chaque plaque de réaction. 36 Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012

37 Tableau 9. Configuration possible de la plaque de réactions sur le thermocycleur Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System Contenu des puits A ,25 1,25 0,3125 0,3125 0,0781 0,0781 0,0195 0,0195 B 0,0049 0,0049 NTC NTC UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK C UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK D UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK E UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK F UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK G UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK H UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK Toutes les quantités sont exprimées en ng/µl. UNK : échantillon inconnu. 8. Lancer le logiciel de détection des séquences et sélectionner «Create a New Document» (Créer nouveau document). Cliquez sur «Next» (Suivant) pour continuer. Si aucun modèle de fichier de la page du produit Investigator Quantiplex n est utilisé, sélectionner les éléments suivants dans la fenêtre New Document Wizard (Assistant nouveau document). «Assay» (Analyse) : «Absolute Quantification (Standard Curve)» (Quantification absolue (courbe standard)) «Container» (Récipient) : «96-Well Clear Plate» (Plaque transparente à 96 puits) «Template» (Modèle) : «Blank Document» (Document vierge) «Run Mode» (Mode d analyse) : «Standard 7500» Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/

38 Création d un nouveau document. En cas d utilisation d un modèle de fichier, sélectionner les éléments suivants et passer à l étape 12. «Assay» (Analyse) : «Absolute Quantification (Standard Curve)» (Quantification absolue (courbe standard)) «Container» (Récipient) : «96-Well Clear Plate» (Plaque transparente à 96 puits) «Template» (Modèle) : «Investigator_Quantiplex_Template_SDS1.4.SDT» «Run Mode» (Mode d analyse) : «Standard 7500» 38 Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012

39 9. Ajouter les détecteurs FAM et VIC au document. Cliquez sur «Next» (Suivant) pour continuer. Sélection des détecteurs. 10. Sélectionner les puits utilisés et cocher la case pour les deux détecteurs. IMPORTANT : Ne pas sélectionner les puits inutilisés (c est-à-dire les puits sans mélange réactionnel). L inclusion des puits inutilisés a un impact considérable sur l échelle des axes X et Y lors de l affichage des données. Saisir les concentrations utilisées pour générer la courbe standard pour les puits contenant les réactions témoins pour le détecteur FAM. 11. Dans la colonne «Task» (Tâche), cliquer sur «Unknown» (Inconnu) puis sélectionner «Standard» (Étalon) dans le menu déroulant. Dans la colonne «Quantity» (Quantité), saisir la quantité d ADN dans le puits pour le détecteur concerné. IMPORTANT : Bien qu aucune unité n apparaisse dans la colonne «Quantity» (Quantité), il est impératif d utiliser une unité courante (par exemple ng/µl). Les unités employées pour les quantités d étalon définissent les unités de quantification pour l analyse des résultats. Remarque : Pour les réactions avec les étalons, laisser les champs de la colonne «Task» (Tâche) du détecteur VIC définis sur «Unknown». Saisir le nom de l échantillon (par exemple, ADN témoin Z1 20 ng/µl). Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/

40 Configuration de la plaque d échantillons. 12. Cliquer sur «Finish» (Terminer). Pour programmer le thermocycleur tel que décrit au Tableau 10, cliquer sur l onglet «Instrument» (Appareil). La PCR exige une incubation initiale à 95 C pendant 1 minute afin d activer l ADN polymérase. 40 cycles de PCR à deux étapes sont nécessaires : 95 C pendant 5 s (étape de dénaturation) et 60 C pendant 32 s (étape d hybridation/élongation). Tableau 10. Conditions de fonctionnement du thermocycleur Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System Étape Activation initiale de la PCR Temp. Durée Nombre de cycles Commentaires additionnels 95 C 1 min La PCR exige une incubation initiale à 95 C pendant 1 minute afin d activer l ADN polymérase. Cycle à deux étapes : Dénaturation Hybridation/élongation combinées 95 C 60 C 5 s 32 s 40 cycles Recueillir les données de fluorescence. 40 Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012

41 13. Sur le profil de température, supprimer la première étape en appuyant sur la touche «Shift» (Maj) puis en cliquant sur le palier Stage 1 (Phase 1) (50 C pendant 2 min). Après avoir sélectionner le palier, appuyer sur la touche «Delete» (Suppr). Modifier les durées de palier pour les faire correspondre à celles du Tableau 10. Veiller à saisir un volume de 25 µl dans le champ «Sample Volume» (Volume d échantillon) et de sélectionner Standard 7500 dans le champ «Run mode» (Mode d analyse). L acquisition des données doit être réalisée pendant l étape d hybridation/élongation. En cas d utilisation de la version du logiciel, veiller à décocher la case «9600 Emulation» (Émulation 9600). Réglage du profil de température (version 1.4 du logiciel SDS). 14. Avant d analyser la plaque de réaction, enregistrer les données de la plaque dans un fichier SDS Document (*.sds). Cliquer sur «File» (Fichier) puis sur «Save» (Enregistrer). Nommer le document puis cliquer à nouveau sur «Save» (Enregistrer). 15. Charger la plaque sur l appareil. Vérifier que l emplacement A1 de la plaque se trouve en haut à gauche du plateau. 16. Cliquer sur «Start» (Démarrer) pour lancer la réaction. Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/

42 Analyse des données Les paramètres d analyse doivent être optimaux pour obtenir des données de quantification fidèles. Toujours régler à nouveau les paramètres d analyse (c est-à-dire paramètres de la ligne de base et valeurs seuils) pour l analyse de tous les canaux à colorants rapporteurs de tous les cycles. Procédure 1. Ouvrir le fichier de cycle dans le logiciel SDS. Aller à «File» (Fichier) > «Open» (Ouvrir) > «Browse» (Parcourir) pour sélectionner le fichier. 2. Avant de pouvoir créer la courbe standard, il faut définir les étalons. Si les étalons ont été définis avant le lancement d un cycle, passer à l étape Dans le menu «View» (Afficher), sélectionner «Well Inspector» (Inspecteur de puits). Dans la colonne «Task» (Tâche), attribuer la valeur «Standard» (Étalon) aux puits qui contiennent les ADN étalons pour le canal FAM. IMPORTANT : Bien qu aucune unité n apparaisse dans la colonne «Quantity» (Quantité), il est impératif d utiliser une unité courante (par exemple ng/µl). Les unités employées pour les quantités d étalon définissent les unités de quantification pour l analyse des résultats. Remarque : Pour les réactions avec les étalons, laisser les champs de la colonne «Task» (Tâche) du détecteur VIC définis sur «Unknown». Il est inutile de renseigner les quantités pour le témoin interne. Saisir le nom de l échantillon (par exemple, ADN témoin Z1 20 ng/µl). Fenêtre «Well Inspector» (Inspecteur de puits). 42 Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012

43 4. Dans l onglet «Amplification Plot» (Courbe d amplification) de l onglet «Results» (Résultats), sélectionner les échantillons concernés dans le tableau situé sous la courbe. Sélectionner «Auto Ct» (Ct auto) pour les deux canaux puis cliquer sur «Analyze» (Analyser). La définition d une valeur seuil adaptée peut exiger une validation interne supplémentaire au laboratoire. Analyse des échantillons pour les canaux FAM et VIC. Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/

44 5. Pour afficher la courbe standard, sélectionner l onglet «Standard Curve) (Courbe standard) dans l onglet «Results» (Résultats). Afficher les valeurs C T des réactions de quantification des étalons, la droite de régression, la pente (M), l ordonnée à l origine (B) et la valeur de R 2 calculées. Courbe standard. 44 Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012

45 6. Afficher la concentration des échantillons inconnus. Le rapport affiche les données des puits sélectionnés et récapitule la quantité d ADN présente dans les échantillons inconnus. Le détecteur FAM donne la quantité d ADN dans la même unité que celle employée pour les étalons. Par exemple, si l unité définie pour les étalons est ng/µl alors la quantité d ADN dans les échantillons inconnus est donnée en ng/µl. Le détecteur VIC donne les valeurs C T du témoin interne. Concentration des échantillons inconnus. 7. Pour exporter et enregistrer le rapport des résultats, sélectionner «File» (Fichier) > «Export» (Exporter) > «Results» (Résultats). Pour pouvoir enregistrer les résultats au format «Results Export Files *.csv» (Fichiers d export des résultats *.csv), les paramètres d analyse doivent être enregistrés en premier. 8. Pour interpréter les résultats, voir «Interprétation des résultats», page 73. Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/

46 Protocole : Quantification d ADN sur le thermocycleur Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System for Human Identification Ce protocole est optimisé pour une utilisation du kit Investigator Quantiplex sur le thermocycleur Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System for Human Identification, avec le logiciel HID Real-Time PCR Analysis v1.1. Pour les consignes générales de configuration de l appareil ainsi que des informations sur les autres versions du logiciel, se reporter au manuel d utilisation du thermocycleur Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System for Human Identification (Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System for Human Identification User Manual). Remarques importantes avant de commencer Préparer tous les mélanges réactionnels dans une zone séparée de celle utilisée pour l extraction de l ADN et l analyse des produits de PCR (post- PCR). Utiliser des cônes jetables munis de filtres hydrophobes afin de minimiser le risque de contamination croisée. Les fluorophores ne nécessitent pas de calibration spécifique sur le thermocycleur Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System. Mais il convient de vérifier que le système est calibré pour les fluorophores standard VIC et FAM avant de commencer. Veuillez vous référer au manuel d utilisation de l appareil pour une configuration appropriée. Toujours utiliser les conditions de cycle spécifiées dans le protocole. Le cycle est optimisé pour cette analyse. Toujours utiliser le volume de matrice spécifié dans le protocole. La réaction est optimisée pour un volume de matrice d ADN de 2 µl. Ne pas utiliser plus ni moins de 2 µl par réaction de 25 µl. Les dilutions des étalons de quantification d ADN dans le tampon de dilution d acides nucléiques QuantiTect peuvent être conservées à 4 C pendant au moins 1 semaine. Les paramètres d analyse doivent être optimaux pour obtenir des données de quantification précises. Toujours veiller à réajuster les paramètres d analyse (c est-à-dire les paramètres de la ligne de base et les valeurs seuils) pour l analyse de tous les canaux de fluorophores rapporteurs à chaque cycle. 46 Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012

47 Procédure 1. Décongeler le tampon de dilution d acides nucléiques QuantiTect Mélanger soigneusement toutes les solutions avant utilisation pour éviter des différences de concentrations en sel. 2. Préparer fraîchement des dilutions en série de l ADN témoin Z1 selon le Tableau 11. Passer au vortex pendant au moins 5 s, puis centrifuger chaque solution brièvement avant de prélever une fraction aliquote pour la dilution suivante. Utiliser un cône de pipette propre pour chaque dilution. Veiller à éviter toute contamination croisée. Tableau 11. Dilutions en série de l ADN témoin Z1 Dilution en série de l ADN témoin Z1 ADN témoin Z1 Tampon de dilution d acides nucléiques QuantiTect 20 ng/µl ADN non dilué 5 ng/µl 10 µl 30 µl 1,25 ng/µl 10 µl 30 µl 0,3125 ng/µl 10 µl 30 µl 0, ng/µl 10 µl 30 µl 0, ng/µl 10 µl 30 µl 0, ng/µl 10 µl 30 µl 3. Décongeler les matrices d acides nucléiques. Homogénéiser le mélange réactionnel FQ et le mélange d amorces IC FQ en retournant le tube plusieurs fois. Mélanger soigneusement toutes les solutions avant utilisation pour éviter des différences de concentrations en sel. Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/

48 4. Préparer un mélange maître tel que décrit dans le Tableau 12. Ce mélange contient tous les composants nécessaires à la PCR à l exception de la matrice d ADN (échantillon) et de l eau exempte de nucléase. Préparer un volume de mélange maître supérieur de 10 % au volume requis pour le nombre total de réactions de PCR à réaliser. Ce nombre doit comprendre les réactions avec les témoins positif et négatif. La préparation des réactions peut généralement être faite à température ambiante (15-25 C). Toutefois, il est recommandé de conserver les réactifs, les échantillons et les témoins sur de la glace ou dans un dispositif de refroidissement. Tableau 12. Mélange maître pour la quantification de l ADN Composant Volume par réaction de 25 µl Concentration finale Mélange réactionnel FQ 11,5 µl 1x Mélange d amorces IC FQ 11,5 µl 1x Volume total du mélange maître 23 µl 5. Mélanger soigneusement le mélange maître et en distribuer 23 µl dans les puits d une plaque de PCR. 6. Ajouter 2 µl de tampon de dilution d acides nucléiques QuantiTect dans les puits NTC. S assurer que les puits NTC n entrent pas en contact avec de l ADN humain. 7. Ajouter 2 µl des dilutions d ADN témoin ou 2 µl d ADN d échantillon inconnu à chaque puits et mélanger vigoureusement. Fermer la plaque. Mélanger soigneusement pour éviter les différences de concentrations de sel. Le Tableau 13 montre une configuration possible de plaque. S assurer que le mélange maître et la matrice sont soigneusement mélangés. Il est nécessaire de tester les dilutions d ADN témoin en deux exemplaires pour chaque analyse et dans chaque plaque de réaction. 48 Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012

49 Tableau 13. Configuration possible de plaque de réactions sur le thermocycleur Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System for Human Identification Contenu des puits A ,25 1,25 0,3125 0,3125 0,0781 0,0781 0,0195 0,0195 B 0,0049 0,0049 NTC NTC UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK C UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK D UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK E UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK F UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK G UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK H UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK Toutes les quantités sont exprimées en ng/µl. UNK : échantillon inconnu. 8. Ouvrir l application du logiciel HID Real-Time PCR Analysis v1.1 en mode «Custom Assays» (Analyse personnalisée). 9. Si vous utilisez un fichier de modèle, sélectionner «New Experiment From Template» (Nouvelle expérience à partir du modèle) et passer à l étape 13 pour attribuer les «Targets» (Cibles) à la «Plate layout» (Disposition de la plaque). Passer ensuite à l étape 17 pour enregistrer et démarrer le cycle. Le fichier de modèle charge tous les paramètres requis pour démarrer un cycle Investigator Quantiplex, notamment les paramètres de la courbe étalon, le profil de cycle et les cibles requises pour l acquisition de la fluorescence. Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/

50 Démarrage d une nouvelle expérience à partir d un modèle. 10. Si vous n utilisez pas de fichier de modèle, sélectionner «Advanced Setup» (Configuration avancée) en cliquant sur la flèche sous la mention «Design Wizard» (Assistant de conception). Démarrage d une nouvelle expérience. 50 Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012

51 Démarrage d une nouvelle expérience avec la fonction «Advanced Setup». 11. Une fois la nouvelle fenêtre ouverte, saisir un nouveau nom dans «Experiment Name» (Nom d expérience) dans le champ approprié. Sélectionner les paramètres suivants : «Instrument» (Appareil) : 7500 (96 puits) «Experiment Type» (Type d expérience) : «Quantitation Standard curve» (Quantification Courbe étalon) «Reagents» (Réactifs) : «Other» (Autre) «Ramp Speed» (Vitesse de rampe) : Standard Désélectionner l option «Include Melt Curve» (Inclure la courbe de fusion). Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/

52 Paramètres de l appareil. 12. Cliquer sur «Plate Setup» (Configuration de plaque) et définir trois «Targets» en cliquant deux fois sur «Add New Target» (Ajouter une nouvelle cible). Sélectionner les paramètres suivants : «Human Target» (Cible humaine) : Rapporteur FAM, «Quencher» (Désactivateur) : Aucun IC : Rapporteur VIC, «Quencher» : Aucun 52 Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012

53 Définition des cibles. 13. Définir les noms des échantillons en utilisant l outil «Define Samples» (Définir les échantillons) sur le volet de droite. 14. Passer à l onglet «Assign Targets and Samples» (Attribuer les cibles et les échantillons). Dans «Plate Layout», sélectionner les puits utilisés et attribuer les trois «Targets» en cochant les cases. Important : Ne pas mettre en surbrillance les puits non utilisés (c est-à-dire ceux exempts de mélange réactionnel). L incorporation de puits non utilisés altérera notablement l échelle des axes X et Y lors de l affichage des données. Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/

54 Attribution des cibles. 15. Sélectionner les puits pour les «No-Template Controls» (Témoins sans matrice) et les marquer comme «Negative Control» (Témoin négatif) en utilisant le bouton rouge «N». Remarque : Laisser la «Task» (Tâche) IC (VIC) réglée sur «Unknown» (Inconnu) pour les réactions NTC. Saisir le nom de l échantillon. 16. Sélectionner les puits pour la courbe étalon et les marquer comme «Standard» (Étalon) en utilisant le bouton rouge «S». Sélectionner «Quantity» (Quantité) pour le détecteur approprié et saisir la quantité d ADN dans le puits selon le Tableau 11. Important : Bien que les unités ne soient pas saisies pour «Quantity», il est nécessaire d utiliser une unité commune pour toutes les quantités des étalons (par exemple, ng/µl). Les unités utilisées pour les quantités étalons définissent les unités de quantification pour l analyse des résultats. Remarque : Laisser la «Task» IC (VIC) réglée sur «Unknown» pour les réactions des étalons. Saisir le nom de l échantillon. 54 Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012

55 Configuration de la courbe étalon et attribution des échantillons à la disposition de la plaque. 17. Attribuer les échantillons à la disposition de la plaque en cliquant sur les puits et en cochant la case appropriée du volet de gauche. 18. Cliquer sur «Run Method» (Méthode d analyse) Programmer le thermocycleur selon le Tableau 14. La PCR nécessite une incubation initiale à 95 C pendant 1 min pour activer l ADN polymérase. La PCR à cycles en deux étapes nécessite 40 cycles. Chaque cycle consiste en 2 étapes : 95 C pendant 5 s (étape de dénaturation) et 60 C pendant 32 s (étape d hybridation/élongation). Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/

56 Tableau 14. Conditions de cycle sur le thermocycleur Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System for Human Identification Étape Étape initiale d activation de la PCR Temp. Durée Nombre de cycles Commentaires 95 C 1 min La PCR nécessite une incubation initiale à 95 C pour activer l ADN polymérase Cycle en deux étapes : Dénaturation Hybridation/élongation combinées 95 C 60 C 5 s 32 s 40 cycles Recueillir les données de fluorescence 19. Dans le profil de température, changer les durées des paliers pour celles du Tableau 12. Changer le volume de l échantillon à 25 µl. L acquisition des données doit être réalisée pendant l étape d hybridation/élongation. Ajustement du profil de température (logiciel HID Real-Time PCR Analysis v1.1). 56 Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012

57 20. Avant d exécuter le cycle de la plaque réactionnelle, enregistrer le document de la plaque sous la forme d un fichier EDS Document (*.eds). Cliquer sur «File» (Fichier), puis sur «Save» (Enregistrer). Saisir un nom pour le document de plaque, puis cliquer à nouveau sur «Save». 21. Charger la plaque dans l appareil. S assurer que la position A1 de la plaque se situe du côté supérieur gauche du plateau. 22. Démarrer la réaction en cliquant sur «Start» (Démarrer). Analyse des données Les paramètres d analyse doivent être optimaux pour obtenir des données de quantification précises. Veiller à réajuster les paramètres d analyse (c est-à-dire les paramètres de la ligne de base et les valeurs seuils) pour l analyse de tous les canaux de fluorophores rapporteurs à chaque cycle. Procédure 1. Ouvrir le fichier de cycle en utilisant le logiciel HID Real-Time PCR Analysis v1.1. Il convient d abord de démarrer le logiciel en mode «Custom Assays». Aller ensuite sur «Open» (Ouvrir), puis «Browse» (Parcourir) pour sélectionner le fichier enregistré. 2. Les étalons doivent d abord être définis avant de pouvoir créer la courbe étalon. Si les étalons ont été définis avant le démarrage du cycle, passer à l étape Aller à «Setup» (Configuration) et sélectionner «Plate Setup». Définir les puits qui contiennent les ADN étalons comme indiqué à l étape 14. Important : Bien que les unités ne soient pas saisies pour «Quantity», il est nécessaire d utiliser une unité commune pour toutes les quantités des étalons (par exemple, ng/µl). Les unités utilisées pour les quantités étalons définissent les unités de quantification pour l analyse des résultats. Remarque : Laisser la «Task» IC (VIC) réglée sur «Unknown» pour les réactions des étalons. Saisir le nom de l échantillon (par exemple, ADN témoin Z1 20 ng/µl). 4. Dans l onglet «Amplification Plot» (Graphique d amplification) (sous l onglet «Analysis» (Analyse)), sélectionner les échantillons appropriés dans le tableau présenté sous le graphique d amplification. Sélectionner «Auto Ct» (Ct auto) pour les deux canaux et cliquer sur «Analyze» (Analyser). Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/

58 La détermination d une valeur seuil adaptée peut exiger une validation interne supplémentaire au laboratoire. Analyse d échantillon pour les canaux FAM et VIC. 5. Pour afficher la courbe étalon, sélectionner l onglet «Standard Curve» (Courbe étalon) (sous l onglet «Results» (Résultats)). Afficher les valeurs C T pour les réactions des étalons de quantification, la droite de régression et les valeurs de pente, d ordonnée à l origine et de R Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012

59 Courbe étalon. Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/

60 6. Afficher la concentration des échantillons inconnus Le «Well table» (Tableau de puits) montre les données des puits sélectionnés et récapitule la quantité d ADN présente dans les échantillons inconnus. La cible «Human Target» montre la quantité d ADN présente, avec les mêmes unités que celles appliquées aux étalons (ainsi, si des ng/µl ont été utilisés pour définir les étalons, les quantités des échantillons inconnus seront retranscrites en ng/µl). La cible IC montre la valeur CT pour le témoin interne. Concentration de l échantillon inconnu. 7. Pour exporter et enregistrer le rapport de résultats, aller dans «File», puis «Export» (Exporter) et enfin «Results». Les paramètres d analyse doivent être enregistrés en premier, après quoi les résultats peuvent être enregistrés au format «Results Export Files *.csv» (Fichiers d export des résultats *.csv). 8. Pour interpréter les résultats, voir «Interprétation des résultats» (Interprétation des résultats), page Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012

61 Protocole : Quantification d ADN sur le thermocycleur Applied Biosystems 7500 Fast Real- Time PCR System Ce protocole est optimisé pour une utilisation du kit Investigator Quantiplex sur le thermocycleur Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System avec le logiciel SDS version 1.4. Pour les consignes générales de configuration de l appareil ainsi que des informations sur les autres versions du logiciel, se reporter au manuel d utilisation du thermocycleur. Remarques importantes avant de commencer Préparer tous les mélanges réactionnels dans une zone séparée de celle utilisée pour l extraction d ADN et l analyse du produit de PCR (post-pcr). Utiliser des cônes jetables munis de filtres hydrophobes afin de minimiser le risque de contamination croisée. L étalonnage des colorants neufs est inutile sur le thermocycleur Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System. Toujours respecter les conditions de cycle spécifiées dans le protocole. Le cycle est optimisé pour cette analyse. Toujours respecter le volume de matrice spécifié dans le protocole. La réaction est optimisée pour un volume de matrice d ADN de 2 µl. Ne pas utiliser plus ni moins de 2 µl par réaction de 25 µl. Les dilutions des étalons de quantification d ADN dans le QuantiTect Nucleic Acid Dilution Buffer (Tampon de dilution des acides nucléiques QuantiTect) peuvent être stockées à 4 C pendant au moins une semaine. Les paramètres d analyse doivent être optimaux pour obtenir des données de quantification fidèles. Toujours régler à nouveau les paramètres d analyse (c est-à-dire paramètres de la ligne de base et valeurs seuils) pour l analyse de tous les canaux à colorants rapporteurs de tous les cycles. Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/

62 Procédure 1. Décongeler l ADN témoin Z1 et le QuantiTect Nucleic Acid Dilution Buffer (Tampon de dilution des acides nucléiques QuantiTect). Homogénéiser soigneusement toutes les solutions avant usage afin d éviter les différences de concentration en sel. Ne pas décongeler l ADN témoin Z1 à une température supérieure à la température ambiante (15 à 25 C). 2. Préparer fraîchement des dilutions en série de l ADN témoin Z1 telles que décrites au Tableau 15. Passer au vortex pendant au moins 5 s puis centrifuger chaque solution brièvement avant de prélever une aliquote pour la dilution suivante. Utiliser un cône de pipette neuf pour chaque dilution. Veiller à éviter toute contamination croisée. Tableau 15. Dilutions en série de l ADN témoin Z1 Dilution en série de l ADN témoin Z1 ADN témoin Z1 Tampon de dilution des acides nucléiques QuantiTect 20 ng/µl ADN non dilué 5 ng/µl 10 µl 30 µl 1,25 ng/µl 10 µl 30 µl 0,3125 ng/µl 10 µl 30 µl 0, ng/µl 10 µl 30 µl 0, ng/µl 10 µl 30 µl 0, ng/µl 10 µl 30 µl 3. Décongeler le Reaction Mix FQ (Mélange réactionnel FQ), le Primer Mix IC FQ (Mélange d amorces IC FQ) et les matrices d acides nucléiques. Homogénéiser en retournant les tubes plusieurs fois. Homogénéiser soigneusement toutes les solutions avant usage afin d éviter les différences de concentration en sel. Ne pas décongeler le Reaction Mix FQ (Mélange réactionnel FQ) et le Primer Mix IC FQ (Mélange d amorces IC FQ) à une température supérieure à la température ambiante (15 à 25 C). 62 Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012

63 4. Préparer un mélange maître tel que décrit au Tableau 16. Ce mélange contient tous les composants nécessaires à la PCR à l exception de la matrice d ADN (échantillon) et de l eau exempte de nucléase. Préparer un volume de mélange maître supérieur de 10 % au volume requis pour le nombre total de réactions de PCR à réaliser. Ce nombre doit comprendre les réactions avec les témoins positif et négatif. La réaction peut généralement être préparée à température ambiante (15 à 25 C). Toutefois, il est recommandé de conserver les réactifs, les échantillons et les témoins sur de la glace ou un refroidisseur. Tableau 16. Mélange maître pour la quantification d ADN Composant Reaction Mix FQ (Mélange réactionnel FQ), 2,18 x Primer Mix IC FQ (Mélange d amorces IC FQ), 2,18 x Volume total du mélange maître Volume par réaction de 25 µl Concentration finale 11,5 µl 1 x 11,5 µl 1 x 23 µl 5. Mélanger soigneusement le mélange maître et en transférer 23 µl dans des tubes de PCR ou dans les puits d une plaque de PCR. 6. Ajouter 2 µl de QuantiTect Nucleic Acid Dilution Buffer (Tampon de dilution des acides nucléiques QuantiTect) dans les tubes ou les puits de NCT. Veiller à ce que les tubes de NCT n entrent pas en contact avec l ADN humain. Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/

64 7. Ajouter 2 µl de dilution d ADN témoin ou 2 µl d ADN de l échantillon inconnu à chaque tube de PCR et mélanger soigneusement. Boucher les tubes de PCR. Il est très important de bien homogénéiser afin d éviter les différences de concentration en sel. Le Tableau 17 donne un exemple de configuration de plaque. S assurer que le mélange maître et la matrice sont parfaitement mélangés. Il est nécessaire d inclure les dilutions d ADN témoin en deux exemplaires pour chaque analyse et chaque plaque de réaction. Tableau 17. Configuration possible de la plaque de réactions sur le termocycleur Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System Contenu des puits A ,25 1,25 0,3125 0,3125 0,0781 0,0781 0,0195 0,0195 B 0,0049 0,0049 NTC NTC UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK C UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK D UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK E UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK F UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK G UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK H UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK UNK Toutes les quantités sont exprimées en ng/µl. UNK : échantillon inconnu. 8. Lancer le logiciel de détection des séquences et sélectionner «Create a New Document» (Créer nouveau document). Cliquez sur «Next» (Suivant) pour continuer. Si aucun modèle de fichier de la page du produit Investigator Quantiplex n est utilisé, sélectionner les éléments suivants dans la fenêtre New Document Wizard (Assistant nouveau document) qui s affiche. «Assay» (Analyse) : «Absolute Quantification (Standard Curve)» (Quantification absolue (courbe standard)) «Container» (Récipient) : «96-Well Clear Plate» (Plaque transparente à 96 puits) «Template» (Modèle) : «Blank Document» (Document vierge) «Run Mode» (Mode d analyse) : «Fast 7500» 64 Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012

65 Création d un nouveau document. En cas d utilisation d un modèle de fichier, sélectionner les éléments suivants et passer à l étape 12. «Assay» (Analyse) : «Absolute Quantification (Standard Curve)» (Quantification absolue (courbe standard)) «Container» (Récipient) : «96-Well Clear Plate» (Plaque transparente à 96 puits) «Template» (Modèle) : «Investigator_Quantiplex_Template_SDS1.4_Fast.SDT» «Run Mode» (Mode d analyse) : «Fast 7500» 9. Ajouter les détecteurs FAM et VIC au document. Cliquez sur «Next» (Suivant) pour continuer. Sélection des détecteurs. Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/

66 10. Sélectionner les puits utilisés et cocher la case pour les deux détecteurs. IMPORTANT : Ne pas sélectionner les puits inutilisés (c est-à-dire les puits sans mélange réactionnel). L inclusion des puits inutilisés a un impact considérable sur l échelle des axes X et Y lors de l affichage des données. Saisir les concentrations utilisées pour générer la courbe standard pour les puits contenant les réactions témoins pour le détecteur FAM. 11. Dans la colonne «Task» (Tâche), cliquer sur «Unknown» (Inconnu) puis sélectionner «Standard» (Étalon) dans le menu déroulant. Dans la colonne «Quantity» (Quantité), saisir la quantité d ADN dans le puits pour le détecteur concerné. IMPORTANT : Bien qu aucune unité n apparaisse dans la colonne «Quantity» (Quantité), il est impératif d utiliser une unité courante (par exemple ng/µl). Les unités employées pour les quantités d étalon définissent les unités de quantification pour l analyse des résultats. Remarque : Pour les réactions avec les étalons, laisser les champs de la colonne «Task» (Tâche) du détecteur VIC définis sur «Unknown». Saisir le nom de l échantillon (par exemple, ADN témoin Z1 20 ng/µl). Configuration de la plaque d échantillons. 66 Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012

67 12. Cliquer sur «Finish» (Terminer). Pour programmer le thermocycleur tel que décrit au Tableau 18, cliquer sur l onglet «Instrument» (Appareil). La PCR exige une incubation initiale à 95 C pendant 1 minute afin d activer l ADN polymérase. 40 cycles de PCR à deux étapes sont nécessaires : 95 C pendant 5 s (étape de dénaturation) et 60 C pendant 25 s (étape d hybridation/élongation). Tableau 18. Conditions de fonctionnement du thermocycleur Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System Étape Activation initiale de la PCR Temp. Durée Nombre de cycles Commentaires additionnels 95 C 1 min La PCR exige une incubation initiale à 95 C pendant 1 minute afin d activer l ADN polymérase. Cycle à deux étapes : Dénaturation Hybridation/élongation combinées 95 C 60 C 5 s 25 s 40 cycles Recueillir les données de fluorescence. Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/

68 13. Sur le profil de température, modifier les durées de palier pour les faire correspondre à celles du Tableau 18. Veiller à saisir un volume de 25 µl dans le champ «Sample Volume» (Volume d échantillon) et de sélectionner Fast 7500 dans le champ «Run mode» (Mode d analyse). L acquisition des données doit être réalisée pendant l étape d hybridation/élongation. Réglage du profil de température (version 1.4 du logiciel SDS). 14. Avant d analyser la plaque de réaction, enregistrer les données de la plaque dans un fichier SDS Document (*.sds). Cliquer sur «File» (Fichier) puis sur «Save» (Enregistrer). Nommer le document puis cliquer à nouveau sur «Save» (Enregistrer). 15. Charger la plaque sur l appareil. Vérifier que l emplacement A1 de la plaque se trouve en haut à gauche du plateau. 16. Cliquer sur «Start» (Démarrer) pour lancer la réaction. 68 Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012

69 Analyse des données Les paramètres d analyse doivent être optimaux pour obtenir des données de quantification fidèles. Toujours régler à nouveau les paramètres d analyse (c est-à-dire paramètres de la ligne de base et valeurs seuils) pour l analyse de tous les canaux à colorants rapporteurs de tous les cycles. Procédure 1. Ouvrir le fichier de cycle dans le logiciel SDS. Aller à «File» (Fichier) > «Open» (Ouvrir) > «Browse» (Parcourir) pour sélectionner le fichier. 2. Avant de pouvoir créer la courbe standard, il faut définir les étalons. Si les étalons ont été définis avant le lancement d un cycle, passer à l étape Dans le menu «View» (Afficher), sélectionner «Well Inspector» (Inspecteur de puits). Dans la colonne «Task» (Tâche), attribuer la valeur «Standard» (Étalon) aux puits qui contiennent les ADN étalons pour le canal FAM. IMPORTANT : Bien qu aucune unité n apparaisse dans la colonne «Quantity» (Quantité), il est impératif d utiliser une unité courante (par exemple ng/µl). Les unités employées pour les quantités d étalon définissent les unités de quantification pour l analyse des résultats. Remarque : Pour les réactions avec les étalons, laisser les champs de la colonne «Task» (Tâche) du détecteur VIC définis sur «Unknown». Il est inutile de renseigner les quantités pour le témoin interne. Saisir le nom de l échantillon (par exemple, ADN témoin Z1 20 ng/µl). Fenêtre «Well Inspector» (Inspecteur de puits). Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/

70 4. Dans l onglet «Amplification Plot» (Courbe d amplification) de l onglet «Results» (Résultats), sélectionner les échantillons concernés dans le tableau situé sous la courbe. Sélectionner «Auto Ct» (Ct auto) pour les deux canaux puis cliquer sur «Analyze» (Analyser). La définition d une valeur seuil adaptée peut exiger une validation interne supplémentaire au laboratoire. Analyse des échantillons pour les canaux FAM et VIC. 70 Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012

71 5. Pour afficher la courbe standard, sélectionner l onglet «Standard Curve) (Courbe standard) dans l onglet «Results» (Résultats). Afficher les valeurs C T des réactions de quantification des étalons, la droite de régression, la pente (M), l ordonnée à l origine (B) et la valeur de R 2 calculées. Courbe standard. Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/

72 6. Afficher la concentration des échantillons inconnus. Le rapport affiche les données des puits sélectionnés et récapitule la quantité d ADN présente dans les échantillons inconnus. Le détecteur FAM donne la quantité d ADN dans la même unité que celle employée pour les étalons. Par exemple, si l unité définie pour les étalons est ng/µl alors la quantité d ADN dans les échantillons inconnus est donnée en ng/µl. Le détecteur VIC donne les valeurs C T du témoin interne. Concentration des échantillons inconnus. 7. Pour exporter et enregistrer le rapport des résultats, sélectionner «File» (Fichier) > «Export» (Exporter) > «Results» (Résultats). Pour pouvoir enregistrer les résultats au format «Results Export Files *.csv» (Fichiers d export des résultats *.csv), les paramètres d analyse doivent être enregistrés en premier. 8. Pour interpréter les résultats, voir «Interprétation des résultats», page Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012

73 Interprétation des résultats Considérations générales pour l analyse des données Les données de PCR en temps réel sont fournies sous forme de courbes d amplification sigmoïdales (lorsqu une échelle linéaire est employée) sur lesquelles la fluorescence est tracée en fonction du nombre de cycles. Le cycle seuil (valeur C T ) est un outil qui sert au calcul de la quantité de matrice de démarrage dans chaque échantillon. C est le cycle au cours duquel la première augmentation significative et détectable de la fluorescence a lieu. Le seuil optimal dépend du mode de réaction chimique utilisé pour la PCR. Par conséquent, un seuil établi avec un autre kit peut ne pas convenir au kit Investigator Quantiplex et peut nécessiter un réglage. Pour la quantification d ADN avec le kit Investigator Quantiplex, les paramètres d analyse doivent être réglés pour les deux colorants rapporteurs. Courbe standard La courbe standard est la meilleure représentation de la régression linéaire des données de dilutions en série des étalons. L équation est de la forme : y = mx + b où x = log (concentration) et y = C T. Pente La pente (m) décrit l efficacité de la PCR. Une pente de 3,3 est synonyme d une efficacité de 100 % de la PCR, c est-à-dire que le nombre de copies du produit d amplification est multiplié par deux à chaque cycle. Généralement, la pente est comprise entre 3,0 et 3,6. Si les valeurs se trouvent en dehors de cette plage, voir le chapitre sur la résolution des problèmes, page 76, pour en savoir plus. Ordonnée à l origine L ordonnée à l origine (b) indique la valeur C T attendue pour un échantillon lorsque la quantité = 1 (exemple, 1 ng/µl). Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/

74 Valeur de R 2 La valeur de R 2 est une mesure de l ajustement des points de données à la droite de régression. En général, la valeur de R 2 de la courbe standard est 0,990. Il est possible d observer des valeurs basses de R 2 (R 2 0,98) pour de nombreuses raisons. Dans ce cas, voir le chapitre sur la résolution des problèmes, page 76, pour en savoir plus. Témoin interne Le témoin interne a pour but de révéler tout dysfonctionnement de la réaction chimique ou de l appareil, les erreurs de préparation de l analyse et la présence d inhibiteurs dans l échantillon. Le témoin interne est volontairement plus sensible aux inhibiteurs que la cible de quantification de l ADN humain. Par conséquent, la quantification reste valide même en présence d une certaine quantité d inhibiteurs dans l échantillon. Dans ce cas, l utilisateur est informé à la fois de la concentration en ADN de l échantillon et de la présence d inhibiteurs. La comparaison de la valeur C T du témoin interne utilisé avec les ADN étalons avec les valeurs C T du témoin interne utilisé avec des échantillons inconnus peut fournir une indication de l inhibition potentielle. Si la concentration en inhibiteurs est élevée, les données de quantification peuvent être affectées. Il faut en tenir compte pour les applications en aval. L amplification réussie du témoin interne génère une valeur C T d environ 31. Le témoin interne est très sensible aux inhibiteurs, c est pourquoi on peut s attendre à une variation de la valeur de C T de 1 à 2 parmi les échantillons utilisés pour la courbe standard. L utilisation d une grande quantité d ADN humain (> 150 ng/réaction) peut fournir une valeur C T plus élevée pour le témoin interne. Le résultat obtenu pour le témoin interne doit être considéré à la lueur du résultat de la cible spécifique de l ADN humain. Les situations décrites au Tableau 19 peuvent se présenter. 74 Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012

75 Tableau 19. Résultats d amplification et interprétation Cible humaine spécifique Témoin interne Interprétation Pas d amplification Amplification réussie Aucun ADN humain détecté Pas d amplification Pas d amplification Résultat invalide Amplification réussie avec valeur C T basse et signal de fluorescence intense Amplification réussie avec valeur C T haute et signal de fluorescence faible Pas d amplification ou valeur C T supérieure à 32 Pas d amplification ou valeur C T supérieure à 32 Résultat du témoin interne non concluant Présence d inhibiteurs de la PCR Il est recommandé au laboratoire d effectué une validation en interne avec des inhibiteurs pertinents afin de déterminer les critères de détection de l inhibition. Quantification des échantillons inconnus Le kit Investigator Quantiplex permet de quantifier une vaste plage de quantités d ADN dans un échantillon, de 75 ng/µl à environ 0,5 pg/µl avec une plage très linéaire entre 20 ng/µl et 4,9 pg/µl d ADN génomique humain. 2 µl d échantillon à très faible concentration chargé dans un puits de réaction représentent environ 1 à 1,5 équivalents de génome diploïde humain. Dans la plage des faibles concentrations en ADN, des effets statistiques appelés variations stochastiques sont susceptibles d affecter considérablement le résultat d analyse. Lors de l utilisation d échantillons à faible concentration en ADN, veiller à analyser le plus grand nombre possible de réplicats afin de confirmer le résultat obtenu. Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/

76 Résolution des principaux problèmes rencontrés Ce guide de résolution des principaux problèmes rencontrés peut aider à répondre à certaines questions qui peuvent se poser. Pour plus d informations, voir aussi la page Foire aux Questions de notre Centre de support technique : Les scientifiques des Services techniques de QIAGEN seront ravis de répondre à toutes les questions sur les informations et protocoles figurant dans ce manuel ou sur les technologies d échantillons et d analyses (pour les coordonnées, voir quatrième de couverture ou le site Commentaires et suggestions Absence de signal ou un ou plusieurs signaux détectés tardivement lors de la PCR a) Mauvaises conditions de cycle Toujours respecter les conditions de cycle optimales spécifiées dans le protocole. Sur les systèmes Applied Biosystems, veiller à sélectionner ROX comme colorant passif. b) Erreur de pipetage, réactif manquant ou dégradé c) Erreur ou absence de détection d) Quantité de matrice de démarrage insuffisante e) Problèmes relatifs à la matrice de démarrage Vérifier les conditions de stockage des réactifs. Répéter l analyse. Vérifier que la fluorescence est bien détectée lors de l étape d hybridation/élongation. Augmenter si possible la quantité de matrice. Vérifier que l échantillon contient un nombre suffisant de copies de matrice d ADN. Vérifier les conditions de stockage de la matrice de démarrage. Pour des résultats optimaux, une élimination efficace des inhibiteurs de la PCR est essentielle. Purifier les acides nucléiques issus de l échantillon par une méthode adaptée. Vérifier que l ensemble des réactifs, des tampons et des solutions utilisés pour l extraction et la dilution des matrices d acides nucléiques sont exempts de nucléase. 76 Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012

77 f) Mauvais choix de canal/filtre Commentaires et suggestions Vérifier que le bon canal de détection est activé ou que le bon filtre est sélectionné pour chacun des colorants rapporteurs. Vérifier que la sélection des colorants rapporteurs est compatible avec les canaux de détection ou les jeux de filtres choisis. g) ADN témoin dégradé Préparer de nouvelles dilutions en série de l ADN témoin à partir de la solution-mère. Répéter l analyse avec les nouvelles dilutions. Valeurs de C T ou d efficacité de PCR différentes d un cycle à l autre a) Mauvaises conditions de cycle Toujours commencer l analyse en respectant les conditions de cycle optimales spécifiées dans le protocole. S assurer que les conditions de cycle comprennent l étape initiale d activation de l ADN polymérase (95 C pendant 1 min) et les durées spécifiées de dénaturation et d hybridation/élongation. b) Paramètres d analyse (par exemple, seuil et ligne de base) non optimisés Vérifier les paramètres d analyse (seuil et ligne de base) pour chacun des colorants rapporteurs. Répéter l analyse avec les paramètres optimaux pour chaque colorant rapporteur. Dans certains cas, la modification manuelle du seuil permet d obtenir une efficacité réactionnelle et une valeur R 2 optimales. Absence de linéarité du rapport valeur C T /point d intersection sur le log de la quantité de matrice Quantité de matrice trop élevée dans l échantillon inconnu La linéarité est garantie dans la plage couverte par la courbe standard. Lorsque des signaux sont détectés précocement pour les valeurs C T, diluer l échantillon et répéter la réaction. Augmentation de fluorescence ou de valeur C T pour le témoin sans matrice a) Contamination des réactifs Jeter tous les composants de l analyse (par exemple, mélange maître). Répéter l analyse avec des composants neufs. Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/

78 b) Dégradation minime de la sonde entraînant une augmentation progressive de la fluorescence c) Problèmes d interférence Commentaires et suggestions Vérifier les courbes d amplification et régler les paramètres de seuil. Selon l appareil utilisé, différentes techniques sont employées pour éviter les interférences spectrales en présence de plusieurs fluorophores lors des analyses multiplexes. Toutefois, des interférences minimales, résultant d un chevauchement spectral résiduel, peuvent être observées dans les puits du NTC, en particulier si l appareil doit être étalonné. Intensité de fluorescence variable a) Contamination du thermocycleur en temps réel Les réactions ont été contaminées par l ADN cible. Décontaminer les postes de travail et le thermocycleur conformément aux consignes du fabricant. Utiliser des réactifs et des solutions neufs. b) Perte d étalonnage du thermocycleur en temps réel c) Ondulation de la courbe pour les quantités de matrice élevées dans les échantillons très concentrés en cibles Étalonner à nouveau le thermocycleur conformément aux consignes du fabricant. Dans les paramètres d analyse, réduire le nombre de cycles utilisé pour le calcul de fond (si le cycleur le permet) ou réduire la quantité de matrice. Pente de la courbe standard très différente de 3,33 ou valeur R 2 sensiblement inférieure à 0,98 0,99 a) Contamination du thermocycleur en temps réel Décontaminer le thermocycleur conformément aux consignes du fabricant. b) Perte d étalonnage du thermocycleur en temps réel et/ou des pipettes Étalonner à nouveau le thermocycleur conformément aux consignes du fabricant. Étalonner les pipettes de manière à minimiser la variabilité du pipetage. 78 Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012

79 c) Ondulation de la courbe pour les quantités de matrice élevées dans les échantillons très concentrés en cibles d) Problème de dilution des étalons Commentaires et suggestions Dans les paramètres d analyse, réduire le nombre de cycles utilisé pour le calcul de fond ou réduire la quantité de matrice. S assurer que l ADN étalon est complètement décongelé et homogénéisé avant utilisation. S assurer que les dilutions d ADN étalon sont soigneusement homogénéisées avant de prélever les aliquotes pour les dilutions en série. Ne pas utiliser un volume d échantillon autre que 2 µl. Changer les cônes de pipette entre chaque étape de dilution. e) Plaque non couverte Placer des bandelettes d étanchéité sur la plaque afin d éviter l évaporation. f) Erreur de dilution de l ADN étalon g) Saisie de valeurs de concentration incorrectes dans le logiciel Vérifier tous les calculs et recommencer la dilution de l ADN étalon. Vérifier les concentrations de tous les échantillons utilisés pour générer la courbe standard. h) Fluorescence anormale Ne pas écrire sur la plaque. Manipuler les plaques avec précaution. Porter des gants. i) Variation statistique Un certain degré de variation de la réaction est normal, en particulier lorsque le nombre de copies de l ADN cible est faible. Afin de minimiser l effet de la variation, analyser au moins deux exemplaires de chaque échantillon pour la courbe standard. Supprimer la dilution d ADN étalon à 0, ng/µl de la courbe standard en modifiant la valeur du champ «Sample Type» (Type d échantillon) correspondant sur «Unknown» (Inconnu). Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/

80 Références QIAGEN tient à jour une grande banque de données en ligne de publications scientifiques utilisant les produits QIAGEN. Des critères de sélection de recherche aident à trouver les articles à l aide d un mot-clé ou en spécifiant l application, le domaine de recherche, le titre, etc. Pour une liste complète des références, visiter notre banque de données en ligne «QIAGEN Reference Database» à l adresse ou bien contacter les services techniques de QIAGEN ou le distributeur local. Référence citée Whitcombe, D., Theaker, J., Guy, S.P., Brown, T. and Little, S. (1999) Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence. Nat. Biotechnol. 17, Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012

81 Pour commander Produit Contenu Référence Investigator Quantiplex Kit (200) Produits assimilés Investigator Quantiplex HYres Kit (200) Mélange réactionnel FQ, mélange d amorces IC FQ, ADN témoin Z1, tampon de dilution d acides nucléiques QuantiTect Mélange réactionnel FQ, mélange d amorces IC YQ, ADN témoin Z1, tampon de dilution d acides nucléiques QuantiTect Kits de PCR pour l identification humaine Investigator Investigator ESSplex Plus Kit * Investigator ESSplex SE Plus Kit* Investigator IDplex Plus Kit* Investigator Nonaplex ESS Kit (100)* Investigator HDplex Kit (25)* Mélange d amorces, mélange réactionnel rapide comprenant l ADN polymérase HotStarTaq Plus, ADN témoin, ladder allélique ESSplex Plus, ADN étalon de taille 550 (BTO) et eau exempte de nucléase Mélange d amorces, mélange réactionnel rapide comprenant l ADN polymérase HotStarTaq Plus, ADN témoin, ladder allélique ESSplex SE Plus, ADN étalon de taille 550 (BTO) et eau exempte de nucléase Mélange d amorces, mélange réactionnel rapide comprenant l ADN polymérase HotStarTaq Plus, ADN témoin, ladder allélique IDplex Plus, ADN étalon de taille 550 (BTO) et eau exempte de nucléase Mélange d amorces, mélange réactionnel, ADN polymérase, ADN témoin, échelle allélique, ADN étalon de taille et eau exempte de nucléase Mélange d amorces, mélange réactionnel, ADN polymérase, ADN témoin, échelle allélique, ADN étalon de taille et eau exempte de nucléase * Des kits plus grands sont disponibles, nous contacter pour en savoir plus. Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/

82 Produit Contenu Référence Investigator Triplex AFS QS Kit (100)* Mélange d amorces, mélange réactionnel, ADN polymérase, ADN témoin, échelle allélique, ADN étalon de taille et eau exempte de nucléase Investigator Triplex DSF Kit (100)* Investigator Argus X-12 Kit (25)* Investigator Argus Y-12 QS Kit (100)* Investigator DIPplex Kit (25)* Mélange d amorces, mélange réactionnel, ADN polymérase, ADN témoin, échelle allélique, ADN étalon de taille et eau exempte de nucléase Mélange d amorces, mélange réactionnel, ADN polymérase, ADN témoin, échelle allélique, ADN étalon de taille et eau exempte de nucléase Mélange d amorces, mélange réactionnel, ADN polymérase, ADN témoin, échelle allélique, ADN étalon de taille et eau exempte de nucléase Mélange d amorces, mélange réactionnel, ADN polymérase, ADN témoin, échelle allélique, ADN étalon de taille et eau exempte de nucléase Logiciel Investigator IDproof Investigator IDproof Software Version complète Investigator IDproof Demo Key Investigator IDproof Single Key Investigator IDproof Server Key Licence pour la version de démonstration du logiciel, valable 30 jours Licence pour la version PC du logiciel, à installer sur un seul poste de travail avec accès à la base de données locale Licence autorisant la configuration d un serveur de maintenance de la base de données et de plusieurs postes de travail pour accéder à cette base de données. À acheter avec la clé client (Client Key) Investigator IDproof Client Key À acheter avec la clé serveur (Server Key) Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012

83 Produit Contenu Référence Logiciel Investigator IDproof Mixture Investigator IDproof Mixture Software Version complète Investigator IDproof Mixture Demo Key Investigator IDproof Mixture Single Key Investigator IDproof Mixture Server Key Licence pour la version de démonstration du logiciel, valable 30 jours Licence pour la version PC du logiciel, à installer sur un seul poste de travail avec accès à la base de données locale Licence autorisant la configuration d un serveur de maintenance de la base de données et de plusieurs postes de travail pour accéder à cette base de données. À acheter avec la clé client (Client Key) Investigator IDproof Mixture Client Key À acheter avec la clé serveur (Server Key) Extraction et purification d ADN QIAamp DNA Investigator Kit (50) 50 colonnes QIAamp MinElute, protéinase K, ARN entraîneur, tampons, tubes de prélèvement (2 ml) MinElute Reaction Cleanup Kit (50)* Rotor-Gene Q Rotor-Gene Q 2plex Rotor-Gene Q 2plex HRM 50 colonnes de centrifugation MinElute Spin, tampons, tubes de prélèvement (2 ml) Thermocycleur en temps réel à 2 canaux, ordinateur portable, logiciel, accessoires, garantie 1 an pièces et main-d œuvre Thermocycleur en temps réel et analyseur de fonte de haute résolution à 2 canaux, canal HRM, ordinateur portable, logiciel, accessoires, garantie 1 an pièces et maind œuvre Nous consulter. Nous consulter. * Des kits plus grands sont disponibles, nous contacter pour en savoir plus. Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/

84 Produit Contenu Référence Rotor-Gene Q 5plex Thermocycleur en temps réel à 5 canaux (vert, jaune, orange, rouge, pourpre), ordinateur portable, logiciel, accessoires, garantie 1 an pièces et main-d œuvre Nous consulter. Rotor-Gene Q 5plex HRM Rotor-Gene Q 6plex Thermocycleur en temps réel et analyseur de fonte de haute résolution à 5 canaux, canal HRM, ordinateur portable, logiciel, accessoires, garantie 1 an pièces et maind œuvre Thermocycleur en temps réel à 6 canaux, ordinateur portable, logiciel, accessoires, garantie 1 an pièces et main-d œuvre Nous consulter. Nous consulter. Pour obtenir les dernières informations sur la licence et les clauses de responsabilité spécifiques aux produits, consulter le manuel du kit ou le manuel d utilisation QIAGEN respectifs. Les manuels des kits et manuels d utilisation QIAGEN sont disponibles à l adresse ou peuvent être demandés auprès des Services techniques QIAGEN ou du distributeur local. 84 Manuel du kit Investigator Quantiplex 10/2012

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87 Marques de commerce : QIAGEN, QIAamp, QIAgility, Investigator, MinElute, QuantiTect, Rotor-Gene, Scorpions (QIAGEN Group) ; Applied Biosystems, FAM, VIC (Life Technologies Corporation). Les noms déposés, les noms de marque, etc., cités dans le présent document, même s ils ne sont pas spécifiquement signalés comme tels, ne doivent pas être considérés comme non protégés par la loi. Accord de licence limitée pour le kit Investigator Quantiplex En utilisant ce produit, l acheteur ou l utilisateur du produit consent aux termes suivants : 1. Le produit ne doit être utilisé que conformément aux protocoles fournis et à ce manuel, et avec les composants fournis à l intérieur du kit. QIAGEN n accorde aucune licence sous sa propriété intellectuelle pour utiliser ou intégrer les composants fournis dans ce kit avec tout autre composant non fourni dans ce kit, à l exception de ce qui est stipulé dans les protocoles fournis avec le produit, le présent manuel et d autres protocoles disponibles à l adresse Certains de ces protocoles supplémentaires ont été fournis par des utilisateurs QIAGEN pour les utilisateurs QIAGEN. Ces protocoles n ont pas été testés de manière approfondie ni optimisés par QIAGEN. QIAGEN ne garantit pas non plus qu ils n enfreignent pas de droits de tiers. 2. Hormis les licences énoncées expressément, QIAGEN n offre aucune garantie indiquant que ce kit et/ou son(ses) utilisation(s) ne violent pas les droits de tiers. 3. Ce kit et ses composants sont sous licence pour une utilisation unique et ne peuvent pas être réutilisés, remis à neuf ou revendus. 4. QIAGEN rejette notamment toutes autres licences, expresses ou tacites, autres que celles énoncées expressément. 5. L acheteur et l utilisateur du kit consentent à ne pas prendre, ni autoriser quiconque à prendre, de quelconques mesures pouvant entraîner ou faciliter la réalisation d actes interdits par les termes précédents. QIAGEN peut faire appliquer des interdictions de cet Accord de licence limitée par tout tribunal et pourra recouvrir tous ses frais de recherche et de justice, y compris les frais d avocats, en cas d action en application de cet Accord de licence limitée ou de tous ses droits de propriété intellectuelle liés au kit et/ou à ses composants. Pour les termes de licence mis à jour, voir QIAGEN, tous droits réservés.

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