Spectrométrie de masse Introduction Intérêts de la Spectrométrie de masse :

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1 Spectrométrie de masse Introduction Intérêts de la Spectrométrie de masse : Sensibilité, limite de détection faible ( fento mole dans certaines conditions ) Variétés des applications : analyses chimiques quantitative et qualitative réaction ions molécule, cinétique des réactions. Progrès technologique rapide 1

2 Spectrométrie de masse Introduction -Principes - Un spectromètre comprend : - Système d introduction ( GC, LC, sas d intro direct, ) - Source d ionisation - Analyseur ( un ou plusieurs ) - Détecteur pour compter les ions - Système de traitement de donnée Introduction, GC, LC Ionisation, EI, CI ESI, APCI FAB, Analyseur SQ D,TQD, EB, TOF Détecteur Logiciel 2

3 Spectrométrie de masse Introduction -Principes Principes de la MS : 1er étape : Produire des ions La quantité de fragments produit dépend de la «force» de l ionisation Les ions sont ensuite séparés d après leur masse et leur charge dans le système dispersif Ils sont ensuite détectés. Introduction, GC, LC Ionisation, EI, CI ESI, APCI FAB, Analyseur SQ D,TQD, EB, TOF Détecteur Logiciel 3

4 Spectrométrie de masse Analyse de Biomolécules - Electrospray (ESI) 4

5 Ion moléculaire ou pseudo-moléculaire Electrospray Ion pseudo-moléculaire : En mode positif : ajout d un proton sur M : (M+H) + (masse : M+1, charge+1) En mode négatif : perte d un proton : (M-H) - (masse : M-1, charge -1)

6 1. Massifs isotopiques Isotopes : atomes d un même élément qui contiennent un nombre identique de protons mais un nombre différent de neutrons Abondance isotopique = pourcentage des isotopes d un élément dans la nature Masse moyenne pondérée (MM) = Masse atomique apparaissant sur le tableau périodique et qui tient compte des isotopes et de leur abondance Exemple : nbre de nbre de protons : nucléons : nbre nbre de nbre masse abondance abondance atomique masse neutrons isotopique en % (1) relative (2) Chlore = 18 34,97 75,8% 100 Chlore = 20 36,97 24,2% 32,5 Masse moyenne pondérée du chlore = (0,758 * 34,97 uma) + (0,242 * 36,97 uma) = 35,454 uma (1) = nombre moyen d isotope cité pour 100 atomes de l élément (2) = nombre moyen d isotope cité pour 100 isotopes majoritaires 6

7 Principaux isotopes en chimie organique Elément isotope % Masse isotopique isotope % Masse isotopique isotope % Masse isotopique Masse moyenne C 12 C C H 1 H H N 14 N N O 16 O O O S 32 S S S F 19 F Cl 35 Cl Cl Br 79 Br Br

8 Calcul de masses exactes Soit la molécule d eicosane C 20 H 42 : nbre masse masse A isotopique moyenne Hydrogène Hydrogène Carbone Carbone Masse exacte M : ( 12 C 1 20 H 42 ) (20 * ) + (42 * ) = 282,33 Masse exacte M+1 avec un 13 C : (19 * ) + (1 * ) + (42 * ) = 283,33 Masse exacte M+1 avec un 2 H : (20 * ) + (41 * ) + (1 * ) = 283,33 Masse moyenne : (20 * ) + (42 * ) = 282,55 La différence entre masse exacte M et masse moyenne MM augmente avec la taille de la molécule : entre MM et M = ± 1 Da / 1500 Da

9 Calcul de l abondance relative des satellites isotopiques M+1, M+2 pour des petites molécules Type d élément Caractéristiques Exemple Abondance relative du 2 ème isotope* 1! Isotope ou F - Q plusieurs isotopes I - dont un est majoritaire P - (A > 99,9%) H 0,015 Q+1 Isotope M+1 C 1,08 non négligeable N 0,37 * Abondance de l isotope majoritaire = 100 O 0,2 Q+2 Isotope M+2 S 4,43 non négligeable Cl 31,98 Br 97,28 Satellite M+1 : M+1 (1,08. Nombre de C) + ( 0,37. Nombre de N ) M 100 Satellite M+2 : M+2 (31,98. Nombre de Cl) + ( 4,43. Nombre de S ) + M 100 analyse de spectres de masse 9

10 Massifs isotopiques complexes Exemple : Allure du massif isotopique de molécules contenant 2 Cl, 3 Cl, 4 Cl

11 En Conclusion : Chaque formule brute est associée à un massif isotopique qui lui est propre Pour des molécules de masse < 500 Da : L abondance des pics «M+1» renseigne sur le nombre d éléments Q+1 : M+1/M (1,08. Nombre de C) + ( 0,37. Nombre de N ) /100 L abondance des pics «M+2» et suivants renseigne sur la présence d éléments Q+2 (S, Si, Se, Cl, Br) ainsi que le nombre de ces atomes : analyse de spectres de masse 11

12 ! Le nombre de formules brutes dont la masse est comprise entre deux valeurs données augmente avec la masse de l entité Formules brutes* contenant 12 C, 1 H, H, N et O entre et : Formules brutes* contenant Oentre 12 C, 1 H, 14 N et et : CO : N 2 : CH 2 N : * C 2 H 4 : La capacité d un spectromètre à distinguer une masse x d une masse y dépend de la résolution

13 Résolution = m / m m = différence de masse correspondant à deux pics adjacents tout juste séparés m = masse du premier pic (ou moyenne des masses des deux pics) Dès lors, un spectromètre dont la résolution est de 2000 peut séparer des pics situés à des valeurs m/z de 2000 et 2001 (ou de 200 et 200,1 ou de 20,00 et 20,01) Si la résolution est suffisante, on peut alors associer une masse donnée à une seule formule brute Deux pics sont séparés si la profondeur de la vallée qui les sépare ne dépasse pas une fraction donnée de la hauteur du pic le moins intense (généralement 10% pour la haute résolution et 50% pour la basse résolution) Autre définition (pour un pic isolé) = résolution FWHM : m = largeur à mi-hauteur. Définition plus flatteuse : résolution FWHM / résolution à 10% = 2,2 Remarque : Un autre paramètre important de l analyseur est l exactitude en masse càd la précision, ou plus exactement la justesse des rapports m/z mesurés. Elle dépend de la stabilité et du pouvoir de résolution de l analyseur. analyse de spectres de masse 13

14 Résolution = m / m Remarque : Un autre paramètre important de l analyseur est l exactitude en masse càd la précision, ou plus exactement la justesse des rapports m/z mesurés. Elle dépend de la stabilité et du pouvoir de résolution de l analyseur. analyse de spectres de masse 14

15 Basse Résolution et Haute Résolution Entités identiques dont l une contient un 13 C Formule Brute : Masse exacte M m R = m/ m 12 C 1 H 4 16, C 1, H 4 17, C 2571 H N O 32 * 77 S ,6377 1, C 12 C 2561 H N O 32 * 77 S ,6401 Spectromètre HR ou BR? BR HR 14 N 2 28, C 1 2 H 4 28,0312 0, BR Entités mais de masses très proches 12 C 14 9 N 16 4 O 180, C 1 11 H 14 2 N 16 O 2 180,0085 0, HR 12 C 2571 H N O 32 * 77 S , C 2591 H N O S ,6390 0, Impossible à séparer Les spectromètres commerciaux actuels peuvent avoir une résolution allant jusque HR = haute résolution : R de l ordre de BR = Basse résolution : R de l ordre de 10 3 * Insuline analyse de spectres de masse 15

16 En Conclusion : La résolution détermine la capacité d un spectromètre de masse à différencier deux masses : R = m / m Pour des molécules de masse < 1000 Da : Les spectromètres à haute résolution permettent d associer une masse donnée à une formule brute Pour des molécules de masse > 1000 Da Ce n est plus le cas. A haute résolution et selon la taille de la molécule, on peut parfois distinguer les satellites isotopiques ( m = 1) NB : N oubliez pas que l analyse des massifs isotopiques est une aide précieuse dans l attribution d une formule brute

17 Spectrométrie de masse Quantification La sensibilité = recherche de la limite de détection(lod) et Quantification (LOQ). En analyse Qualitative, la LOD est la quantité minimal d échantillon nécessaire à l obtention d un spectre de masse de qualité. En analyse Quantitative la LOD est la quantité minimal détectable d une molécule par rapport au bruit de fond. LOD = 3 S/N LOQ = 10 S/N Plusieurs paramètres conditionnent la LOQ : - Paramètre de source du spectromètre de masse - La technique d ionisation - les solvants et tampon en ESI 17

18 Spectrométrie de masse Analyse de Biomolécules 18 MRM, des limitations 1. La molécule doit s ioniser, surtout en ESI 2. La molécule doit fragmenter, mais pas trop 3. Linéarité de 4 ordres de grandeurs ( TOF) jusqu à 6 (TQD ) 4. Précision des mesures : 10% 5. LOD, LOQ variable en fonction des molécules, des appareils ( 20 pg pour la carnitine sur TQD Waters de 2000), inférieur sur une Maxis Q-TOF de Répétabilité des aires : mauvais d un jour à l autre 1. lié à l encrassement 2. Effet matrice en ESI ( pas en EI ). On préfère toujours la solution de l étalon interne à la courbe de calibration externe Idéalement, l étalon interne est la molécule marqué iso topiquement ( Testostérone D3, Carnitine D3.

19 Spectrométrie de masse Quantification La spectrométrie de masse apporte : - Spécificité - La sensibilité La spécificité est obtenu par : - La préparation de l échantillon pour séparer la molécule cyble des interférences. - Le spectromètre de masse en lui même La sensibilité est obtenu par : - La technologie employée - Les modes du spectromètre de masse 19

20 Spectrométrie de masse La spécificité est obtenu par : - La purification de l échantillon Quantification - Extraction ( liquide liquide ) - SPE / MIP - La dérivatisation : augmentation du poids de la molécule d intêret et ciblage d ion caractéristique de masse supérieur. - Le spectromètre de masse. - Augmenter la résolution - R= 2000 TQD - R= Q-TOF - - mode SRM ( Single Reaction Monitoring ). 20

21 Quantitatif 1. Etablir une courbe de calibration avec toujours la même quantité d étalon interne. 2. Concentré l échantillon avec la même quantité d étalon interne que pour la calibration 3. Comparer le rapport A Atrazine / A IS pour obtenir la quantité d étalon interne.

22 Quantitatif Cpd # Formula RT Mass [M+H]+ DEDIA C3H4N5Cl DIA C5H8N5Cl DEA C6H10N5Cl ATRAZINE C8H14N5Cl ATRAZINE-D5 C8H9D5N5Cl

23 Qualitatif 1. Définir les paramètres optimaux de sources. 2. Réaliser la Courbe de calibration 1. Toujours la même quantité d étalon interne dans les 200µl 2. Faire varier la quantité d atrazine de 20ng ( limite haute de la réglementation) ng ng 5. 5 ng 6. 1 ng ng pg pg 3. Comparer le rapport de l aire de l atrazine / Aire de l atrazine D5 après extraction en HR-MS

24 Spectre Produit de l Atrazine à Ce =5, 19,33,47 ev

25 Spectre Produit de l Atrazine-D5 à Ce =5, 19,33,47 ev

26 Transition M.R.M pour l ATRAZINE et son étalon interne MRM Compound Name ISTD? Precursor Ion MS1 Res Product Ion MS2 Res Dwell Fragmentor Collision Energy Cell Accelerator Voltage Polarity ATRAZINE-D5 True Unit Unit Positive ATRAZINE-D5 True Unit 69.1 Unit Positive ATRAZINE False Unit Unit Positive ATRAZINE False Unit 104 Unit Positive

27 HPLC : colonne type C x 100 mm, 2.6µm Debit 300µl/min Temps B% Débit Solvant A H2O 5mM Acétatate d'ammonium µl/min Solvant B Méthanol µl/min µl/min µl/min µl/min µl/min QQQ. Vcap 3500 V GAS Temp 350 C Drying gaz 12 L/min Nebuliseur 45 psi Fragmenteur 120 V ESI Positif