dans la leucémie myéloïde chronique
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- Marc Chabot
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1 Application i du caryotype et de l hybridation in situ fluorescente (FISH) dans la leucémie myéloïde chronique S.Taoussi, S. Chebrek, S. Oukid, M.T.Abad Service hématologie, EHS ELCC Blida VII congrés national d hématologie, Oran 8-10 mai 2010
2 Introduction Définition La leucémie myéloïde chronique (LMC) est une hémopathie maligne entrant dans le cadre des syndromes myéloprolifératifs. C est une maladie clonale de la cellule souche pluripotente hématopoïétique realisant une prolifération prédominante de la lignée granuleuse Elle touche la moelle osseuse, la rate; elle envahie le sang où on observe une hyperleucocytose avec myélemie. Elle évolue spontanément en trois phases : - chronique - accélérée - transformation blastique
3 Physiopathologie La LMC : maladie clonale caracterisée par la présence d un marqueur cytogénétique : le chromosome Philadelphie (Ph1) qui est le résultat de la translocation réciproque entre les bras longs des chromosomes m 9 (q34) et 22 (q11.2) mettant en contact un oncogène (ABL1) et le gène BCR créant un gène de fusion BCR-ABL1. Le g è ne ABL (? oncog ène v-abl ) Le g è ne BCR «B reak point C luster R egion» l é quivalent mol é culaire est un r é arrangement entre les deux g è nes BCR et ABL en un g è ne de fusion BCR/ABL (22q11) ARNm de 8,5 kb une prot é ine à activit é tyrosine kinase constitutive Tyr kinase cytoplasmique de 210 kda Ce gène de fusion est à l origine de la production d une protéine chimère bcr-abl (p190,p210,p230) à activité tyrosine kinase(tk) élevée, é responsable en partie de la prolifération cellulaire, de la protection contre l apoptose cellulaire et de l insensibilité des progeniteurs hematopoietiques Ph1 à l action inhibitrice des cytokines régulatrices. (Les cellules hematopoietiques normales ne montrent pas d activité TK).
4 Physiopathologie Le chromosome Philadelphie(Ph) recouvre plusieurs combinaisons génétiques é aboutissant à des protéines de fusion de taille différente : p 210 : habituellement associée à la LMC mais aussi décrite dans certains cas de leucémies aiguës. p 190 : habituellement associées aux leucémies aiguës lymphoblastiques. p 230 : plus rare, observées dans des LMC atypiques. De plus, dans certains cas, la translocation résulte d un réarrangement complexe( variant) ou n est pas décelable l en cytogénétique conventionnelle (Ph1 masqué).
5 Diagnostic positif Il repose sur l hémogramme, l analyse cytogénétique et/ou l étude en biologie moléculaire. Hémogramme Hyperleucocytose parfois importante à prédominance de PN neutrophiles, basophilie et éosinophilie. Myélémie importante constante,à prédominance myélocytaire à la phase chronique. Hémoglobine normale. Les plaquettes normales ou augmentées. Myélogramme Il montre une moelle très riche et une augmentation de la lignée granulocytaire sans excès de blastes (< 5%) et permet la réalisation du caryotype.
6 Caryotype médullaire - Il confirme le diagnostic en retrouvant la t(9 ;22) (q34 ;q11) classique ou les variants de cette translocation retrouvés dans 4-8 % au diagnostic (Richebourg S, Cancer Gen Cytogen 182: ,2008), 2008) (Batty N, Blood 112:1108,2008). - Il met en évidence les anomalies additionnelles dans les cellules Ph1 positives (5-10% au diagnostic) (Marin D, Blood 112: ,2008). - Permet le suivi de la réponse cytogénétique au traitement (nombre de métaphases Ph +/ 30 mitoses analysées exprimé en %). - Rarement le caryotype est normal (< 10% des cas) : LMC Ph1 négatif, mais l anomalie peut être retrouvé par d autres techniques (FISH ou biologie moléculaire). - limites : qualité: -de pousse cellulaire. - des mitoses. - de la dénaturation. - des images.
7 La FISH : examen ciblé ne visualise pas tout le genome - Elle met en évidence le signal de fusion bcr-abl sur: - noyaux (FISH interphasique) - mitoses (FISH métaphasique) En particulier en cas de Ph1 négatif (Phi masqué). - Elle révèle les anomalies cryptiques (insertions, micro délétion du bras long du dérivé 9). - Elle aurait une sensibilité supérieure au caryotype conventionnel dans le suivi de la réponse thérapeutique : définition de la réponse cytogénétique complète - Elle aurait une meilleure corrélation avec la réponse moléculaire
8 Biologie moléculaire : Elle confirme la présence du transcrit de fusion bcr-abl en RT-PCR Les méthodes quantitatives (RT-Q-PCR) permettent de mesurer la maladie résiduelle pour évaluer la réponse moléculaire l aux traitements t et son niveau (complète ou majeure). Exigences méthodologiques : nécessité de standardisation par rapport à une échelle internationale
9 Matériels et méthodes : Nous avons réalisé dans le laboratoire d hématologie EHS ELCC Blida un caryotype conventionnel et/ou une hybridation in situ pour les patients atteints de LMC. Le Caryotype Prélèvement de 1 à 2 cc de moelle sur flacon stérile hépariné Mise en culture courte ( 24 h) Sortie de culture Choc hypotonique Fixation des culots cellulaires Étalement sur lames superfrost Dénaturation en bandes R Coloration au Giemsa Lecture sur microscope + logiciel d analyse Classement de 20 caryotypes au diagnostic et 30 pour le suivi.
10 La FISH ( Hybridation in situ fluorescente) Les techniques d'hybridation in situ reposent sur la capacité des fragments d ADN marqués par un ou plusieurs fluorochromes (sondes) de s hybrider spécifiquement avec un ADN complémentaire (préparation chromosomique dénaturée sur lame) )grâce à la complémentarité des bases nucléotidiques. Les hybrides non spécifiques et les molécules de sonde non hybridées sont éliminés par lavages. Les hybrides spécifiques sont révélés par immunofluorescence. Un microscope à épi fluorescence équipé de filtres appropriés aux nombreux fluorochromes disponibles couplé à un logiciel d analyse permet la lecture des préparations FISH.
11 Les différentes étapes suivantes sont réalisées Sortie de culture Vieillissement illiss de 3-7 jours Choc hypotonique Prétraitement Fixation des culots Application des sondes cellulaires Dénaturation à 75 Étalement des lames Hybridation à 37 Lavages des lames Contre coloration au DAPI Lecture au microscope à épifluorescence : comptage de 30 mitoses et 200 noyaux.
12 Sondes fluorescentes utilisées
13 Matériels et méthodes Ces méthodes d analyse ont été appliquées à : 33 cas de LMC au diagnostic : 32 en phase chronique, un en acutisation 34 cas de LMC pour le suivi sous Imatinib : 31 cas en phase chronique 3 cas en acutisation pour évaluer le niveau de la réponse thérapeutique.
14 Résultats : Au diagnostic : 33 cas Le caryotype : - La translocation t (9 ; 22) (q34 ; q11.2) a été é retrouvée dans 30 cas - Échec de culture : 1 cas - Une translocation ti n complexe t (1 ; 9 ; 22) a été retrouvée dans 1 cas. - L absence du chromosome Philadelphie a été notée dans 1 cas. La FISH a été positive dans l ensemble des cas (33) par la mise en évidence du signal de fusion bcr-abl Elle a été spécialement contributive dans deux cas : t(1 ;9 ;22) le cas phi1 négatif
15 Une translocation complexe t (1 ; 9 ; 22) a été retrouvée dans 1 cas. Patiente t H.A, 33 ans
16 L absence du chromosome Philadelphie a été notée dans 1 cas. Patient G.A, 55 ans
17 En évaluation des patients sous imatinib 34 patients ayant reçu entre 3 et 12 mois d imatinib 400 mg/j. Réalisation d un caryotype et d une FISH interphasique et métaphasique tous les 3 mois pour chaque patient. L évaluation est faite selon les critères de L ELN (European Leukemia Net).
18 } CCgR + PCgR = MCgR
19 En évaluation : Sous Imatinib : 34 cas L évaluation à 3 mois relève une RHC = 87, 3% A 3 mois : 9 cas 4 RCg partielles 2 RCg mineures 3 RCg minimes A 6 mois : 09 cas 2 RCgC 4 RCg partielles 1 RCg mineure 1RCg minime un échec A 9 mois : 2 cas 2 RCg minimes A 12 mois :14 cas 3 RCgC 4 RCg partielles 1 RCg mineure 3 RCg minimes 3 échecs
20 Nos Résultats Malades évaluables : 25 ( 6 mois de traitement ) Réponse CCgR No Ph1 + métaphases PCgR mcgr mincgr 1-35% Ph % 65% Ph % Ph1 + nocgr > 95% Ph1+ Cas % 20% 32% 08% 24% 16% MCgR = 52 %
21 .
22 . Évaluation de la réponse au traitement par imatinib Patients en phase chronique Réponse Optimale Réponse Suboptimale Échec 03 mois mois mois Total Pourcentage 48,4 % 25,8 % 25,8 %
23 Rémission hématologique complète à 3 mois : 87,3 % EXPERIENCE TUISIENNE DANS LE TRAITEMENT DE LA LMC PAR IMATINIB BEN LAKHAL R, BELAAJ H, BEN NEJI H, BEN AMOR R, AISSAOUI L, MNIF S, JEDDI R, KACEM K, BELHADJ Z, BEN ABID H, SOUISSI T, MEDDEB B LA TUNISIE MEDICALE-2007; Vol 85 (n 04) LA REPONSE HEMATOLOGIQUE A 3 MOIS RHC = 90% RHC 6 mois = 95% D é lai Sokal RHC à 3 mois D é lai< 1 an 93% D é lai>1 an 85% Sokal faible 100% Sokal interm é d. Ou u é levé 87% Nos Résultats Malades évaluables : 25 ( > 6 mois de traitement ) P = 0.2 P = 0.2 Réponse CCgR No Ph1 + métaphases PCgR 1-35% Ph1+ mcgr 36-65% Ph1 + mincgr 66-95% Ph1 + nocgr > 95% Ph1+ REPONSE CYTOGENETIQUE A 6 MOIS Cas Résultats globaux : % 20% 32% 08% 24% 16% RCM : 56% RCC : 29 % RCm : 9.5 % MCgR = 52 % Échec : 34%
24 Illustration par deux cas particuliers LMC acutisées incluses dans l évaluation ci dessus Dans 1 cas, présence du chromosome phi1 dans 30 mitoses en caryotype conventionnel onnel confirmé par la FISH qui met en évidence en plus une anomalie cryptique : ins (22 ; 9) Dans le deuxième cas, présence du phi1 en deux copies (double phi1) en caryotype conventionnel confirmé par la FISH
25 Commentaires Dans notre travail préliminaire: i i - Pas de différence entre réponse évalué par le caryotype conventionnel et par la FISH - Ceci est lié très certainement à la petite taille de l échantillon analysé (34 cas) En FISH la lecture est non sélective ou orientée donc plus informative que le caryotype, où l analyse obéit forcément aux choix des mitoses (de qualité, bien étalée, bien dénaturée) par toutes les équipes qui pratiquent le caryotype.
26 Commentaires Le consensus actuel (ELN), indique que le diagnostic de LMC doit être assuré par par un caryotype conventionnel dans la majorité des cas. L évaluation de la maladie résiduelle : - caryotype conventionnel (CCgR) -par la biologie i moléculaire l par RQ PCR (rémission moléculaire)
27 Commentaires La FISH : ELN LMC phi1 négative Suivi phase précoce avec sondes bcr-abl dual color double fusion ou dual color extra signal (sensibilité et le taux minime de faux positifs) Dans le contexte national, la réalisation d un caryotype est problématique. Le recours à la FISH à l étape diagnostique et d évaluation de la MRD est une alternative incontournable. La FISH métaphasique étant plus sensible qu un un caryotype conventionnel permettant quelques fois même de relever des anomalies cryptiques. Cette sensibilité supérieure de la FISH a été récemment clairement montrée par le groupe du GIMEMA CML WP. Chronic myeloid leukemia: a prospective comparison of interphase fluorescence in situ hybridization and chromosome banding analysis for the definition of complete cytogenetic response: a study of the GIMEMACMLWP Nicoletta Testoni,1 Giulia Marzocchi,1 Simona Luatti,1 Marilina Amabile,1 Carmen Baldazzi,1 Monica Stacchini,et all. BLOOD, 3 DECEMBER 2009 VOLUME 114, NUMBER 24
28 Commentaires In chronic myeloid leukemia, different methods are available to monitor the response to therapy: chromosome bandinganalysis (CBA), interphase fluorescence in situ hybridization (I-FISH), and realtime quantitative polymerase chain reaction (RT-Q-PCR). The GIMEMA CML WP has performed a prospective study to compare CBA and I-FISH for the definition of complete cytogenetic response (CCgR). Samples (n=664) were evaluated simultaneously by CBA and I-FISH. Of 537 cases in CCgR, the number of positive nuclei by I-FISH was less than 1% in 444 cases (82.7%). Of 451 cases with less than 1% positive nuclei by I-FISH, 444 (98.4%) were classified as CCgR by CBA. The major molecular response rate was significantly greater in cases with I-FISH less than 1% than in those with I-FISH 1% to 5% (66.8% vs 51.6%, P <.001) and in cases with CCgR and I-FISH less than 1% than in cases with CCgR and I-FISH 1% to 5% (66.1% vs 49.4%, P.004). I FISH i iti th CBA d b d t it CC R With i t I-FISH is more sensitive than CBA and can be used to monitor, CCgR. With appropriate probes, the cut-off value of I-FISH may be established at 1%.
29 Commentaires Notre travail préliminaire illustre bien cette réalité. Cependant nt, il est parfaitement clair qu une fois la rémission cytogénétique affirmée (caryotype et ou FISH ), la biologie moléculaire l s impose pour la suite de l évaluation de la MRD.
30 Perspectives Depuis l avènement des ATK les objectifs visés pour chaque patient sont : - Une réponse hématologique complète. - Une réponse cytogénétique complète. - Une réponse moléculaire majeure. - Une survie globale de 100% avec une qualité de vie normale. - Une préservation de la procréation. Pour notre part : pour répondre à ces objectifs : - Poursuivre le recrutement de patients sous ATK - Poursuivre leurs évaluation selon nos deux outils (Caryotype et FISH interphasique et métaphasique) - Démarrer la biologie moléculaire
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