Différents types de chromosomes en Giemsa

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1 Différents types de chromosomes en Giemsa

2 Marquage Giemsa simple - Comptage d une mitose: 45, 46 ou 47 - Reconnaissance des groupes et certains chromosomes dans les groupes, mais pas dans leur structure, ce qui permettrait d évoquer d éventuels diagnostic selon l indication - Marque l ADN satellite, sur les p des acrocentriques - Utilisé à aider pour distinguer un polymorphisme des bras courts non codants des chromosomes acrocentriques, d une image pathologique où les satellites n apparaissent pas

3 Caryotype Marquages GTG et RHG Etude de la structure du chromosome Bandes GTG: Bandes G Trypsine Giemsa, par digestion enzymatique à la trypsine Bandes RHG: Bandes R (Reverse) Heat Giemsa, par dénaturation par la chaleur (solution de Earle à 87 C, PH à 5.3) Les bandes GTG et RHG sont - complémentaires - utilisées en routine - il est recommandé d utiliser les 2 marquages Les bandes RHG et GTG marquent les régions euchromatiques codantes du chromosome ~ 50% pour les bandes GTG de réplication tardive ~ 50% pour les bandes RHG de réplication précoce

4 Bandes chromosomiques (GTG) N du chromosome p: bras court q: bras long Régions bandes sous-bandes ( 3) subdivisions de la sousbandes, si la résolution est bonne Bande12q21.3 Bande 13q31 Bande 12q24.32

5 Chromosomes en bandes (GTG) Régions, bandes et sous-bandes 1 à 22: autosomes ou chromosomes non sexuels X et Y: chromosomes sexuels

6 Caryotypes standards sans anomalie 23 paires de chromosomes, 23 hérités de la mère et 23 du père Caryotypes diploïdes 2n 46,XY Masculin 46,XX Féminin Bandes G (GTG) Bandes R (RHG)

7 46,XX caryotype féminin - GTG

8 46,XY caryotype masculin - RHG

9 Complémentarité du marquage des bandes RHG et GTG Bandes G (GTG) Bandes R (RHG)

10 Autres bandes Bandes plus spécifiques, mais non utilisées en routine - Bandes C: marquent l hétérochromatine constitutionnelle non codante - Bandes NOR marquent les nucleolar organizers ou ADN ribosomal (ADNr), sur les bras courts des chromosomes acrocentriques

11 Bandes C Marquent l hétérochromatine constitutionnelle non codante - Centromères (constrictions primaires) - Constrictions secondaires des chromosomes 1, 9 et 16, plus ou moins longues => polymorphisme - Bras courts des grands et petits acrocentriques - la région hétérochromatique du chromosome Y

12 Cytogénétique moléculaire Résolution supérieure FISH: quelques centaines de Kb CGH: ~ 5 Mb (délaissée) CGH array ou puces: 1 gène Tout dépend du nombre de clones répartis sur une lame

13 Limites du caryotype La résolution (1 bande ~ Mb) - Sang: 400 à 550 bandes par lot haploïde - LA: 300 à 400 bandes - Villosités choriales: 300 bandes

14 FISH: Fluorescent In Situ Hybridization (Hybridation in situ fluorescente) Visualisation d un chromosome ou d une portion de chromosome par des sondes fluorescentes métaphasiques (sur mitoses), ou interphasiques (sur noyaux) 1- de tout le chromosome: peintures 2- centromériques ou télomériques 3- sites spécifiques Ces sondes sont commerciales, ou maison: BAC (Bacterial artificial Chromosome)

15 L ADN: une double hélice complémentaire Structure de chaque brin Sucre + phosphate + 1 base = nucléotide maintenu par des liaisons hydrogène

16 brins d ADN complémentaires et antiparallèles 5 - ATGCCAG TACGGTC - 5 Appariement des bases par des liaisons hydrogène A C T G

17 PRINCIPE DE LA FISH

18

19 Principe de FISH Cellule interphasique Culture cellulaire Examen direct Sonde marquée Chromosome métaphasique Noyau, en interphase

20 FISH interphasique sur LA Préculture surtout: seulement sur noyaux pour le diagnostic prénatal: - sondes du centromère de l X, Y, 18 - sondes site spécifique sur le 13, 21 Post culture parfois: sur mitoses et noyaux Avantage: comptage de beaucoup de cellules (mitoses et noyaux) Limites: résultat partiel; ne décèle que des anomalies de nombre et non de structure, qui correspondent aux sondes utilisées

21 Trisomie 21 sur amniocytes - noyaux 2 signaux du 13 3 signaux du 21

22 TRISOMIE 18 SUR AMNIOCYTES FISH centromériques X,Y et X Y 18

23 Sondes centromériques Sondes du centromère utilisée pour déceler des anomalies de nombre d un chromosome: - En préculture pour les chromosomes 18, X et Y - En post culture, pour tous les chromosomes en cytogénétique prénatale, postnatale et oncohématologique, où la lecture se fera sur les mitoses et noyaux

24 Peintures chromosomiques Il y a des peintures pour tous les chromosomes Si 2 peintures sont utilisées à la fois pour 2 chromosomes différents, utiliser 2 marquages différents. Sont utilisées: - pour reconnaître un marqueur ou chromosome surnuméraire, en mosaïque ou homogène - pour vérifier un remaniement - pour vérifier une délétion pour un chromosome - ne peuvent être effectuées qu après culture, et ne sont lues que sur mitoses

25 Sondes sites spécifiques Hybrident aux sites qui correspondent aux syndromes micro-délétionnels 2 sondes sont associés, l un servant de contrôle pour l autre Sont utilisées: - pour reconnaître si un locus spécifique est délété (sur mitoses et noyaux), ou dupliqué (sur noyaux) - sont mieux lues après cultures, sur mitoses et noyaux

26 Peinture chromosomique du chromosome 4 montrant une délétion partielle de l extrémité d un bras court, confirmée par une délétion 4p Wolf Hirshhorn, sonde site spécifique

27 Pas de délétion 22q11.2 Sondes sites spécifiques 2 sondes marquées - locus du Di George en 22q sonde contrôle en 22q13

28 Sondes des télomères Sonde tous télomères (TTAGGG)n, non spécifiques des télomères, hybrident les extrémités de tous les chromosomes Sondes subtélomériques, spécifiques pour chaque paire chromosomique. Toutes les extrémités sont représentées sauf celles des bras courts des 5 paires de chromosomes acrocentriques - Mêmes sondes Xp et Yp; pareil pour Xq et Yq - Les bras courts des chromosomes acrocentriques n étant pas codants, ne sont pas représentés

29 PROTOCOLE MULTISONDE

30 STRUCTURE DU TÉLOMÈRE

31 Sonde tous télomères (TTAGGG)n

32 FISH subtélomérique spécifique pour les extrémités des chromosomes, hors les bras courts des acrocentriques (mitose) 17pter 17qter

33 FISH subtélomérique spécifique pour chaque extrémité de chromosomes, hors le bras court des acrocentriques (noyaux)

34 Chromosome Genomic Hybridization (CGH) Cohybridation d un ADN à tester + d un ADN témoin marqués par 2 fluochromes différents sur des métaphases normales Visualisation d un déséquilibre par compétition de l hybridation

35 Caryotype spectral délaissé au profit de la CGH array Hybridation simultanée sur métaphases de 24 sondes de peinture spécifiques des 22 paires d autosomes et de chromosomes X et Y Chaque paire chromosomique possède une couleur propre, ce qui permet leur classement et ainsi la détection de remaniements chromosomiques complexes, équilibrés ou non sans besoin d orientation préalable

36 Caryotype spectral par peinture de tous les chromosomes Grâce à la combinaison de 5 fluorochromes dans des proportions variées de visualiser une couleur spécifique artificielle pour chaque paire chromosomique. Il est adapté à l étude de remaniements chromosomiques complexes ou à l identification de certains marqueurs

37 Puces d hybridation génomique comparative (CGH array) Techniques sur l ADN Décèlent les déséquilibres chromosomiques avec grande précision Ne décèlent pas les remaniements équilibrés, contrairement au caryotype Hybridations par compétition de l ADN témoin et ADN test Sont généralement faits en double: alternativement, soit - témoin/patient - 3 patients dont, l un sert de témoin aux 2 autres Vérification des déséquilibres par FISH et/ou PCR

38 Préparation des lames CGH Array ou puces

39 Principe de la CGH array Marquage des ADN ADN patient *Cy3 ADN témoin *Cy5 Analyse des rapports de fluorescence Cy3/Cy5 par un logiciel adapté Lavage Puce 2500 clones (BAC) Cohybridation Lecture par scanner

40 Préparation des lames pour puces

41 Pas de déséquilibre noté du chromosome 1

42 Délétion interstitielle 10p Vrai déséquilibre si image en miroir, sinon artefact