Planning du TP L3 de Biologie Cellulaire : prévision pour 8 groupes de travail

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1 Planning du TP L3 de Biologie Cellulaire : prévision pour 8 groupes de travail LUNDI : Travail à faire le premier jour J0 Chaque binôme va trypsiner 3 T75 de cellules 3T3 ou 3 T25 de cellules CHO, compter les cellules (PN0) et ensemencer les cultures qui seront utilisées au cours de la semaine: Cultures sur plastique : 3 T25 pour les courbes de croissance, l analyse du cycle par cytométrie en flux et l analyse de l expression de la cycline D1 par western blot au cours du temps (J1, J2, J3); 1 puits de chaque lame labtek P (2 lames labtek)(chambre de culture pour immunofluorescence) Cultures en méthocel : 3 T25 pour les courbes de croissance, l analyse du cycle par cytométrie en flux et l analyse de l expression de la cycline D1 par western blot au cours du temps (J1, J2, J3), 1 T75 pour étudier la transition culture en suspension dans le méthocel / culture sur plastique à J1 (M-RP). De plus des cellules seront préparées pour l analyse du cycle (cytométrie en flux) et l analyse de l expression de la cycline D1 (western blot), (cytp0 et WBP0) Organisation du lundi matin : 4 binômes travailleront avec les cellules 3T3 (1, 2, 3, 4) et 4 binômes travailleront avec les cellules CHO (5, 6, 7, 8). Observation des cultures de 3T3 et de CHO à l aide des deux microscopes inversés. Comparaison de l aspect des deux types cellulaires. Photos. Présentation des hottes de culture et explication du travail sous hotte à flux laminaire : 2 démonstrations en parallèle (4 binômes par présentation) : nettoyage par passage à l alcool, manipulation des pipettes et des bouchons. Préparation de 40ml de milieu à utiliser pendant les trois jours de culture des 3T3 ou des CHO : Aux 36ml de milieu DMEM additionnés d antibiotiques et déjà prélevés dans une bouteille ajouter 4ml de SV (sérum de veau) pour les cellules 3T3 ou 4ml de SVF (sérum de veau fœtal) pour les cellules CHO. 1

2 Trypsination des 3 T75 de cellules 3T3 : Retirer le milieu et le mettre dans le bécher poubelle. Rincer avec 5ml de PBS stérile puis transférer dans le bécher poubelle. Ajouter 1,5ml de trypsine par T75 (4,5ml au total) : 2 x 750µl à l aide d une p1000. Laisser 5 min maximum dans l incubateur à 37 C. Observer les cellules pour vérifier qu elles sont bien détachées; Taper éventuellement la boite pour faciliter le détachement. Ajouter 500µl de SV dans chaque flacon (1,5ml en tout). Retirer la trypsine avec les cellules et la mettre dans un tube de 50ml. Ajouter 5ml de milieu simple par T75 pour rincer (15ml au total) puis transférer dans le tube de 50ml. Au total : 21ml de suspension cellulaire dans le tube de 50ml. Trypsination des 3 T25 de cellules CHO : Retirer le milieu et le mettre dans le bécher poubelle. Rincer avec 2ml de PBS puis transférer dans le bécher poubelle. Ajouter 0,5ml de trypsine par T25 (1,5ml au total). Laisser 5 min dans l incubateur à 37 C. Observer les cellules pour vérifier qu elles sont bien détachées; Taper éventuellement la boite pour faciliter le détachement. Ajouter 500µl de SVF dans chaque flacon (1,5ml en tout). Retirer la trypsine et le milieu avec les cellules et les mettre dans un tube de 50ml. Ajouter 6ml de milieu simple par T25 pour rincer (18ml au total) puis transférer dans le tube de 50ml. Au total : 21ml de suspension cellulaire dans le tube de 50ml. Comptage à la cellule de Malassez : Préparer 2 tubes contenant chacun 20µl de bleu Trypan+ 20µl de suspension cellulaire : bien déposer les liquides au fond des tubes, faire attention à ne pas déposer de gouttes sur les côtés du tube (les dilutions ne seraient pas exact) 2

3 EN CHANGEANT DE CONE À CHAQUE PRELEVEMENT. Placer la lamelle sur la cellule de Malassez propre. Placer 15µl du mélange «suspension cellulaire + bleu Trypan» des deux côtés Compter la totalité de la surface des deux côtés (1 par binôme) sous microscope Schéma de la cellule de Malassez : La surface de 100 rectangles correspond à un volume de 1 µl Calculer le nombre de cellules par ml et par flacon T75 ou T25 : c est le point PN0 1-Préparation des échantillons pour la cytométrie ou le western blot : Préparer un tube A de 15ml, commun pour les binômes 1+2, 3+4, 5+6, 7+8, dans lequel chaque binôme met cellules (soit cellules au total). Compléter le volume à 5ml avec du milieu simple 3

4 Tube A Binômes 1+ 2, 5+ 6 Préparation des échantillons 3T3 ou CHO pour la cytométrie PCyt0 Centrifuger le tube A pendant 10 min à 400g (1400rpm) Retirer le surnageant (bécher poubelle) Resuspendre dans 1ml de PBS Centrifuger 10min à 400g (1400rpm) Retirer le surnageant (bécher poubelle) Resuspendre dans 500µl de PBS Ajouter au goutte à goutte et en vortexant à un tube de 15ml contenant 5ml d éthanol à 70% refroidi à -20 C (marquer les tubes: PCyt0+ CHO ou 3T3) Binômes 3+ 4, 7+ 8 Préparation des échantillons pour le western blot PWB0 Centrifuger le tube A pendant 10 min à 400g (1400rpm) Retirer le surnageant (bécher poubelle) Resuspendre dans 1ml de PBS transférer dans un tube Eppendorf de 1,5ml (marquer le tube PWB0 + CHO ou 3T3) Centrifuger 10min à 400g (1400rpm) Retirer le surnageant (bécher poubelle) Resuspendre dans du tampon Laemmli : 40µl pour cellules Faire bouillir 5min en bloquant le bouchon 2-Ensemencement des cellules des conditions "Méthocel" et "Méthocel-Retour sur Plastique" : Prélever cellules. Les placer dans un tube de 15ml, ajuster à 10 ou 15ml avec du milieu simple et centrifuger pendant 10 min à 400g (1400rpm). Retirer doucement le surnageant. Resuspendre les cellules dans 3,3ml de SV (3T3) ou SVF (CHO) et les mettre à la surface du méthocel (30ml). Mélanger soigneusement et sans bulles les cellules au méthocel à l aide d une seringue de 20ml (20 allers-retours). Placer les T25 et la T75 à l envers et les marquer sur leur face inférieure (condition M1, M2, M3 (3 T25) et M-RP (1 T75) + n de binôme). A l'aide d'une seringue de 5ml mettre 4ml de suspension cellulaire dans chaque T25 (3 en tout) et 3 fois 4ml (12ml) dans le T75. Ne pas mettre de cellules dans les goulots. Chaque T25 contient en principe cellules et le T75 en contient Observer, mettre à l étuve, noter l heure. 3-Ensemencement des cellules de la condition "Plastique": Marquer les 3 T25 au feutre (condition P1, P2 ou P3 + n de binôme). Ajouter cellules par T25 (12000 cellules / cm2). 4

5 Ajouter du milieu complet QSP 5ml par T25, bien homogénéiser sans mettre de cellules dans le goulot. Observer les cellules, noter l heure et mettre à l étuve. 5-Ensemencement des cellules de la condition «Plastique» pour l immunofluorescence : Mettre 8000 cellules dans un puits de chacune des 2 lames labtek P (8000 cellules / cm2) et compléter le volume à 200µl avec du milieu complet (mettre le milieu avant les cellules) (cf. schéma). Mettre les lames labtek à 37 C. MARDI Travail à faire le deuxième jour J1 : 1. Préparation des échantillons «Méthocel» jour 1 pour la courbe de croissance, la cytométrie en flux et le western blot 2. Ensemencement des cultures «Retour sur Plastique» après culture en Méthocel (M-RP) 3. Préparation des échantillons «Plastique» jour 1 pour la courbe de croissance, la cytométrie en flux et le western blot Organisation du mardi matin : Préparation en parallèle des échantillons Méthocel 1 et des cultures Retour sur Plastique : Observation des cellules contenues dans le T25 et dans le T75 au microscope inversé, photos à la caméra. Préparation des échantillons Méthocel1 pour le comptage, la cytométrie et le western blot Noter l heure Diluer le méthocel en ajoutant 24ml de PBS préchauffé par T25 Bien homogénéiser le méthocel par agitation douce du flacon Transférer le mélange dans 1 tube de 50ml Rincer avec 20 ml de PBS par T25 Préparation des cultures Retour sur Plastique après 1 jour de culture en Méthocel Noter l heure Diluer le méthocel en ajoutant 3 fois 24ml de PBS préchauffé par T75 Bien homogénéiser le flacon en agitant doucement : il faut travailler stérilement car on réensemence les cellules 5

6 Transférer le rinçage dans le tube de 50ml (48ml / tube en tout) Centrifuger les cellules 10min à 400g (1400rpm) (poubelle) Ajouter 500µl de trypsine, homogénéiser, Laisser 2min au bain-marie, homogénéiser. Ajouter 150µl de SV (3T3) ou de SVF (CHO) et 850µl de milieu simple (1,5 ml en tout) Compter à la cellule de Malassez : Préparer 2 tubes contenant chacun 20µl de suspension cellulaire + 20µl de bleu Trypan en déposant bien les liquides au fond des tubes Placer la lamelle sur la cellule de Malassez propre Placer 15µl du mélange «suspension cellulaire + bleu Trypan» des deux côtés Compter la totalité de la surface des deux côtés (1 par binôme) sous microscope= comptage M1 Calculer le nombre de cellules par ml et par T25 Binômes 1, 2, 5, 6 Préparation de cellules 3T3 ou CHO pour la cytométrie MCyt1 Regrouper les échantillons de deux binômes (1+2 et 5+6) dans un tube de 15ml. Noter le nombre de cellules par tube ( cellules au maximum) et ajouter du milieu simple QSP 10ml Centrifuger le tube 10min à 400g (1400rpm) Eliminer le surnageant Binômes 3, 4, 7, 8 Préparation d échantillon pour le western blot MWB1 Regrouper les échantillons de deux binômes (3+4 et 7+8) dans un tube de 15ml et ajouter du milieu simple QSP 10ml. Noter le nombre de cellules par tube. Attention : ne pas prendre plus de cellules. Centrifuger le tube 10min à 400g (1400rpm) Transférer dans 3 tubes de 50ml Rincer avec 3 fois 20 ml de PBS par T75 Transférer le rinçage dans les tubes de 50ml (48ml / tube en tout) Centrifuger les cellules 10min à 400g (1400rpm) (poubelle) Ajouter 1,5ml de trypsine dans un tube de 50 ml, homogénéiser, transférer dans le 2 ème tube, homogénéiser, transférer dans le 3 ème tube et homogénéiser. Laisser 2min au bain-marie, homogénéiser. Ajouter 500µl de SV (3T3) ou de SVF (CHO) et 2,5 ml de milieu simple (4,5 ml en tout) Compter à la cellule de Malassez : Préparer 2 tubes contenant chacun 20µl de bleu Trypan+ 20µl de suspension cellulaire en déposant bien les liquides au fond des tubes et EN CHANGEANT DE CONE A CHAQUE PRELEVEMENT Placer la lamelle sur la cellule de Malassez propre Placer 15µl du mélange «suspension cellulaire + bleu Trypan» des deux côtés Compter la totalité de la surface des deux côtés (1 par binôme) sous microscope= comptage M-RP1 Calculer le nombre de cellules par ml et par T75 Faire les calculs pour ensemencer cellules par T25 (2 T25), 8000 cellules par puits de chacune des 2 lames labtek Avant de mettre les cellules, mettre du milieu complet dans les 2T25 (QSP 5ml/T25), les 2 puits des lames labtek RP (QSP 200µl/puits) puis ajouter les cellules. noter l heure et mettre à l étuve 6

7 Resuspendre le culot dans 1ml de PBS Centrifuger le tube 10min à 400g (1400rpm) Resuspendre dans 500µl de PBS Ajouter au goutte à goutte et en vortexant à un tube de 15ml contenant 5ml d éthanol à 70% refroidi à -20 C (tube MCyt1 + CHO ou 3T3). Resuspendre le culot dans 1ml de PBS et transférer dans un tube Eppendorf de 1,5ml (MWB1 + CHO ou 3T3) Centrifuger 10min à 400g (1400rpm) Retirer le surnageant (bécher poubelle) Resuspendre dans du tampon Laemmli : 40µl/ cellules Faire bouillir 5min en bloquant le bouchon (Repas) Organisation du mardi après-midi : Préparation des échantillons plastique jour 1 (P1) pour la cytométrie et le western blot : Observation de la culture en T25 (3T3 et CHO) au microscope inversé, photos à la caméra. Trypsination des cellules : Retirer le milieu (poubelle), Rincer avec 2ml de PBS. Mettre ce PBS dans un tube de 15ml Ajouter 0,5ml de trypsine dans le flacon T25, noter l heure Laisser 5min à l étuve Vérifier que les cellules sont bien décollées, éventuellement taper le flacon pour aider au décollement. Ajouter 0,1 ml de SV (3T3) ou de SVF (CHO) dans le flacon 7

8 Mettre les cellules trypsinées dans le tube de 15 ml Rincer le T25 avec 2,4ml de milieu simple Ajouter le rinçage au tube de 15ml: il y a 5ml en tout Comptage à la cellule de Malassez : Préparer 2 tubes contenant chacun 20µl de suspension cellulaire + 20µl de bleu Trypan Placer la lamelle sur la cellule de Malassez propre Placer 15µl du mélange «suspension cellulaire + bleu Trypan» des deux côtés Compter la totalité de la surface des deux côtés (1 par binôme) sous microscope, comptage PN1 Calculer le nombre de cellules par ml et par flacon Binômes 1, 2, 5, 6 Préparation de cellules 3T3 ou CHO pour la cytométrie PCyt1 Regrouper les échantillons des deux binômes (1+2 et 5+6) : prendre cellules au maximum, et ajouter du milieu simple QSP 10ml Noter le nombre de cellules par tube Resuspendre le culot dans 1ml de PBS Resuspendre dans 500µl de PBS Ajouter au goutte à goutte et en vortexant à un tube de 15ml contenant 5ml d éthanol à 70% refroidi à -20 C (tube PCyt1 + CHO ou 3T3.) Binômes 3, 4, 7, 8 Préparation des échantillons pour le western blot PWB1 Regrouper les échantillons des deux binômes (3+4 et 7+8) et ajouter du milieu simple QSP 10ml. Attention : ne pas prendre plus de cellules. Noter le nombre de cellules par tube Resuspendre le culot dans 1ml de PBS transférer dans un tube Eppendorf de 1,5ml marquer le tube : (PWB1 + CHO ou 3T3) Centrifuger 10min à 400g (1400rpm) Retirer le surnageant (bécher poubelle) Resuspendre dans du tampon Laemmli : 40µl pour cellules Faire bouillir 5min en bloquant le bouchon 8

9 MERCREDI Travail à faire le troisième jour J2 1. Préparation du gel d acrylamide dit de résolution (à conserver au froid) 2. Préparation des cellules Méthocel J2 pour le comptage, la cytométrie, le western blot et l immunofluorescence 3. Préparation des cellules Plastique J2 et Retour sur Plastique J1 pour le comptage, la cytométrie, le western blot et l immunofluorescence Organisation du mercredi matin : De 9h00 à 10h00 si la pièce de culture est occupée : Préparation des gels d acrylamide : préparation du gel de résolution (cf. protocole spécifique) Bien nettoyer les hottes Préparation des échantillons Méthocel J2 Observation des cellules et photos Préparation des échantillons méthocel jour 2 pour la cytométrie et le western blot noter l heure Diluer le méthocel en ajoutant 24ml de PBS préchauffé par T25 Bien mélanger le méthocel par agitation douce du flacon Transférer le mélange dans 1 tube de 50ml Rincer à nouveau avec 20 ml de PBS par T25 Transférer le mélange dans le tube de 50ml (48 ml / tube) Centrifuger les cellules 10min à 400g (1400rpm) (poubelle) Ajouter 500µl de trypsine dans le tube de 50ml, homogénéiser, Laisser 2min au bain-marie, homogénéiser Ajouter 150µl de SV (3T3) ou de SVF (CHO) et 850µl de milieu simple Compter à la cellule de Malassez : comptage MN2 Calculer le nombre de cellules par ml et par flacon 9

10 Mettre 8000 cellules 3T3 (binômes 1, 2, 3 et 4) ou 8000 cellules CHO (binômes 5, 6, 7 et 8) dans 1 puits de chacune des 2 lames labtek M et ajuster le volume à 200 µl avec du milieu complet Centrifuger la lame labtek à 400g pendant 10 min (1400 rpm) Mettre les lames labtek à l étuve pendant 60 à 90 minutes pour permettre aux cellules d adhérer au plastique. Fixer au paraformaldéhyde pendant 30 min, rincer délicatement 2 fois au PBS et stocker au froid (4 C) Binômes 1, 2, 5, 6 Préparation de cellules pour la cytométrie Regrouper les échantillons de deux binômes (1+2 et 5+6) : cellules au maximum, et ajouter du milieu simple QSP 10ml Noter le nombre de cellules/tube Eliminer le surnageant Resuspendre le culot dans 1ml de PBS Resuspendre dans 500µl de PBS Ajouter au goutte à goutte et en vortexant à un tube de 15ml contenant 5ml d éthanol à 70% refroidi à -20 C (tube MCyt2 + N binôme). Binômes 3, 4, 7, 8 Préparation d échantillon pour le western blot Regrouper les échantillons de deux binômes (3+4 et 7+8) et ajouter du milieu simple QSP 10ml. Attention : ne pas prendre plus de cellules. Noter le nombre de cellules/tube Resuspendre le culot dans 1ml de PBS et transférer dans un tube Eppendorf de 1,5ml (MWB2 + n de binôme) Centrifuger 10min à 400g (1400rpm) Retirer le surnageant Resuspendre dans du tampon Laemmli : 40µl/ cellules Faire bouillir 5min en bloquant le bouchon Organisation du mercredi après-midi : Préparation des échantillons Plastique J2 (P2) et Retour sur Plastique J1 (RP1): 10

11 Les échantillons sont à traiter en même temps. Observer les T25. Faire des photos Trypsination des cellules : Ne pas mélanger les échantillons!!! Retirer le milieu (poubelle), Rincer avec 2ml de PBS/T25. Mettre ce PBS dans un tube de 15ml Ajouter 0,5ml de trypsine /T25, noter l heure Laisser 5min à l étuve Vérifier que les cellules sont bien décollées, éventuellement taper le flacon pour aider au décollement. Ajouter 0,1 ml de SV (3T3) ou de SVF (CHO) /T25 Mettre les cellules trypsinées dans le tube Rincer le T25 avec 2,4ml de milieu simple Ajouter le rinçage au tube de 15ml: il y a 5ml en tout Comptage à la cellule de Malassez : Préparer 2 tubes contenant chacun 20µl de suspension cellulaire + 20µl de bleu Trypan Placer la lamelle sur la cellule de Malassez propre Placer 15µl du mélange «suspension cellulaire + bleu Trypan» des deux côtés Compter la totalité de la surface des deux côtés (1 par binôme) sous microscope, comptages PN2, RPN1 Calculer le nombre de cellules par ml et par T25 Binômes 1, 2, 5, 6 Préparation des cellules pour la cytométrie : PCyt2 et RPCyt1 Regrouper les échantillons de deux binômes (1+2 et 5+6) : cellules au maximum, et ajouter du milieu simple QSP 10ml Noter le nombre de cellules/tube Binômes 3, 4, 7, 8 Préparation des échantillons pour le western blot PWB2, RPWB1 Regrouper les échantillons de deux binômes (3+4 et 7+8) et ajouter du milieu simple QSP 10ml. Attention : ne pas prendre plus de cellules. Noter le nombre de cellules / tube 11

12 Resuspendre le culot dans 1ml de PBS Resuspendre dans 500µl de PBS Ajouter au goutte à goutte et en vortexant à un tube de 15ml contenant 5ml d éthanol à 70% refroidi à -20 C (tube PCyt2 ou RPCyt1 + CHO ou 3T3). Resuspendre le culot dans 1ml de PBS et transférer dans un tube Eppendorf de 1,5ml (RPWB1 ou PWB2+ CHO ou 3T3) Centrifuger 10min à 400g (1400rpm) Retirer le surnageant (bécher poubelle) Resuspendre dans du tampon Laemmli : 40µl/ cellules Faire bouillir 5min en bloquant le bouchon Préparation des cellules pour l immunofluorescence : Fixer les lames labtek P et M: retirer le milieu de culture puis rincer chaque puits 2 fois par 150µl de PBS (très délicatement pour ne pas décrocher les cellules M). Retirer le PBS puis fixer les cellules en ajoutant 150µl de PFA à 4% à température ambiante pendant 30 min. Retirer le PFA puis rincer chaque puits 2 fois par 150µl de PBS. Laisser chaque lavage 2 à 3 min. Neutraliser le PFA par une incubation de 5 min avec 150µl de NH4Cl à 50mM solubilisé dans du PBS puis laver à nouveau 2 fois au PBS Conserver au froid (4 C) dans le PBS. JEUDI Travail à faire le quatrième jour J3 1. Préparation du gel d acrylamide dit «de concentration» 2. Préparation des échantillons P3, RP2 et M3 pour le comptage, la cytométrie et le western blot 3. Dépôt des échantillons, électrophorèse, transfert sur du papier de nitrocellulose (Western Blot), incubation du blot avec le premier anticorps (pendant toute la nuit) 4. Fixation de la lame labtek RP 5. Réalisation des immunofluorescences 6. Rendez-vous en cytométrie pour l analyse des résultats. 12

13 Organisation du jeudi matin Préparation des gels d acrylamide (cf. protocole spécifique) Sortir les gels dès qu on arrive pour qu ils se réchauffent. Des binômes disponibles s occuperont de couler le gel de concentration pendant les manips du matin et assez tôt pour pouvoir charger les gels dès que tous les échantillons seront prêts Préparation des échantillons : Les 2 étudiants d un binôme peuvent travailler séparément : l un prépare les échantillons P et RP et l autre l échantillon M Il n est plus nécessaire de travailler stérilement Préparation des échantillons Plastique jour 3 P3 et Retour sur Plastique jour 2 RP2: Les échantillons sont à traiter en même temps. Observer les T25, prendre des photos Trypsination des cellules : Ne pas mélanger les échantillons!!! Retirer le milieu (poubelle), Rincer avec 2ml de PBS/T25. Mettre ce PBS dans un tube de 15ml Ajouter 0,5ml de trypsine/t25, noter l heure Laisser 5min à l étuve Vérifier que les cellules sont bien décollées, éventuellement taper le flacon pour aider au décollement. Ajouter 0,1 ml de SV (3T3) ou de SVF (CHO) /T25 Mettre les cellules trypsinées dans le tube de 15ml Rincer le T25 avec 2,4ml de milieu simple Ajouter le rinçage au tube de 15ml: il y a 5ml en tout 13

14 Comptage à la cellule de Malassez : Préparer 20µl de suspension cellulaire + 20µl de bleu Trypan Placer la lamelle sur la cellule de Malassez propre Placer 15µl du mélange «suspension cellulaire + bleu Trypan» des deux côtés Compter la totalité de la surface des deux côtés (1 par binôme) sous microscope, comptage PN3, RPN2 Calculer le nombre de cellules par ml et par T25 Binômes 1, 2, 5, 6 Préparation de cellules pour la cytométrie : PCyt3 et RPCyt2 Regrouper les échantillons de deux binômes (1+2 et 5+6) : cellules au maximum, et ajouter du milieu simple QSP 10ml Noter le nombre de cellules/tube Resuspendre le culot dans 1ml de PBS Resuspendre dans 500µl de PBS Ajouter au goutte à goutte et en vortexant à un tube de 15ml contenant 5ml d éthanol à 70% refroidi à -20 C (tube PCyt3 ou RPCyt2 + CHO ou 3T3) Binômes 3, 4, 7, 8 Préparation d échantillon pour le western blot PWB3 et RPWB2 Regrouper les échantillons de deux binômes (3+4 et 7+8) et ajouter du milieu simple QSP 10ml. Attention : ne pas prendre plus de cellules. Noter le nombre de cellules /tube Resuspendre le culot dans 1ml de PBS et transférer dans un tube Eppendorf de 1,5ml (PWB3 ou RPWB2 + CHO ou 3T3) Centrifuger 10min à 400g (1400rpm) Retirer le surnageant (bécher poubelle) Resuspendre dans du tampon Laemmli : 40µl/ cellules Faire bouillir 5min en bloquant le bouchon Préparation des échantillons méthocel jour 3 M3: Observation les cellules, faire des photos. Dilution du méthocel et récupération des cellules Noter l heure Ajouter 24ml de PBS par T25 Bien mélanger le méthocel par agitation douce du flacon 14

15 Transférer le mélange dans 1 tube de 50ml Rincer à nouveau avec 20 ml de PBS par T25 Transférer le mélange dans le tube de 50ml (48 ml/tube) Centrifuger les cellules 10min à 400g (1400rpm) Eliminer le surnageant (poubelle) Ajouter 500µl de trypsine dans le tube de 50ml, homogénéiser Laisser 2min au bain-marie, homogénéiser Ajouter 150µl de SV (3T3) ou SVF (CHO) et 850µl de milieu simple Comptage à la cellule de Malassez : Préparer 2 tubes contenant chacun 20µl de suspension cellulaire + 20µl de bleu Trypan Placer la lamelle sur la cellule de Malassez propre Placer 15µl du mélange «suspension cellulaire + bleu Trypan» des deux côtés Compter la totalité de la surface des deux côtés (1 par binôme) sous microscope, comptage MN3 Calculer le nombre de cellules par ml et par T25 Binômes 1, 2, 5, 6 Préparation de cellules pour la cytométrie Regrouper les échantillons de deux binômes (1+2 et 5+6) : cellules au maximum, et ajouter du milieu simple QSP 10ml Noter le nombre de cellules/tube Resuspendre le culot dans 1ml de PBS Resuspendre dans 500µl de PBS Ajouter au goutte à goutte et en vortexant à un tube de 15ml contenant 5ml d éthanol à 70% refroidi à -20 C (tube MCyt3 + CHO ou 3T3) Binômes 3, 4, 7, 8 Préparation d échantillon pour le western blot Regrouper les échantillons de deux binômes (3+4 et 5+6) et ajouter du milieu simple QSP 10ml. Attention : ne pas prendre plus de cellules. Noter le npmbre de cellules/tube Resuspendre le culot dans 1ml de PBS et transférer dans un tube Eppendorf de 1,5ml (MWB3 + CHO ou 3T3) Centrifuger 10min à 400g (1400rpm) Retirer le surnageant (bécher poubelle) Resuspendre dans du tampon Laemmli : 40µl/ cellules 15

16 Faire bouillir 5min en bloquant le bouchon Réalisation du western blot (cf. protocole spécifique) : Refaire bouillir les échantillons avant le dépôt. Dépôt des échantillons vers 13h. Un puits avec 10µl de marqueur PM Migration jusque vers 14h30-15h, 15mA par gel (le temps du gel de concentration) puis 30. Surveiller la migration. Organisation du jeudi après-midi Réalisation du western blot : 14h30 à 15h30 : démoulage et préparation du transfert 15h30 à 16h30 : transfert, voltage réglé sur 90V pendant 1h. 16h30 : arrêt du transfert, coloration au rouge ponceau, photo iphone 17h à 18h : saturation 18h : 1 er AC sur la nuit (anti-cycline D1 au 1/200) Préparation des échantillons pour la cytométrie (cf. protocole spécifique : ne pas oublier d utiliser du PBS+ 0,1%Triton, surtout pour les CHO) : De 14h15 à 15h : préparation des échantillons pour la cytométrie puis analyse sur la plateforme Imagoseine de l Institut Jacques Monod Fixation des lames labtek RP : Retirer le milieu de culture puis rincer chaque puits 2 fois par 150µl de PBS. Retirer le PBS puis fixer les cellules en ajoutant 150µl de PFA à 4% à température ambiante pendant 30 min. Retirer le PFA puis rincer chaque puits 2 fois par 150µl de PBS. Laisser chaque lavage 2 à 3 min. Neutraliser le PFA par une incubation de 5 min avec 150µl de NH4Cl à 50mM solubilisé dans du PBS puis laver à nouveau 2 fois au PBS Traitement des 6 lames labtek P RP M: 16

17 Mise en évidence du cytosquelette d actine et de tubuline et de la cycline D1 dans les cellules en culture dans des lames labtek par la technique de cytoimmunochimie indirecte (Pour les puits qui seront traités par la cycline : retirer le PBS et mettre 150µl de PBS Tween 0.1% SDS ; laisser 2 ou3 min Rincer 1 fois au PBS) Rinçages et saturation : retirer le PBS puis ajouter dans chaque puits 150µl de solution AbDil, attendre 10min. min. Incubation avec l anticorps primaire : ajouter 100µl de solution AbDil contenant la bonne dilution du (des) anticorps primaire(s). Incuber pendant 45 Rinçages : retirer le PBS contenant les anticorps primaires puis rincer chaque puits 3 fois par 150µl de PBS Tween. Laisser chaque lavage 2 à 3 min. Incubation avec le ou les anticorps secondaire(s) et/ou la phalloïdine : Incubation avec le ou les anticorps secondaire(s) et/ou la phalloïdine : ajouter 100µl de solution AbDil contenant la bonne dilution d anticorps secondaire et de phalloïdine pendant 30min à l obscurité. Rinçages : retirer le PBS contenant les anticorps secondaires puis rincer chaque puits 2 fois par 150µl de PBS Tween. Laisser chaque lavage 2 à 3 min. Rincer ensuite 2 fois chaque puits avec 150µl de PBS simple (le premier de ces lavages contient éventuellement le colorant de l ADN, DAPI ou Hoechst). Laisser chaque lavage 2 à 3 min. Montage : retirer les puits de la lame labtek et le joint. Monter la lamelle au moviol (environ 15µL au dessus de chaque puits) après avoir retirer le PBS restant à l aide d une pipette. PBS (Phosphate Buffered Saline Solution) : NaCl 136,9mM, KCl 2,7mM, Na 2 HPO 4 8,1mM, ph 7,4 Solution AbDil : PBS 1X, 4% BSA, 0,1% Triton X-100, 0,2% Azide Anti alpha tubuline obtenu chez la souris : dilution 1/300 ; Phalloïdine TRITC: dissoute dans le méthanol : à utiliser au 1/100 Anticycline D1 obtenu chez la souris : dilution 1/100 ; Anti lapin FITC dilution mini 1/80 ; Anti souris TRITC dilution mini 1/64 Anti souris FITC dilution mini 1/64, Hoechst : dilution 1/1000 Tous les anticorps et la phalloïdine sont fournis par Sigma 17

18 VENDREDI Organisation du vendredi matin Observation des immunofluorescences de 8h30 à 10h puis en fin de matinée Réalisation du western blot (cf. protocole spécifique) : à 9h30 : Lavages, incubation avec le 2 ème AC de 10h à 11h Lavages et révélation en deux groupes : 2 X 30min Vendredi après-midi : Fin des observations des immunofluorescences. Calcul des temps de génération des 3T3 et des CHO, interprétation des résultats de la synthèse d ADN, de la cytométrie, du western blot, d immunofluorescence 18

19 Protocole du Western Blot : Préparation des échantillons : Les culots de cellules sont reususpendus dans du tampon d échantillon ou Laemmli dont la composition est la suivante : 200 mm Tris-HCl,pH6,8 20% glycérol 0,05% bleu de bromophénol 10% SDS 10 mm -mercapto-ethanol Les échantillons ont ensuite portés à ébullition pendant 3min (verrouiller el couvercle à l aide d un cavalier) Préparation du gel de séparation : Mettre des gants et des lunettes de protection pour le manipulateur Avant le montage des gels, laver les plaques à l eau déminéralisée et à l alcool. Volume Concentration finale Acrylamide / BisAcryl 29 : 1 40% 1,25 ml 10% Tris 1.5M ph8.8 1,25 ml M H2O 2,40 ml SDS 10% 50 µl 0.1% APS 10% 50 µl 0.05% TEMED 5 µl 5 ml total (dépôt de 4,5 ml pour le gel) Attention, les 2 derniers composés sont ajoutés rapidement en dernier, puisqu ils entraînent la polymérisation du gel. Couler délicatement le gel 19

20 Recouvrir délicatement avec de l eau distillée A cette étape, le gel peut être soigneusement emballé et gardé à 4 C toute la nuit. Préparation du gel de concentration : Mettre des gants et des lunettes de protection pour le manipulateur 1- Dans un tube de 5 ml prélever et déposer dans l ordre les réactifs suivants : Volume Concentration finale Acrylamide / BisAcryl 29 : 1 40% 0.2 ml 4% Tris 0.5M ph ml M H2O 1.25 ml SDS 10% 20 µl 0.1% APS 10% 20 µl 0.5% TEMED 5 µl 2 ml total Attention, les 2 derniers composés sont ajoutés rapidement en dernier, puisqu ils entraînent la polymérisation du gel 20

21 2- Enlever l eau présente à la surface du gel de résolution (déjà coulé) juste avant de mettre l APS et le Temed dans le mix du gel de concentration. 3- Couler rapidement le gel entre les 2 plaques de verre et mettre le peigne 10 dents en commençant par une extrémité comme indiqué dans la figure ci-dessous : 4- Attendre 15 min pour la polymérisation Migration du gel : Remplir la cuve interne d électrophorèse avec du tampon de migration jusqu en haut Cuve interne Cuve externe Mettre environ 800 ml de tampon de migration dans la cuve externe Pour information, voici la composition du tampon d électrophorèse: 25 mm Tris 192 mm Glycine 0.1% SDS 21

22 Déposer 30 µl de chaque échantillon, 1 par 1, dans chaque puits à la pipette P100. Dans le 1 er puits mettre 10µl de marqueur de PM Anode Cathode Brancher les électrodes de l appareil à électrophorèse sur le générateur (attention à respecter les polarités) Appliquer un courant électrique de 15 puis 30 ma par gel Arrêter la migration lorsque le front (bleu de bromophénol) arrive en bas du gel Transfert du gel : 22

23 1- Débrancher les électrodes de l appareil à électrophorèse sur le générateur 2- Avant la fin de la migration électrophorétique, immerger la membrane de transfert nitrocellulose dans un plat rempli de tampon de transfert Manipuler la membrane impérativement avec des gants et une pince plate! Pour information, voici la composition du tampon de transfert 1X: 48 mm Tris 39 mm Glycine 0.037% SDS 15% Isopropanol 3- Faire tremper 2 Whatman (7x10 cm), 2 éponges et la membrane de transfert nitrocellulose (7x10 cm) dans un plat rempli dans tampon de transfert 1X 4- Déposer dans l ordre sur la partie blanche du panier de transfert : - 1 éponge essorée issue du plat rempli dans tampon de transfert 1X - 1 Whatman issu du plat rempli dans tampon de transfert 1X - la membrane de nitrocellulose issue du plat rempli dans tampon de transfert 1X. 5- A la fin de la migration de l électrophorèse(5 minutes après la sortie du front), démouler le gel en se servant des espaceurs noirs comme levier 6- Enlever le gel de concentration et faire une encoche dans le gel de résolution pour identifier le sens du gel. 7- Mettre le gel à équilibrer quelques secondes dans le plat rempli dans tampon de transfert 1X - déposer délicatement sur la membrane le gel d électrophorèse issu du plat rempli dans tampon de transfert 1X - enlever toutes les bulles entre la membrane et le gel en faisant rouler doucement une pipette trempée dans le tampon de transfert 1X - 1 Whatman issu du plat rempli dans tampon de transfert - 1 éponge essorée issue du plat rempli dans tampon de transfert 1X 8- Refermer le panier de transfert et l insérer dans le système d électrodes de transfert en mettant la partie noire du panier vers l électrode noire. 9- Remplir le bac blanc de glaçons et le disposer dans la cuve de transfert 10- Remplir la cuve avec le tampon de transfert 1X 11- Brancher les électrodes sur le générateur et appliquer un courant électrique de 90 V pendant 1 heure Coloration et blocage de la membrane 1- A la fin du transfert, sortir le panier de transfert de l électrode 2- Défaire le sandwich et prendre la membrane de nitrocellulose Manipuler la membrane impérativement avec des gants et une pince en plastique jaune! 3- Mettre la membrane dans le plat contenant du rouge Ponceau et agiter à la main jusqu à apparition de bandes (environ 1 min). Remettre le rouge Ponceau dans son tube initial. 23

24 4- Décolorer partiellement la membrane dans de l eau. Agiter à la main puis sécher la membrane en la recouvrant avec un papier absorbant. 5- Faire une photocopie de la membrane partiellement décolorée. Noter au crayon la place des marqueurs de poids moléculaire ainsi que la place des puits et découper la membrane en deux (chaque binôme récupère sa partie de membrane) 6- Déposer la membrane dans une boîte (identifiée par le numéro du binôme). Laver la membrane en incubant 3 x 2 min avec 12 ml de tampon TBST Composition du TBST (Tris buffer saline Tween 20) : NaCl 0,14M K Cl 0.003M Tris 0.025M Tween 20 0,1% 7- Remplacer le TBST par 12 ml de TBST+10% lait et laisser agiter sur la balancelle pendant 60 minutes 8- Laver la membrane en incubant 3 x 2 min avec 12 ml de tampon TBST Incubation avec les anticorps et révélation : 1- Mettre 2 ml de tampon TBST + BSA 5% contenant les différents anticorps primaires dilués. Laisser agiter sur la balancelle pendant la nuit à 4 C 2- Récupérer soigneusement les anticorps primaires 3- Laver la membrane en incubant 3 x 1 min avec 12 ml de tampon TBST 4- Mettre 5 ml de tampon TBST + lait 5% contenant les différents anticorps secondaires dilués 5- Laisser agiter sur la balancelle pendant 1 heure 6- Laver la membrane en incubant 3 x 1 min avec 12 ml de TBST 7- Mélanger 0.4 ml de solution A (bouchon blanc) avec 0.4 ml de solution B (bouchon noir) dans un tube 8- Déposer le mélange sur la membrane afin de la recouvrir entièrement et mélanger à la pipette pendant 2 minutes 9- Mettre la membrane dans une pochette en plastique dans une cassette de révélation sans faire de bulles (4 membranes/cassette) Manipuler exclusivement dans la chambre noire 10- Déposer un film photographique sur la pochette, refermer la casette et exposer 2 minutes 11- Révéler le film en le plongeant 1 minute dans le bain de révélateur 12- Transférer le film dans le bac contenant le fixateur et agiter doucement pendant 1 minute 13 Transférer le film dans le bac contenant l eau et agiter doucement pendant 1 minute 14- Laisser sécher le film 24

25 Détermination du nombre de cellules dans chaque phase du cycle cellulaire par mesure du contenu en ADN dans chaque cellule par cytométrie en flux Cellules : les échantillons ont été préparés à partir des cellules (3T3 ou CHO) des jours 0, 1, 2, 3 obtenues dans les différentes conditions de culture (P, M, RP), fixés dans l éthanol à 70% et conservés à -20 C. Coloration : Centrifuger les cellules fixées dans l éthanol à 70% 10min à 400g (1400rpm) et retirer celui-ci. Pour les CHO : Suspendre les cellules dans 500µl de PBS+Triton 0,1%, ajouter 1µl de RNase A (RNase A de pancréas de bœuf à 2,76 ku/ml en suspension dans le glycérol) pour digérer les ARN cellulaires ; après 5min à température ambiante, colorer l ADN en ajoutant 20µl d iodure de propidium à 0,5mg/ml. Pour les 3T3 : Suspendre les cellules dans 500µl de PBS, ajouter 1µl de RNase A (RNase A de pancréas de bœuf à 2,76 ku/ml en suspension dans le glycérol) pour digérer les ARN cellulaires ; après 5min à température ambiante, colorer l ADN en ajoutant 20µl d iodure de propidium à 0,5mg/ml. Cytométrie en flux : mesurer la fluorescence de l iodure de propidium de chaque cellule avec un cytomètre en flux Coultronics à l aide d un laser à 488nm. L intensité de la lumière émise par chaque cellule est proportionnelle à sa quantité d ADN. 25