I / L organisation du génome nucléaire

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1 Définition du sujet et limites : Le génome contient l information biologique nécessaire au développement et à la réalisation de toutes les fonctions des organismes. Il correspond à l ensemble du contenu d ADN (acide désoxyribonucléique). L ADN étant le support universel de l information génétique, et donc pas des seuls Eucaryotes, sa structure sera présentée rapidement sans développer les expériences historiques qui ont permis de l élucider et de montrer son rôle. En revanche, pourront être évoquées les expériences qui ont permis le décryptage du génome. Dans les cellules eucaryotes, celui-ci est pour l essentiel situé dans le noyau et définit le génome nucléaire, porté par les chromosomes. De l ADN s observe également dans les organites semi-autonomes, mitochondries et chloroplastes, constituant respectivement les génomes mitochondriaux et chloroplastiques. L accomplissement des fonctions biologiques repose sur l intervention de nombreuses protéines, dont la séquence est codée par l information génétique de l ADN. Ces protéines représentent ainsi l expression du génome, du moins des parties codantes de celui-ci, transcrites en ARNm. Une large part du génome ne conduit cependant pas à l expression de protéines. L ADN code par exemple un certain nombre d ARN qui ont par eux-mêmes une fonction et qui ne sont pas traduits en protéines : c est le cas des ARN ribosomiques, des ARN de transfert et de nombreux petits ARN catalytiques qui peuvent par exemple intervenir dans la maturation des ARN messagers. L ensemble de toutes ces parties transcrites constitue les gènes. D autres parties de l ADN, pourtant développées et parfois présentes en séquences répétitives, ne sont le siège d aucune activité de transcription. Problématique : L étude de l organisation du génome suppose que soient envisagées la part relative des différents types de séquences, leur distribution dans l ADN et dans les structures chromosomiques et leur signification informative. Elle peut être précédée d un bref rappel de la structure de la molécule en dégageant ce qui lui confère cette extraordinaire capacité d encodage de l information génétique et sa reproductibilité mais l organisation de l ADN en soi est hors sujet. La dimension du génome eucaryote découpé en chromosomes linéaires impose une compaction nécessaire à son stockage autant qu à son activité, il s agira d en préciser les modalités. L étude de l expression est d abord celle de la transcription, puis celle de la maturation des ARN, qui représentent deux étapes clés dans la production et la régulation des flux d informations au sein d une cellule. Chez les eucaryotes, la localisation nucléaire du génome introduit une étape supplémentaire dans la régulation de son expression, régulation qui sera présentée à chaque étape de l expression du génome. I / L organisation du génome nucléaire A / Organisation chromosomique et taille du génome 1 / Organisation chromosomique. Chaque chromosome d Eucaryote ne contient qu une seule molécule d ADN linéaire. Le nombre et la structure des chromosomes sont caractéristiques de chaque espèce et définissent le caryotype de celle-ci. Chaque chromosome peut présenter quatre types d espèces moléculaires : l ADN double brin, des protéines d empaquetage : les histones, différents types d ARN messagers, de transfert et ribosomiques résultant de la transcription, les protéines intervenant dans la transcription, la réplication et la réparation de l ADN. On ne traitera pas précisément des mécanismes d empaquetage. Il importe de rappeler que l ADN est structuré en chromatine par des protéines. On mentionnera la différence existant entre euchromatine (zones faiblement colorées) et hétérochromatine (zones fortement colorées).

2 Des expériences de cartographie des chromosomes montrent que la plupart des gènes actifs qui sont identifiables grâce à des mutations sont situés dans l euchromatine. Celle-ci se colore moins intensément parce qu elle est empaquetée de façon plus lâche. L idée généralement acceptée est qu il s agit de l état le plus compatible avec la transcription et l activité des gènes. Chez la plupart des organismes, l hétérochromatine se trouve surtout de part et d autre des centromères. 2 / Taille du génome et nombre de gènes Mesure par densitométrie après coloration Feulgen et maintenant par fluorométrie (ou cytométrie à flux) où l ADN est marqué par du DAPI, une molécule fluorescente qui se lie fixement à l ADN et émet une fluorescence bleue brillante lorsqu elle est éclairée par des UV. Discussion des relations entre nombre de gènes, taille du génome et complexité des organismes. Portion de l ADN finalement codant. - Estimation du nombre de gènes : Précédemment, pour estimer le nombre de gènes d une espèce, on utilisait les résultats génétiques ou on comparait la quantité d ADN présente dans cette espèce à celle d autres espèces connues. Actuellement, les estimations issues de projets génomes proviennent des programmes informatiques de recherche des gènes dans les séquences d ADN. Dans certains cas, la première méthode a pu conduire à des sous-estimations du nombre de gènes lorsque des gènes ne présentaient pas de forme mutante identifiable par un phénotype particulier. La génomique a permis d entreprendre le séquençage du matériel génétique de nombreux organismes eucaryotes : Saccharomyces cerevisiae, Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, Arabidopsis thaliana, génome humain. Actuellement le génome humain est estimé à environ gènes. Drosophile : environ à gènes. Caenorhabditis : environ gènes Saccharomyces : environ 6000 gènes Arabidopsis : environ gènes - La taille du génome peut être exprimée en nombre de bases : Homme : ( soit 3000 Mb) Drosophile : 1, Caenorhabditis : 9, Arabidopsis : 10 8 De manière plus générale, la taille du génome des Eucaryotes s étend de 10 Mb (Saccharomyces : 12 Mb) à Mb (Fritillaire). Certains végétaux ont un génome important (Triticum : Mb). - Les relations entre nombre de gènes, taille du génome et complexité des organismes sont difficiles à discuter : - La taille du génome n est pas directement en relation avec le nombre de gènes : il y a plus de gènes chez Caenorhabditis que chez la Drosophile, alors que son génome est plus petit. - Le génome de la levure est 250 fois plus petit que celui de l homme et pourtant son nombre de gènes n est pas 100 mais de près de Le génome humain est 30 fois plus petit que celui de certains végétaux et amphibiens et 200 fois plus petit que celui d une espèce d amibe. - La teneur en ADN de génomes d organismes similaires (ex : poissons osseux, amphibiens) peut varier de plusieurs centaines de fois alors que le génome contient grossièrement le même nombre de gènes. - Des espèces très apparentées et ayant des tailles de génome identique peuvent avoir un nombre très différent de chromosomes de tailles différentes : il n y a pas de relations simples entre le nombre de chromosomes, la complexité des espèces et la taille totale du génome. Ces valeurs suggèrent l existence de parties plus ou moins importantes non exprimées (génome de la levure : moins de gènes morcelés : 239 introns pour l ensemble du génome alors qu on peut observer

3 chez des Eucaryotes plus complexes, jusqu à 100 introns dans un seul gène ; moins de séquences répétitives). - L ADN finalement codant chez l homme ne représente que 3 % du génome. B / Les différents types de séquences Résultats d expériences de réassociation de l ADN, % de réassociation en fonction de Cot (quantité totale d ADN x temps) On peut utiliser ici les résultats d expériences de réassociation de l ADN : des échantillons d ADN provenant de noyaux eucaryotes sont chauffés pour provoquer leur dénaturation, puis refroidis lentement. On suit alors la cinétique de réassociation de séquences complémentaires, initialement dissociées et qui se retrouvent grâce aux mouvements aléatoires des molécules en solution. On observe que l ADN se réassocie beaucoup plus rapidement qu il n était prévu dans l hypothèse de brins séparés de gènes uniques. Ces résultats ne s expliquent qu en postulant l existence de séquences d ADN présentes en de nombreux exemplaires dans le génome : ces expériences conduisent à mettre en évidence l ADN répétitif (avec des séquences moyennement et fortement répétées). On distinguera ainsi des séquences en un seul exemplaire, qui correspondent à des gènes fonctionnels et des séquences répétitives, qui peuvent correspondre à des séquences fonctionnelles ou à des séquences dont la fonction reste mal connue. C / Les séquences répétitives 1 / Les séquences répétitives codantes a / les familles de gènes dispersées Plusieurs types de protéines sont codées par des familles de gènes homologues, dispersés dans tout le génome. De telles familles peuvent ne comporter que peu de gènes ou au contraire beaucoup : - Actines : de 5 à 30 gènes. - Kératines : plus de 20 gènes. - Chaîne lourde de la myosine : 5 à 10 gènes. - Histones : 100 à 1000 gènes. Les séquences des gènes d une famille peuvent diverger et les gènes homologues avoir acquis des fonctions légèrement différentes. Certains gènes ont cessé d être fonctionnels et sont devenus des pseudogènes. Un pseudogène est une séquence nucléotidique de l ADN qui ressemble beaucoup à celle d un gène fonctionnel mais qui contient de nombreuses mutations (par délétion) empêchant sa propre expression. La plupart des pseudogènes proviennent de la duplication d un gène fonctionnel suivie de l accumulation de mutations qui ont endommagé la copie. Gènes le plus souvent morcelés : exons et introns b / les familles de gènes alignés en tandem

4 Les gènes des ARN structuraux (ARNTt) Les gènes des histones L organisateur nucléolaire Les cellules ont besoin de grandes quantités de produits de certains gènes et les familles de ces gènes ont évolué sous forme de séquences en tandem. Exemple de l organisateur nucléolaire : l organisateur nucléolaire des chromosomes X et Y de la drosophile contient respectivement 250 et 150 copies en tandem des gènes d ARNr. Une telle redondance est un moyen de garantir une grande quantité d ARNr par cellule. Les gènes des histones de certaines espèces dont la drosophile ou l oursin sont alignés en tandem, avec de multiples copies identiques (ce qui suppose un mécanisme assurant l invariance des copies). 2 / Les séquences répétitives en tandem et non codantes : l ADN satellite 20 % du génome humain constitué de séquences répétitives non fonctionnelles. a / Identification de l ADN satellite Ultracentrifugation dans un gradient de CsCl2, se distingue par une densité moindre (1,7) (densité de GC 40,3%) Constitué de très longs alignements (plusieurs centaines de kb) qui se retrouvent au niveau des centromères, dans les régions télomériques et dans une partie du chromosome Y des Mammifères. ADN satellite : le terme d ADN satellite provient de la manière dont celui-ci a été isolé pour la première fois. Une technique de purification de l ADN consiste à procéder à une ultracentrifugation dans une solution de chlorure de césium. Sous l effet de la centrifugation, ce sel se répartit dans un gradient de concentration croissante depuis le haut jusqu au bas du tube. Les fragments d ADN migrent dans la région du tube qui correspond à leur propre densité. Celle-ci est d autant plus forte que l ADN est riche en C-G. Il se forme une bande principale d ADN correspondant à la densité conférée par le contenu en C- G moyen caractéristique de l espèce étudiée. Des bandes de densité différente, appelées satellites parce qu elles entourent la bande majoritaire, peuvent être observées. Si la composition en C-G de ce motif dévie de la composition moyenne en C-G de l organisme considéré, il s ensuit une densité différente de ces fragments. Exemple de l ADN humain : rupture de l ADN en fragments de 50 à 100 kb. Une bande principale avec une densité moyenne de 1,701 et qui correspond à une teneur moyenne en séquences CG de 40,3 %. 3 bandes satellites de densité 1,687 ; 1,693 ; 1,697 qui traduisent des zones de séquences en CG différentes. Les régions d ADN hautement répétitives issues d une chromosome eucaryote, sont généralement identifiables par leur composition particulière en nucléotides. L ADN satellite n est pas transcrit et n a pas de fonction connue. (Rmq : Pas d ADN satellites chez les Procaryotes). b / L ADN centromérique hautement répétitif La séquence consensus de cet ADN satellite contient un enchaînement de 17 pb, la boîte CENP-B qui se lie spécifiquement aux protéines CENP du centromère. Région dépourvue d OR, la dernière à être répliquée. 5% du génome total Chez les Vertébrés, la région centromérique contient plusieurs centaines de kb d ADN satellite constitué de séquences d ADN répété. L ADN satellite est présent au niveau de la constriction primaire de tous les

5 chromosomes humains. La séquence consensus de cet ADN satellite contient un enchaînement nucléotidique de 17 paires de bases, appelé boîte CENP-B qui se lie spécifiquement à une protéine du centromère, la protéine CENP (CENtromere Protein). La nature particulière de l ADN centromérique est reflétée par la présence d au moins 7 protéines qui ne sont retrouvées nulle part ailleurs dans le chromosome. L une d elles est la CENP-A, très voisine de l histone H3. On pense qu elle peut remplacer celle-ci dans les nucléosomes centromériques sans que l on comprenne pour l instant les modifications qu elle y engendrerait. Une hypothèse découle de l observation que la région centromérique est la dernière région à être répliquée. L ADN de cette région serait ainsi dépourvu de séquences d origine de réplication, ce qui assure la réplication retardée de cette zone. Les séquences répétitives de l ADN seraient un moyen de garantir l absence d origines de réplication. c / Les minisatellites Longueur autour de 10 à 30 pb. Ex ADN télomérique Dispersés dans le génome se distinguent par la taille des motifs qui se répètent de 10 à 100 fois. Peut être en nb variable ds différentes positions chromosomiques et chez des membres distincts d une même espèce, répétitions en tandem : VNTR Les minisatellites forment des fragments de longueur voisine de 20 kb, avec des unités répétées d environ 10 à 30 pb. Un exemple de minisatellite est représenté par l ADN télomérique. Les télomères contiennent des alignements en tandem de séquences simples d ADN, qui ne codent pas d ARN ni de protéines mais qui ont des fonctions bien précises. (Cilié Tetrahymena : répétition de la séquence TTGGGG.) (Homme : répétition de la séquence TTAGGG.) Les répétitions observées au niveau des télomères jouent un rôle bien défini dans la réplication : on sait que le brin tardif atteint un endroit au-delà duquel le système d amorçage par l ARN ne peut plus fonctionner et il reste un fragment non polymérisé ce qui devrait aboutir à la formation d un chromosome tronqué. Une enzyme, la télomérase, ajoute les unités répétées simples aux extrémités du chromosome. La télomérase est une enzyme de la classe des transcriptases inverses. Elle fournit une courte molécule d ARN dont une partie sert de matrice à la polymérisation de l unité télomérique répétée. (Chez Tetrahymena, l ARN a la séquence 3 AACCCC-5 et sert de matrice pour l unité répétée 5 -TTGGGG-3 ) (Les télomères sont indispensables à l intégrité des chromosomes : en leur absence, les chromosomes deviennent instables et fusionnent avec d autres chromosomes ayant subi le même événement). En plus des minisatellites télomériques, certains génomes eucaryotes contiennent d autres fractions d ADN minisatellites, dont le rôle n a pas encore été élucidé. L ADN minisatellite peut être présent en nombre variable dans différentes positions chromosomiques et chez des membres distincts d une même espèce : on appelle ce type de répétitions, répétitions en tandem en nombre variable : VNTR : variable number tandem repeats. Chez l homme, les locus des VNTR sont des séquences de 1 à 5 kb contenant un nombre de répétition de 15 à 100 nucléotides. En raison de la variabilité du nombre de répétitions en tandem d un individu à l autre, l ensemble des fragments qui apparaissent sur l autoradiographie est hautement spécifique de chaque individu. Ces profils de bandes constituent les empreintes génétiques (DNA fingerprints). d / Les microsatellites Ce sont des fragments courts, inférieurs à 150 bp et les unités répétées 10 à 20 fois sont de 4 paires de bases ou moins. Chez l homme par exemple, l ensemble des microsatellites de motif CA représente au total 15 Mb, soit 0,5 % du génome.

6 La fonction de ces microsatellites reste inconnue. Le nombre de répétitions peut varier d un individu à l autre, ce qui en fait de bons marqueurs génétiques. La variabilité du nombre de copies résulte de glissements qui se produisent au cours de la réplication. Bilan microsatellites / minisatellites Les motifs répétés sont appelés microsatellites si la taille du motif est restreinte à 2 ou 3 nucléotides (par exemple (CA)n ou (CGA)n). Ils sont appelés minisatellites si les motifs répétés comportent un plus grand nombre de nucléotides. Celui-ci peut aller jusqu à quelques dizaines. Le nombre de motifs qui constituent les microsatellites et les minisatellites est variable. Ces variations de taille résultent soit de glissement de l ADN polymérase au cours de la réplication, soit de recombinaison entre deux motifs en positions différentes. 3 / Les séquences répétitives transposées Barbara Mc Clintock éléments sauteurs (Nobel en 83) 40% du génome chez l H Séquence d ADN capable de se déplacer de façon autonome dans le génome et de s y multiplier, ces séquences codent l ensemble des protéines nécessaires à leur déplacement. Une forte proportion du génome eucaryote est constituée d éléments répétitifs qui se sont propagés dans le génome en fabriquant des copies d eux-mêmes, capables de gagner d autres positions. Les éléments génétiques transposables sont encore plus courants dans les chromosomes eucaryotes que dans les chromosomes bactériens. 25 à 40 % des chromosomes de Mammifères sont constitués d éléments transposables qui se sont accumulés au cours de l évolution (homme 30 % d éléments transposables). La moitié des mutations spontanées observées chez la drosophile sont attribuées au déplacement et à l insertion d éléments transposables. Il existe différents types de séquences transposées a / Les transposons Se déplacent selon un mode couper-coller ou copier-coller s il y a réplication avant transposition. Se déplacent grâce à une transposase codée par le transposon. Ils portent à leur extrémité des courtes séquences répétées encadrant la séquence codant l enzyme. La transposition se fait sous forme d ADN et n implique pas de passage par l ARN (ce qui caractérise les rétrotransposons). Chez les Eucaryotes, les transposons sont moins fréquents que les rétrotransposons. Ils ont cependant été découverts sur le maïs et ont été reconnus chez la drosophile. Ils peuvent déterminer des transferts horizontaux de gènes entre espèces (exemple : élément mariner reconnu chez la drosophile et retrouvé chez d autres espèces dont l homme). Les transposons à ADN sont encore appelés transposons de type bactérien. Les transposons contiennent un ou plusieurs gènes encadrés par de courtes répétitions terminales inversées (RTI) à leurs extrémités. Un de ces gènes code pour une transposase qui opère les coupures de l ADN permettant la libération du transposon de son emplacement de départ et son insertion dans la nouvelle position. L élément P de la drosophile et l élément Ac/Ds du maïs sont des exemples bien étudiés de transposons à ADN b / Les rétrotransposons Classe 1 se déplacent selon un mode copier-coller et sont spécifiques des Eucaryotes ; Après transcription par l ARN pol II, l ARN est rétrotranscrit en ADN par la transcriptase réverse codée par le transposon. L ADN est intégré dans le génome par un intégrase. Transposons à LTR, importantes similitudes avec les rétrovirus. - les rétrotransposons de type rétroviral : LTR elements. Ceux-ci renferment généralement deux gènes (gag et pol) et sont encadrés par de longues répétitions terminales d une taille de quelques centaines de nucléotides, appelées LTR, Long Terminal Repeat). Les transcrits de ces gènes peuvent être recopiés en ARN grâce à une transcriptase inverse codée par le gène pol. L ADN ainsi obtenu peut lui-même aller s intégrer dans une nouvelle position

7 chromosomique grâce au gène gag. Le nom de transposon de type rétroviral est justifié par le fait qu ils se rapprochent de la famille des rétrovirus. Ceux-ci possèdent des gènes homologues. La seule différence est que, contrairement aux rétrovirus, les rétrotransposons ne possèdent pas de forme extracellulaire connue et ne sont pas infectieux. Exemple : élément Ty1 de la levure : 35 copies par génome. Ces éléments Ty provoquent des mutations par insertion dans différents gènes du chromosome. Exemple : élément de type copia chez la drosophile avec au moins 7 familles, de taille variant de 5 à 8,5 kb. Les membres de chaque famille apparaissent en 10 à 100 positions dans le génome de drosophile. Chaque membre porte une longue répétition terminale ainsi qu une courte répétition inversée. Certaines mutations classiques (couleur white-apricot de l oeil) résultent de l insertion d éléments de type copia Rétrotransposons sans LTR : Ce sont les transposons les plus fréquents rencontrés chez les Mammifères. Ces éléments présentent une région polya à une extrémité. - élément LINE : long interspersed nuclear elements : longs éléments dispersés. Les éléments LINE possèdent les gènes équivalents aux gènes gag et pol. Ils contiennent un gène codant pour la transcriptase réverse. Chez l homme, il existe des dizaines de milliers de copies d éléments LINE. Exemple : LINE-1 : 6,1 kb copies sous la forme la plus longue et plusieurs centaines de milliers de copies tronquées codent les enzymes nécessaires à la réverse transcription et à l intégration également - éléments SINE : short interspersed nuclear elements : courts éléments dispersés. Ils ne possèdent pas de gène codant la transcriptase réverse, ils ont donc perdu leur autonomie. La transposition se fait en empruntant les transcriptases synthétisées par d autres éléments. Le SINE le plus commun dans le génome humain est Alu, présent à près d un million de copies. Cette séquence répétitive est ainsi appelée car elle contient un site de coupure spécifique de l enzyme de restriction Alu. Le génome humain en contient des centaines de milliers de séquences entières ou tronquées, dispersées entre les gènes et même dans les introns qui constituent environ 5% de l ADN humain. La séquence Alu complète est longue d environ 200 nucléotides et est retrouvée en moyenne tous les 5 kb. Les transposons sont les acteurs de la dynamique du génome à deux niveaux : - immédiat, dans le déplacement d un élément - à long terme : une dynamique liée à la nature répétées de ces éléments Les conséquences dépendent de la région où se fait l insertion. - SINE : Bilan Organisation de l ADN eucaryote :

8 Un grand nombre de séquences répétitives ont des fonctions inconnues et l on estime globalement qu environ 20 % du génome humain est constitué de séquences répétitives non fonctionnelles d un type ou d un autre. Une dernière classe d ADN est l ADN intercalaire (spacer) qui est ce qui reste après que toutes les catégories précédentes ont été identifiées. Cet ADN est mal étudié et sans fonction connue. Le concept de la sélection naturelle impliquait l élimination de l ADN non fonctionnel et on aurait pensé que cet ADN non fonctionnel était un fardeau génétique ne serait-ce qu en raison de l énergie nécessaire à sa réplication. Rôles hypothétiques : - «Ballast génétique» : donne aux chromosomes la masse critique requise pour une ségrégation efficace lors de la division cellulaire. - Séparation des éléments fonctionnels (les gènes), condition pour permettre une régulation efficace. II / L organisation des génomes extranucléaires Les génomes extranucléaires sont situés dans les mitochondries et les chloroplastes. A / Organisation générale ADN circulaires, souvent en plusieurs exemplaires et donc quantitativement importants dans la cellule eucaryote. Présence de nucléoïdes comme pour les chromosomes bactériens. Origine endosymbiotique. Des différences : code génétique et nombre et nature des ARNt (22/32 gènes). La plupart des chromosomes de ces organites apparaissent comme des molécules circulaires d ADN. Toutefois, on a reconnu aussi la présence de molécules linéaires. Les chromosomes d organites sont par ailleurs présents en de nombreux exemplaires. Chaque mitochondrie humaine contient de 2 à 10 molécules identiques avec un nombre de mitochondries par cellule variant d un type cellulaire à l autre. Les fibroblastes humains contiennent ainsi plusieurs centaines de molécules d ADNmt tandis que les ovocytes humains en possèdent près de Une cellule type de levure haploïde peut contenir de 1 à 45 mitochondries, chacune contenant de 40 à 100 molécules d ADN. Les chloroplastes contiennent des zones spécifiques qui réagissent fortement aux colorants de l ADN : on appelle ces régions des nucléoïdes (éléments retrouvés aussi dans les mitochondries).

9 Chaque chloroplaste de betterave contient de 4 à 8 nucléoïdes, eux-mêmes constitués individuellement de 4 à 18 molécules d ADN, soit environ 140 copies d ADN. B / Les génomes mitochondriaux Petite taille, organisation compacte (H 17 kb), faible nb de gènes (H 37 gènes) Les génomes mitochondriaux sont généralement de petite taille, avec une organisation compacte, les gènes étant situés près les uns des autres. Génome mitochondrial humain : pb (soit environ17 kb) ; Saccharomyces cerevisiae : 75 kb ; Arabidopsis thaliana : 367 kb Le nombre de gènes reste faible : Homme : 37 ; Saccharomyces cerevisiae : 35 ; Arabidopsis thaliana : 52 Deux fonctions essentielles du génome mitochondrial : - Il code certaines des protéines constituant le système de phosphorylation oxydative. - Il code des ARNt, ARNr et certaines protéines, utilisés dans la synthèse des protéines mitochondriales. Rmq : les autres protéines du système de phosphorylation oxydative sont codées par des gènes nucléaires. L ARNm est traduit hors de la mitochondrie par les ribosomes cytosoliques. Les protéines synthétisées sont transportées dans la mitochondrie et le système est assemblé dans la membrane mitochondriale interne. Le génome des mitochondries humaines comprend 13 gènes codant pour les protéines du système de phosphorylation oxydative, 22 gènes codant pour les ARNt mitochondriaux (et 2 gènes pour des ARNr). Ces ARNt assurent toute la traduction réalisée dans les mitochondries. Leur nombre est inférieur aux 32 ARNt requis pour traduire les ARNt fabriqués dans le noyau. Cette économie est permise par un flottement encore plus net de l appariement des anticodons des ARNt. Les codons représentatifs sont alors différents de ceux du code génétique nucléaire. On observe également des introns dans plusieurs gènes mitochondriaux de levure. C / Les génomes chloroplastiques Taille de 120 à 200 kb 136 gènes (4 ARNr, 31 ARNt, 90 protéines PS et CTE) Hérédité cytoplasmique, transmission horizontale des gènes, beaucoup son passé dans le génome nucléaire. La taille des molécules est comprise entre 120 et 200 kb. La molécule de Marchantia polymorpha (hépatique des fontaines) a pour taille 121 kb. Elle comprend 136 gènes codant entre autres quatre sortes d ARNr, 31 sortes d ARNt et environ 90 protéines. 20 protéines concernent les fonctions de photosynthèse et de transport des électrons. III / L expression du génome : la transcription Intervention des différentes molécules d ARN. - ARNm : traduits en protéines. - ARN fonctionnels qui ne sont jamais traduits en protéines et remplissent leurs fonctions uniquement en tant qu ARN. - Deux classes sont présentes dans toutes les cellules, procaryotes et eucaryotes : - ARN de transfert. - ARN ribosomaux.

10 - Trois classes sont spécifiques aux Eucaryotes : - petits ARN nucléaires : ARNsn : ils participent à l épissage des transcrits primaires en ARN messagers dans le noyau. Des protéines spécifiques se combinent aux ARNsn pour former de petites particules ribonucléosomiques (RNPsn) qui servent de plateformes aux réactions d épissage - petits ARN nucléolaires (ARNsno) : (ou guide de méthylation) : ils sont utilisés pour la maturation ou la modification chimique des ARNr. - petits ARN cytoplasmiques (ARNsc) : ils commandent le trafic des protéines. Ils garantissent par exemple que des polypeptides destinés à être sécrétés hors de la cellule soient insérés dans le réticulum endoplasmique. Ils interviennent aussi dans d autres processus : synthèse des télomères, inactivation du chromosome X. Les fonctions de tous les ADN et les ARN reposent sur deux éléments clés : - Les bases complémentaires dans les chaînes nucléotidiques simple-brin peuvent contracter des liaisons hydrogènes pour former des structures double-brin. - Des séquences de bases particulières dans les acides nucléiques simple ou double brin peuvent être reconnues par des protéines qui se fixent aux acides nucléiques. A / Mise en évidence expérimentale dʼun intermédiaire dʼarn Expérience de marquage avec des précurseurs radioactifs de l ARN : Uridine tritiée (chasse isotopique ou pulse chase) : apparition de l ARN d abord dans le noyau puis dans le cytoplasme. B / Les différentes étapes de la transcription Chaque segment transcrit d ADN est une unité de transcription. Chez les eucaryotes, une unité de transcription typique contient les informations d un seul gène et code pour une seule molécule d ARN ou une seule protéine (ou groupe de protéines apparentées si le transcrit d ARN initial est épissé de plusieurs façons et produit différents ARNm) (Rmq : Chez les bactéries, un groupe de gènes adjacents est souvent transcrit sous forme d une seule unité ; la molécule d ARN qui en résulte porte donc les informations de diverses protéines distinctes (opérons ; ARN polycistroniques)). 1 / L initiation Les régions de l ADN qui signalent l initiation de la transcription sont les promoteurs. L enzyme qui catalyse la transcription est l ARN polymérase. Chez les Procaryotes : un seul type d ARN polymérase transcrit tous les types d ARN. Chez les Eucaryotes, il y a trois ARN polymérases différentes : - l ARN polymérase I catalyse la synthèse des ARNr. - l ARN polymérase II catalyse la synthèse des ARNm. - l ARN polymérase III catalyse la synthèse des ARNt ainsi que les petites molécules d ARN nucléaires et cellulaires. Plusieurs autres différences : - Alors que l ARN polymérase bactérienne peut initier la transcription sur une matrice d ADN in vitro sans l aide d une autre protéine, l ARN polymérase des eucaryotes ne le peut pas et nécessite l intervention d un groupe important de protéines, les facteurs généraux de la transcription qui doivent s assembler au niveau du promoteur avec elle avant que ne commence la transcription. - L initiation de la transcription chez les eucaryotes doit faire face à l empaquetage de l ADN dans les nucléosomes. Le promoteur central est la région à laquelle se fixe l ARN polymérase II. Le promoteur central fait généralement référence à la région partant du site de début de la transcription, qui comprend la TATA box (boîte TATA), située environ 30 pb en amont du site d'initiation de la transcription. Ce promoteur central est incapable, seul, d'assurer une transcription

11 efficace. Certains éléments importants, les éléments proches du promoteur (ou éléments proximaux), sont distants de 100 à 200 ph du site d'initiation de la transcription. La CAT box (boîte CCAAT) fonctionne comme l'une de ces séquences agissant en cis, de même qu'un segment riche en GC. La région promotrice des Eucaryotes supérieurs 2 / L élongation L ARN est toujours synthétisé dans le sens 5-3. La chaîne s allonge par la formation d une liaison entre l extrémité 3 OH du brin en croissance et un nucléoside triphosphate, ce qui libère un pyrophosphate. L énergie est fournie par le clivage du triphosphate à haute énergie en monophosphate et diphosphate inorganique. NTP + (NMP)n --> (NMP)n+1 + PPi

12 3 / La terminaison (Chez les Procaryotes : deux mécanismes : - terminaison directe : séquence de terminaison sur l ADN comportant environ 40 pb se terminant par un segment riche en GC suivie de 6 A ou plus. Sur la séquence complémentaire d ARN, ce segment s organise en une boucle en épingle à cheveux, suivie d une succession de résidus U qui correspondent aux résidus A présents sur la matrice d ADN. La boucle en épingle à cheveux et la succession de résidus U semblent servir de signal pour la libération de l ARN polymérase et la terminaison de la transcription. - Intervention d un facteur protéique supplémentaire, rho, nécessaire à l ARN polymérase pour reconnaître les signaux de terminaison. Il n y a pas, dans ce cas, intervention de boucle en épingles à cheveux.) Chez les Eucaryotes, les phénomènes sont différents : il existe sur l ADN des signaux de coupure et de polyadénylation. Ces signaux sont transcrits sur l ARN lorsque l ARN polymérase II les traverse puis sont reconnus sous forme d ARN par une série de protéines de liaison à l ARN et d enzymes de maturation de l ARN (CstF : cleavage stimulation factor ; CPSF : cleavage and polyadenylation specificity factor). Lorsque ces deux facteurs sont fixés sur des séquences spécifiques de nucléotides de la molécule d ARN émergente, d autres protéines s assemblent à elles pour effectuer la maturation qui crée l extrémité 3 de l ARNm : l ARN m est coupé (intervention de facteurs complémentaires de coupure) puis une enzyme, la poly-a polymérase, ajoute un à un 200 nucléotides sur l extrémité 3 produite par clivage. Cette enzyme ne nécessite pas de matrice. L ARN polymérase II poursuit sa transcription au-delà du point de coupure puis de dissocie par un mécanisme mal compris. La partie d ARN en aval du site de clivage est dégradée dans le noyau de la cellule.

13 C / Contrôle et régulation de la transcription La transcription est un phénomène contrôlé. Les protéines régulatrices agissant en trans fonctionnent grâce à la spécificité des séquences d ADN reconnues, en se fixant à leurs séquences cibles régulatrices, qui, elles, agissent en cis. Action en cis : action de séquences adjacentes. Action en trans : action d un produit diffusible. 1 / Les séquences agissant en cis dans le contrôle et la régulation de la transcription L action de l'arn polymérase II fait intervenir une coopération entre de multiples éléments régulateurs agissant en cis. Trois classes d'éléments peuvent être distingués d'après leurs positions relatives : - Près du site d'initiation de la transcription se trouvent le promoteur central (la région à laquelle se fixe l ARN polymérase II) ainsi que des séquences agissant en cis proches du promoteur, auxquelles se fixent des protéines qui aident à leur tour à la fixation de l'arn polymérase II à son promoteur.

14 - D'autres éléments de séquence agissant en cis peuvent exercer leur fonction à des distances considérables : on appelle ces éléments des enhancers et des silenceurs (éléments répresseurs, silencers en anglais). Souvent, un enhancer ou un silenceur agit seulement dans un ou un petit nombre de types cellulaires chez un Eucaryote pluricellulaire. Les enhancers sont des séquences agissant en cis, qui peuvent fortement augmenter le taux de transcription à partir de promoteurs situés sur la même molécule d'adn. Ils peuvent donc activer (ou réguler de façon positive) la transcription. Les silenceurs exercent un effet inverse. Ce sont des séquences agissant en cis, auxquelles se fixent des répresseurs, inhibant ainsi les activateurs et réduisant le taux de transcription. Les enhancers et les silenceurs, comme les régions proches du promoteur, sont organisés en une succession de séquences agissant en cis, auxquelles se fixent des protéines régulatrices agissant en trans. Toutefois, ils se différencient des éléments proches du promoteur, par le fait qu'ils sont capables d'agir à distance, parfois à 50 kb ou plus, et d'exercer leur fonction en amont ou en aval du promoteur qu'ils contrôlent. Les enhancers et les silenceurs ont une structure très complexe. Les enhancers, eux-mêmes composés de multiples copies d'un élément d'adn auxquelles se fixent les protéines, sont courants. Des séquences d'adn différentes servent de sites cibles de reconnaissance pour des protéines régulatrices spécifiques, agissant en trans. Les mécanismes de l'action à distance : Comment des enhancers et des silenceurs situés à des milliers de paires de bases du site de transcription régulent-ils ce processus? La plupart des modèles de ce type d'action à distance comportent la formation d'une sorte de boucle dans l'adn (voir figure). Dans ce modèle, une boucle d'adn amène des protéines activatrices fixées sur des enhancers distants, à proximité de complexes protéiques associés aux séquences proximales du promoteur. Les promoteurs, les éléments proches des promoteurs et les éléments dont la fonction est indépendante de la distance, représentent donc tous des cibles de fixation pour différentes protéines qui agissent en trans en se fixant à l'adn 2 / Contrôle et régulation en trans de la transcription Un grand nombre de protéines régulatrices agissant en trans ont désormais été identifiées dans les cellules eucaryotes. Comme leurs équivalents chez les procaryotes, ces protéines régulatrices agissent en se fixant à des séquences cibles spécifiques d'adn.

15 Les protéines régulatrices qui se fixent au promoteur central et aux éléments proches du promoteur aident l'arn polymérase II à démarrer la transcription et forment avec celle-ci un complexe d'initiation (voir figure). Plusieurs complexes de facteurs de transcription différents (complexes TFII) interagissent avec l ARN polymérase II. Par exemple, le complexe TFIID est constitué d'une protéine se fixant à la TATA box (TBP pour TATA box-binding protein en anglais) et de plus de huit autres sous-unités. On appelle souvent les complexes TFII, des facteurs généraux de la transcription, car ils constituent le minimum nécessaire pour que l ARN polymérase II puisse débuter la transcription (généralement à un taux très faible) au niveau d'un promoteur. Les CAT et GC box sont reconnues par d'autres protéines de liaison à l'adn. Certaines des protéines qui se fixent à des éléments dont la fonction est indépendante de la distance ont également été identifiées. La protéine codée par le gène GCN4 de levure est un exemple de protéine agissant en trans qui se fixe à des enhancers. Elle se fixe à des enhancers appelés séquences activatrices en amont (UAS pour upstream activating sequences en anglais). GCN4 active la transcription de nombreux gènes de levure qui codent les enzymes des voies de biosynthèse des acides aminés. En réponse à une carence en acides aminés, la concentration de la protéine GCN4 augmente, et entraîne à son tour une augmentation du taux d'expression des gènes de biosynthèse des acides aminés. Les UAS reconnues par GCN4 contiennent l'élément de séquence de reconnaissance principal, ATGACTCAT. Structure des protéines régulatrices : Les protéines régulatrices de gènes reconnaissent de courts segments de la double hélice d ADN d'une séquence définie et déterminent ainsi quel gène, parmi les milliers de la cellule, sera transcrit. Des milliers de protéines régulatrices ont été identifiées dans un large éventail d'organismes. Même si chacune de ces protéines a une caractéristique propre, la plupart se lient à l ADN sous forme d'homodimères ou d'hétérodimères et reconnaissent l ADN par une des quelques conformations structurales. Les conformations les plus communes comprennent l'hélice-coude-hélice, les homéodomaines, les fermetures Éclair à leucine, les hélice-boucle-hélice et les doigts à zinc de divers types. La séquence précise en acides aminés qui est repliée en une de ces conformations détermine la séquence particulière d ADN reconnue. L'hétérodimérisation augmente la variété des séquences d ADN qui peuvent être reconnues par les protéines régulatrices. Il existe des techniques puissantes qui utilisent la spécificité des protéines régulatrices pour les séquences d ADN pour identifier et isoler ces protéines, les gènes qui codent pour elles, les séquences d ADN qu'elles reconnaissent et les gènes qu'elles régulent. D / Transcription et structure du matériel génétique 1 / Remodelage de la chromatine On pourra s intéresser plus précisément aux états de la chromatine et notamment aux effets de la méthylation des histones (sur les lysines et les arginines). La méthylation des histones joue un rôle dans la mise en place de l hétérochromatine. On rappellera que des modifications de la structure chromatinienne et des nucléosomes peuvent être nécessaires avant l initiation de la transcription : ces modifications portent le nom de remodelage de la chromatine, processus actif réalisé par des complexes de remodelage, comprenant de 2 à 12 protéines, dont une hélicase. De manière simplifiée, les complexes de remodelage peuvent agir selon deux modes : - dans le premier cas, le remodelage consiste en un déplacement des nucléosomes, ce qui libère l ADN sur une courte portion et permet la fixation des facteurs de transcription. - dans le second cas, les complexes de remodelage modifient la torsion de l ADN sur le nucléosome. La distorsion entraîne une modification de la structure de la double hélice, qui rend les bases de l ADN plus accessibles aux facteurs de transcription. 2 / Modifications de la structure primaire de l ADN

16 Certaines séquences CG de l ADN peuvent être méthylées, la méthylation ne portant que sur les cytosines. Un ensemble de résultats expérimentaux ont montré que la méthylation des cytosines situées dans la région en 5 non transcrite des gènes était associée à une diminution de leur activité transcriptionnelle. L ADN des cellules cancéreuses, dont la transcription est très active, est à l inverse largement hypométhylé. Le chromosome X inactivé est globalement hyperméthylé, ce qui peut être mis en relation avec l inactivation de la plupart de ses gènes. L effet inhibiteur de la méthylation sur la transcription résulte d au moins deux types de mécanismes possibles : - la méthylation modifie la forme et les caractères physicochimiques de la molécule d ADN, ce qui modifie la reconnaissance des séquences par les facteurs de transcription. - L autre mécanisme est lié à l intervention de protéines MBD (Methyl Binding Domain), protéines qui contiennent un domaine de fixation à l ADN méthylé. Leur fixation interdit l accès des facteurs de transcription à l ADN. Elles sont par ailleurs associées à d autres molécules comme les histone-désacétylases qui ont un effet inhibiteur sur la transcription. Bilan sur le contrôle et la régulation de la transcription : La transcription de chaque gène est activée et inactivée dans les cellules par des protéines régulatrices. Certaines de ces protéines se fixent sur des séquences d ADN spécifiques près du point de départ de l ARN polymérase. La souplesse de l'hélice d ADN, cependant, permet également à des protéines fixées sur des sites distants de modifier l activité de l ARN polymérase au niveau du promoteur. Cette action à distance, sur des séquences situées à des milliers de paires de nucléotides du promoteur, est extrêmement fréquente dans les cellules eucaryotes. Les activateurs et les répresseurs eucaryotes agissent selon un large éventail de mécanismes - qui provoquent généralement la modification locale de la structure de la chromatine, l'assemblage des facteurs généraux de transcription au niveau du promoteur et le recrutement de l ARN polymérase. La régulation de l expression des gènes eucaryotes supérieurs est ainsi beaucoup plus complexe que celle des gènes procaryotes, en relation avec la grande taille du génome et la grande variété des types cellulaires formés. La région de contrôle du gène eve de drosophile, par exemple, s'étend sur paires de nucléotides d ADN et présente des sites de liaison pour plus de 20 protéines régulatrices. Certaines de ces protéines sont des répresseurs de la transcription, d'autres des activateurs de la transcription. Ces protéines se fixent sur des séquences régulatrices organisées en une série de modules régulateurs répartis le long de l ADN et provoquent ensemble le bon patron temporel et spatial d'expression génique. Les gènes eucaryotes et leurs régions contrôles sont souvent entourés d'éléments isolateurs, séquences d ADN reconnues par des protéines qui empêchent la diaphonie entre les gènes régulés indépendamment. L assemblage moléculaire contrôlant la transcription apparaît ainsi constitué de quatre types de molécules. Les facteurs généraux de transcription sont essentiels à la transcription mais ne peuvent par euxmêmes augmenter ou abaisser le taux de transcription. Cet effet revient aux protéines régulatrices appelées activateurs ou répresseurs. Les activateurs et sans doute les répresseurs, communiquent avec les facteurs généraux par le biais de co-activateurs, des protéines complexées avec la protéine qui se fixe à la TATA box, le premier des facteurs élémentaires de transcription à se fixer au promoteur central.

17 IV / La maturation des ARN pré-messagers La maturation des ARN correspond aux phénomènes suivants : - coiffage de l extrémité 5 par un résidu 7-méthylguanosine. - polyadénylation de l extrémité 5 (longueur de 150 à 200 résidus). - excision des introns et épissage des exons. La présence des extrémités particulières des ARNm est nécessaire à leur exportation hors du noyau. Certaines de ces modifications de l ARN qui affectent le transcrit initial d ARN (par exemple, celles impliquées dans l'épissage de l ARN) sont surtout effectuées par de petites molécules particulières d ARN (voir plus loin). A / Coiffage et polyadénylation de lʼarn 1 / Le coiffage de l extrémité 5 Le coiffage est la première modification du pré-arnm. Dès que l ARN polymérase a produit 25 nucléotides environ, la terminaison 5 de la nouvelle molécule est modifiée par addition de la coiffe. Cette modification fait intervenir trois enzymes (phosphatase, guanyl-transférase, méthyl-transférase). La coiffe permet de distinguer l ARN des autres types d ARN de la cellule (les ARN polymérases I et III produisent des ARN sans coiffe). Dans le noyau, la coiffe s unit à un complexe protéique appelé CBC (cap-binding complex) qui facilite la maturation correcte de l ARN puis son exportation. Cette coiffe joue aussi un rôle important dans la traduction cytosolique de l ARNm.

18 2 / La polyadénylation La polyadénylation s effectue lors de la terminaison de la transcription (voir plus haut).

19 CPSF : cleavage and polyadenylation specificity factor Cstf : cleavage stimulating factor B / Épissage des ARN prémessagers (pré-arnm) Les séquences d introns et d exons sont transcrites en ARN. Les séquences d introns sont retirées de l ARN néosynthétisé lors du processus d épissage. 1 / Les mécanismes moléculaires L épissage est assuré par un complexe moléculaire, le splicéosome. Celui-ci associe au moins 5 types d ARN de petite taille (moins de 200 nucléotides). Appelés ARNsn, chacun forme un complexe avec au moins 7 sous-unités protéiques pour former une RNPsn (small nuclear ribonucleoprotein). Ces RNPsn forment le coeur du splicéosome, gros assemblage de plus de 50 protéines qui effectue l épissage. Chaque épissage s effectue par deux réactions séquentielles de transfert d un phosphoryle qui réunissent deux exons tout en enlevant un intron, formant un lasso. L épissage est consommateur d ATP : le splicéosome utilise l hydrolyse de l ATP pour effectuer une série complexe de réarrangements ARN- ARN. L élimination de la séquence d intron fait intervenir trois positions sur l ARN : le site d épissage 5, le site d épissage 3 et le point d embranchement de la séquence d intron qui forme la base du lasso

20 excisé. Ces trois sites ont chacun une séquence consensus en nucléotides, similaire d un intron à l autre. Chaque séquence présente cependant suffisamment de variations pour qu il soit très difficile de repérer les signaux d épissage d un génome.

21 2 / L épissage alternatif Lorsqu il existe différentes possibilités d épissage dans diverses positions du transcrit, un seul gène peut produire de nombreuses protéines différentes. Épissage alternatif de constitution :

22 Dans certains cas, l épissage alternatif se produit lorsqu il existe une ambiguïté dans la séquence d introns : le mécanisme standard du splicéosome ne distingue pas nettement entre plusieurs appariements alternatifs des sites d épissage : les asociations se font au hasard. Dans ce cas, les différentes versions de la protéine codée par le gène sont fabriquées dans toutes les cellules où le gène s exprime. Épissage alternatif régulé : Dans les cas les plus simples, l épissage régulé sert à passer de la production d une protéine non fonctionnelle à la production d une protéine fonctionnelle. Cet épissage permet aussi de produire différentes versions d une protéine dans différents types cellulaires, selon les besoins de la cellule. La tropomyosine est par exemple produite sous des formes spécialisées dans différents types cellulaires. La régulation de l épissage de l ARN peut être soit négative par l intermédiaire d une molécule régulatrice qui empêche la machinerie d épissage d accéder à un site d épissage particulier, soit positive par l intermédiaire d une protéine régulatrice qui dirige la machinerie d épissage sur un site d épissage négligé jusqu à alors. L épissage d une molécule de pré-arnm peut ainsi apparaître comme un équilibre entre des sites d épissage compétitifs, équilibre qui peut être modifié par des protéines régulatrices. Exemple du gène morcelé de l ovalbumine : les différentes étapes de la maturation de l ARNm. 3 / La signification de l épissage Possibilité d épissage alternatif. L épissage est un phénomène précis : si des erreurs d épissage de l ARN étaient fréquentes, elles endommageraient sérieusement la cellule en entraînant des dysfonctionnements protéiques. En cas d erreur d épissage, la cellule possède d ailleurs un dispositif de sécurité qui élimine les ARN mal épissés. Il peut sembler que l élimination d un grand nombre d introns soit du gaspillage. L arrangement exon intron peut toutefois faciliter l émergence de protéines nouvelles. La présence de nombreux introns permet à la recombinaison génétique d associer plus facilement les exons de différents gènes. Cette hypothèse est confortée par le fait qu un grand nombre de protéines actuelles ressemblent à des patchworks composés à partir d un ensemble commun de domaines protéiques.

23 L épissage a un avantage actuel : les transcrits de beaucoup de gènes (60 % chez l homme) sont épissés de diverses manières, ce qui permet de produire un ensemble correspondant de protéines à partir d un même gène. Ceci augmente le potentiel de codage du génome. Rmq : L auto-épissage de l ARN : il existe de nombreux exemples de molécules d ARN capables de catalyser l épissage de leurs introns sans l aide de protéines (mis en évidence dans des ARNr chez le cilié Tetrahymena). Ce fut la première démonstration d une propriété catalytique spécifique pour une molécule d ARN : les ARN pourvus d une activité catalytique sont appelés des ribozymes. Erreurs très dommageables Émergences de protéines nouvelles? La présence de nombreux introns permet à la recombinaison d associer plus facilement les exons de différents gènes (beaucoup de protéines ressemblent à des patchworks composés à partir d un ensemble commun de domaines). 4 / Épissage alternatif et définition du gène Évolution de la notion de gène : - Approches de génétique classique : Région du génome qui se sépare en une seule unité lors de la méiose et qui donne naissance à un caractère phénotypique défini : Beadle et Tatum (Neurospora) un gène une enzyme : Yanofsky : la colinéarité - Années 60, un segment d ADN transcrit en ARN et qui code pour une seule chaîne polypeptidique ou transcrit en ARN structural (t ou r...). - Notion de 1 gène-1 ARN remise en cause lors de la découverte de l épissage alternatif Gène : toute séquence d ADN transcrite en un ARN structural ou sous forme d une seule unité ARN codant pour un groupe de chaînes polypeptidiques très apparentées (protéines isoformes) Nouvelles techniques d approches : Sondes, blotting, analyse des transcriptomes par hybridation sur puces à ADN on conduit à la définition actuelle : Un gène est un ensemble de séquences génomiques qui sont potentiellement recouvrantes, qui codent des molécules fonctionnelles (protéines ou ARN) et qui contiennent les signaux nécessaires à son expression. Schéma d un gène eucaryote codant une protéine : Structure d un ARNm d Eucaryote :

24 Les différentes étapes de l expression du génome chez les Eucaryotes : Les cellules eucaryotes peuvent contrôler l'expression génique par différents processus. La plupart des gènes peuvent ainsi être régulés à de multiples niveaux, même si le contrôle de l'initiation de la transcription (contrôle transcriptionnel) est généralement prédominant. Certains gènes sont cependant transcrits à vitesse constante et activés ou inactivés uniquement par des processus régulateurs posttranscriptionnels. Ces processus incluent : (1) l'atténuation des transcrits d ARN par leur terminaison prématurée, (2) la sélection de sites d'épissage alternatif, (3) le contrôle de la formation de l'extrémité 3' par le clivage et l'addition du poly-a, (4) l'édition des ARN (modification de la séquence nucléotidique d un transcrit d ARNm une fois transcrit), (5) le contrôle du transport du noyau au cytosol, (6) la localisation de l ARNm dans des sites cellulaires particuliers, (7) le contrôle de l'initiation de la traduction, (8) la dégradation régulée des ARNm. La plupart de ces processus de contrôle nécessitent la reconnaissance de séquences ou de structures spécifiques situées sur la molécule d ARN à réguler. Cette reconnaissance s'effectue soit par des protéines régulatrices soit par des molécules d ARN régulatrices. V/ La traduction des ARN messagers (le protéome) Le résultat final de l expression du génome est le protéome, ensemble des protéines fonctionnelles de la cellule. A / Le code génétique Le code génétique est le système de correspondance entre les séquences de nucléotides et les séquences d acides aminés. Ce code a été déchiffré au début des années 1960.

25 Chaque groupe de trois nucléotides consécutifs de l ARN messager constitue un codon. Il spécifie soit un acide aminé soit un signal d arrêt de la traduction (trois codon stop, UAA, UAG et UGA). Le code génétique est redondant : certains acides aminés sont spécifiés par plusieurs triplets. Le code génétique est utilisé par tous les organismes actuels : il est ainsi considéré comme universel. Toutefois, des différences ont été observées : - exemple : Candida albicans : CUG : sérine alors qu habituellement leucine. - dans l expression des génomes mitochondriaux (mitochondries de mammifères : AUA signifie méthionine alors qu habituellement ce codon est traduit en isoleucine. B / Le rôle des ARNt et des aminoacyl-arnt synthétases 1 / Structure et propriétés des ARNt Les molécules d ARNt comprennent 80 nucléotides ; elles présentent une structure tridimensionnelle précise, en forme de trèfle. Cette structure est stabilisée par quatre courts segments d ARN appariés. Cette structure en trèfle subit d autres repliements qui conduisent à une structure spatiale en L. Deux régions non appariées des ARNt ont une grande importance fonctionnelle : - L anticodon est un groupe de trois nucléotides consécutifs qui s apparient au codon complémentaire de la molécule d ARNm. - Une courte séquence au niveau de l extrémité 3 est le lieu de fixation de l acide aminé. Structure secondaire d un ARNt La redondance du code génétique peut résulter du fait : - qu il existe plusieurs ARNt pour chaque acide aminé. - que certaines molécules d ARNt peuvent former des appariements de bases avec plusieurs codons. Certains ARNt ne forment ainsi qu un appariement précis pour les deux premières positions du codon. La troisième position du codon, dite position flottante, peut s apparier avec différentes bases de l anticodon. Cet appariement de bases flottant permet d adapter les 20 acides aminés sur les 61 codons avec seulement 31 types de molécules d ARNt. 2 / Le rôle des aminoacyl-arnt synthétases La reconnaissance et la fixation d un acide aminé sur l ARNt correspondant sont le fait des aminoacyl- ARNt synthétases. Dans la plupart des cellules, il y a une synthétase différente pour chaque acide aminé. Formation des complexes aminoacyl-arnt synthétases.

26 Les synthétases présentent une double spécificité essentielle, sur laquelle repose la correspondance acide aminé déterminé anticodon. Ce rôle majeur a été démontré expérimentalement : si on modifie expérimentalement l acide aminé après sa fixation sur l ARNt correspondant, cet acide aminé modifié est partout inséré en place de l acide aminé initial. La traduction met donc en jeu deux types d adaptateurs agissant de manière séquentielle, et de même importance. La fixation de l acide aminé sur l ARNt requiert l hydrolyse d ATP (formation préalable d un acide aminé activé). L énergie de liaison entre l acide aminé et l ARNt sera ensuite utilisée lors de la synthèse protéique pour enchaîner de manière covalente l acide aminé sur la chaîne polypeptidique en croissance. 3 / Le rôle des ribosomes La synthèse des protéines est réalisée au niveau des ribosomes, machineries catalytiques associant plusieurs molécules d ARNr à plus de 50 protéines. Un ribosome est constitué de deux sous-unités : - la petite sous-unité assure la bonne correspondance entre le codon de l ARNm et l ARNt correspondant. - la grande sous-unité catalyse la formation de la liaison peptidique. Les ARNr apparaissent déterminer la structure globale du ribosome, sa capacité à positionner l ARNt sur l ARNm et sa capacité catalytique pour la formation des liaisons peptidiques. (ce qui conduit à considérer certains ARNr comme des ribozymes). Le rôle principal des protéines semble être de stabiliser le coeur d ARNr, tout en permettant les variations de conformation des ARNr nécessaires à leur action de catalyse. Petite sous-unité des ribosomes eucaryotes : ARNr 18 S (1900 nucléotides) et 33 protéines Grande sous-unité des ribosomes eucaryotes : ARNr 5S (120 nucléotides), 28S (4700 nucléotides), 5,8S (160 nucléotides) et 49 protéines. Un ribosome contient 4 sites de liaisons aux molécules d ARN : - un site pour les molécules d ARNm trois sites pour les molécules d ARNt : sites A (aminoacyl-arnt), P (peptidyl-arnt) et E (exit). Au cours du processus de synthèse, il semble qu il n y ait pas plus de deux sites occupés par une molécule d ARNt à un instant donné C / Les étapes de la traduction Le site où débute la synthèse est de grande importance, toute erreur à ce niveau pouvant conduire à un décalage du cadre de lecture.

27 La traduction d un ARNm commence par le codon AUG, avec un ARNt spécifique qui initie la traduction. Cet ARNt initiateur transporte toujours l acide aminé méthionine. Toutes les protéines néosynthétisées possèdent la méthionine comme premier acide aminé au niveau de leur extrémité N- terminale. La méthionine est généralement retirée ultérieurement par une protéase spécifique. L ARNt initiateur possède une séquence nucléotidique différente de celles des autres ARNt qui transportent normalement la méthionine. - L ARNt initiateur est placé dans la petite sous-unité ribosomique avec d autres protéines appelées facteurs d initiation des eucaryotes ou eif. Parmi tous les aminoacyl-arnt de la cellule, seul l ARNt initiateur chargé de méthionine peut se fixer sur la petite sous-unité du ribosome alors que celui-ci n est pas complet. - La petite sous-unité ribosomique se fixe à l extrémité 5 d une molécule d ARNm qui est reconnue grâce à sa coiffe 5 et à deux facteurs d initiation qui s y sont fixés. - La petite sous-unité ribosomique se déplace alors dans le sens 5-3 jusqu au premier codon AUG. Ce mouvement est facilité par d autres facteurs d initiation qui agissent comme des hélicases actionnées par l ATP. - La traduction débute à ce premier codon AUG : les facteurs d initiation se dissocient de la petite sous-unité pour laisser la place à la grande sous-unité. L ARNt initiateur est alors lié au site P et laisse le site A vacant.

28 1 / L initiation

29 2 / L élongation La chaîne protéique est synthétisée par étapes, de son extrémité N-terminale à son extrémité C-terminale. L élongation fait intervenir un ensemble de processus cycliques : - fixation d une nouvelle molécule d aminoacyl-arnt sur le site A. - libération de l extrémité carboxyle de la chaîne polypeptidique jusqu alors liée à l ARNt fixé au site P. - Liaison de cette extrémité carboxyle avec le groupement amine libre de l acide aminé lié à l ARNt situé au site P. Cette étape correspond à la formation d une liaison peptidique : elle est catalysée par l activité catalytique de la peptidyl-transférase contenue dans la grande sous-unité ribosomique. - Cette étape s accompagne de plusieurs modifications de conformation du ribosome qui déplacent les deux ARNt dans les sites E et P de la grande sous-unité.

30 Détail de la formation de la liaison peptidique Rmq : la synthèse protéique est un exemple de polymérisation par l avant : chaque monomère porte une liaison riche en énergie (monomère activé) qui sera utilisée pour ajouter le monomère suivant (autre exemple : acides gras). Les acides nucléiques, les polysaccharides sont le siège d une polymérisation par l arrière, chaque monomère portant une liaison riche en énergie (monomère activé) utilisée à sa propre incorporation. La traduction est un compromis entre deux contraintes opposées : l exactitude et la vitesse. Eucaryotes : vitesse d élongation de l ordre de 2 acides aminés ajoutés par seconde (Procaryotes, 20 acides aminés par seconde) avec 1 erreur/ acides aminés reliés. L élongation fait intervenir deux facteurs d élongation, chacun hydrolysant un GTP en GDP. L aminoacyl-arnt entrant dans le site est dans un premier temps lié avec un facteur d élongation (EF-Tu) porteur d un GTP. Cet aminoacyl-arnt s apparie transitoirement au niveau du site A : fixation sur un site de liaison initial appelé état hybride A/T. L appariement codon-anticodon déclenche l hydrolyse du GTP par l EF-Tu, ce qui provoque la dissociation de ce dernier du complexe aminoacyl-arnt : celui-ci entre pleinement dans le site A (site A/A). Ce facteur d élongation introduit donc deux courts délais entre l appariement des bases codonanticodon et l élongation de la chaîne polypeptidique : ces retards permettent sélectivement aux ARNt incorrects liés de ressortir du ribosome avant que l étape irréversible d élongation de la chaîne ne se produise. Le premier délai est le temps nécessaire à l hydrolyse du GTP. La vitesse d hydrolyse est plus rapide si la paire codon-anticodon est correcte ce qui donne l opportunité plus longue de dissociation pour une paire incorrecte. Le deuxième retard se produit entre la dissociation du facteur d élongation et la mise en place complète de l ARNt dans le site A.