Information Génétique et hérédité 1- Réplication, mitose, méiose

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1 Information Génétique et hérédité 1- Réplication, mitose, méiose REPLICATION DE L ADN et CYCLE CELLULAIRE quantité d'adn 4C 2C G 1 S G 2 M G duplication de l'adn mitose temps heures

2 CYCLE CELLULAIRE et REPRODUCTION SEXUEE REPLICATION DE L ADN : Introduction L'article original de Watson et Crick décrivant la double hélice, finissait sur cette phrase : "Il ne nous a pas échappé que les appariements spécifiques que nous avons supposés, suggèrent l'existence d'un mécanisme de copie conforme pour la perpétuation du matériel génétique." Dans un des articles qui ont suivi, ils revenaient sur cette remarque un peu sibylline en faisant remarquer qu'un brin d'adn pourrait servir de matrice pour conduire la synthèse de son brin complémentaire. L ADN bactérien se réplique à une vitesse de 500 à 1000 nucléotides par seconde. L'hélice d'adn parentale en avant de la fourche doit donc tourner de 50 à 100 révolutions par seconde.

3 PROTÉINES DE LA RÉPLICATION Processus complexe qui implique une grande variété de protéines : (1) ADN gyrase, (2) Hélicases qui séparent les brins d ADN à la fourche de réplication, (3) Des protéines qui empêchent les 2 brins d ADN de se réassocier avant d avoir été répliqués, (4) Des enzymes pour synthétiser les amorce ARN, (5) Une ADN polymérase, (6) Une enzyme pour enlever les amorces ARN, (7) Une enzyme pour ligaturer de façon covalente les fragments d Okazaki. PROTÉINES DE LA RÉPLICATION Processus complexe qui implique une grande variété de protéines : (1) ADN gyrase, (2) Hélicases qui séparent les brins d ADN à la fourche de réplication, Brin discontinu (3) Des protéines qui empêchent les 2 brins d ADN de se réassocier Brin continu avant d avoir été répliqués, (4) Des enzymes pour synthétiser les amorce ARN, (5) Une ADN polymérase, (6) Une enzyme pour enlever les amorces ARN, (7) Une enzyme pour ligaturer de façon covalente les fragments d Okazaki.

4 ENZYMES DE LA REPLICATION (1) matrice A T G C d.nucléotide T A C G synthétisé Les ADN polymérases-adn dépendantes ne peuvent pas mettre en place le premier desoxyribonucléotide. Elles ne peuvent que compléter la chaîne Exemple : POL I Découverte en 1957 par Arthur Kornberg dans des extraits de E.coli. (928 acides aminés). Dite "processive" copie de 20 nucléotides à beaucoup plus sans quitter la matrice. ENZYMES DE LA REPLICATION (2) : ADN polymérase PROCARYOTES (E. coli) Pol I amorce ADN 300 à 400 par cellule Pol II 17 à 100 par cellule Pol III amorce ARN 10 à 20 par cellule Pol I Pol II Pol III Masse (en kd) Nb molécules/cellule 400 ~ Vitesse de polymérisation Polymérisation : 5'-> Exonucléase : ->5' Exonucléase : 5'-> Plus quelques polymèrases (IV et V) dont nous ne parlerons pas ici

5 ENZYMES DE LA REPLICATION : ADN polymérase (2) 5'P P Activité 5' Pol I Activité 5' Pol I Pol III Pol I Peut couper jusqu'à 10 nucléotides N'enlève que le nucléotide mal apparié. Activité 5' Pol I Pol III Pol I Le brin matrice est en bleu, le brin amorce en rouge. L'extrémité terminale du brin amorce peut basculer entre le site catalytique polymérase (P) et le site exonucléase ->5', sans que le brin soit dissocié de l'enzyme. Tout facteur de déstabilisation de l'adn double brin, tel qu'une paire de bases mésappariée, favorise le mode correctif et ainsi provoque l'excision du nucléotide du brin amorce.

6 POLYMERASE - Eucaryotes Polymérase α β γ δ ε noyau noyau Mitoch. noyau noyau Amorce ARN ADN La polymérase α (5 sous-unités dans les cellules de foie de rat) allonge un brin dans le sens 5'-> à partir d'une amorce, mais elle possède aussi une activité de type primase. Elle n'a pas d'activité exonucléase, l'adn répliqué doit être relu par un autre système de contrôle. Elle montre une "processivité " limitée ( 100 nucléotides). La polymérase δ ne possède pas d'activité primase mais montre une activité exonucléasique ->5'. Sa "processivité" est pratiquement sans limite. La polymérase β à une taille remarquablement petite. La polymérase ε possède une activité exonucléase ->5' qui dégrade l'adn simple brin en oligonucléotides de 6 à 7 résidus plutot quand mononucléotide comme le fait la polymérase δ. Elle semble intervenir dans certain processus de réparation (UV). REPLICATION DE L'ADN - protéines de la réplication Processus complexe qui implique une grande variété de protéines : (1) ADN gyrase, (2) hélicases qui séparent les brins d ADN à la fourche de réplication, (3) Des protéines qui empêchent les 2 brins d ADN de se réassocier avant d avoir été répliqués, (4) Des enzymes pour synthétiser les amorce ARN, (5) Une ADN polymérase, (6) Une enzyme pour enlever les amorces ARN, (7) Une enzyme pour ligaturer de façon covalente les fragments d Okazaki.

7 PRIMASE : ARN polymèrase-adn dépendante Court fragment d'arn (1 à 60 nucléotide) synthétisé (chez E. coli) soit par l'arn polymèrase soit par la primase, enzyme de 60 dd Sous-unité de Polα (Eucaryotes) L'ADN mature ne contient plus d'arn. Les amorces ARN sont donc enlevées et les trous simple brin qui en résultent sont comblés sous forme d'adn (voir plus loin) REPLICATION DE L'ADN - protéines de la réplication Processus complexe qui implique une grande variété de protéines : (1) ADN gyrase, (2) hélicases qui séparent les brins d ADN à la fourche de réplication, (3) Des protéines qui empêchent les 2 brins d ADN de se réassocier avant d avoir été répliqués, (4) Des enzymes pour synthétiser les amorce ARN, (5) Une ADN polymérase, (6) Une enzyme pour enlever les amorces ARN, (7) Une enzyme pour ligaturer de façon covalente les fragments d Okazaki.

8 ADN ligase brin d'adn + 5' brin d'adn brin d'adn brin d'adn ADN ligase ATP ou NaD 5' + + 5' brin 27 d'adn kd chez E. coli brin d'adn brin d'adn 5' brin d'adn La ligase ne peut pas lier des molécules d'adn simple brin. La chaîne liée doit faire partie d'une molécule d'adn double brin. En fait la ligase referme des coupures dans un ADN double brin. PROTÉINES DE LA RÉPLICATION Processus complexe qui implique une grande variété de protéines : (1) ADN gyrase, (2) Hélicases qui séparent les brins d ADN à la fourche de réplication, (3) Des protéines qui empêchent les 2 brins d ADN de se réassocier avant d avoir été répliqués, (4) Des enzymes pour synthétiser les amorce ARN, (5) Une ADN polymérase, (6) Une enzyme pour enlever les amorces ARN, (7) Une enzyme pour ligaturer de façon covalente les fragments d Okazaki.

9 Des protéines particulières facilitent l'ouverture de la double hélice d'adn devant la fourche de réplication L'ADN hélicase : déroule l'adn double brin au niveau de la fourche de réplication, Les SSB proteins (single-strand DNA-binding proteins) se lient aux chaînes ouvertes sans recouvrir les bases, qui restent donc disponible pour des processus de matriçage. Elle empêche la refermeture du double brin. L'ADN gyrase (une topoisomérase de type II crée des supertours négatif. Le rôle de la gyrase est donc de supprimer les supertours créés par le "déroulement" de l'adn CARACTERES GENERAUX DE LA REPLICATION Caractère semi-conservatif

10 Expérience de Meselson et Stalh, 1958 Interprétation CARACTERES GENERAUX DE LA REPLICATION Caractère semi-conservatif Expériences de Meselson et Stahl

11 La réplication est bidirectionnelle Un organise est mis à incuber pendant plusieurs générations dans un milieu légèrement marqué avec de la thymidine [3 H ], de telle façon que tout son ADN soit visible sur un autoradiogramme. Une grande quantité de thymidine [3 H ], est ensuite ajouté au milieu pendant quelques secondes, avant que l'adn soit isolé ("pulse labeling") pour ne marquer que les bases proches de la ou des fourches de réplication. Si la réplication est unidirectionnelle, on ne verra qu'un point de branchement fortement marqué, tandis que si elle est bidirectionnelle, deux branchements seront visibles. MECANISMES MOLECULAIRES Alors que chez E. coli il n'y a qu'un seul point d'initiation, le temps de la phase S serait beaucoup trop long s'il n'y en avait qu'un chez les eucaryotes. Les ADN eucaryotes possède de nombreuse unités de réplication (appelées réplicons). Les réplicons ont une longueur moyenne de 30µ. Un génome mammalien haploïde en possède environ Chaque chromosome peut avoir plusieurs milliers de points d'initiation de la réplication. Chaque fourche réplicative progresse à une vitesse de 0,5µ par minute, ce qui est 50 fois plus lent que chez E.coli.

12 MECANISMES MOLECULAIRES (2) Origine de réplication Œil de réplication Fourches de réplication Deux fourches de réplication progressent dans des directions opposées à partir de l'origine de réplication (O) jusqu'à ce qu'elles atteignent le point terminal (T) où elles rencontrent le réplicon voisin. Origine Réplication chez les bactéries

13 La synthèse d'un des brins est discontinue ADN nouvellement synthétisé A faible résolution, la direction apparente de réplication de l'adn semble être 5' sur un brin et 5' sur l'autre. On sait pourtant que toutes les polymérases connues ne peuvent allonger le brin d'adn que dans le sens 5'. Ce dilemme à été résolu par R. Okazaki qui à montré qu'une grande proportion de l'adn nouvellement synthétisé existait sous forme de petits fragments appelés : fragments d'okasaki. Ces fragments ont de 1000 à 2000 nucléotides chez les procaryotes, de 100 à 200 nucléotides chez les eucaryotes. chaîne à élongation continue chaîne à élongation discontinue Les fragments d'okasaki sont synthétisé dans le sens 5' Mais les fragments successifs apparaissent dans un ordre linéaire 5' sur la chaîne discontinue en direction de la fourche. Brin avancé ou précoce Brin retardé ou tardif Les fragments d'okasaki, ainsi que la chaîne continue, sont amorcés par l'extrémité -OH libre de courtes chaînes d'arn. Les fragments d'okasaki sont ensuite reliés en une chaîne continue.

14 RESUME DES ETAPES DE LA REPLICATION D'UN BRIN MATRICE (1) O ADN matrice 5' brin d'arn amorce existence transitoire primase O 5' ADN polymérase à amorce ARN ADN en cours d'élongation ADN polymérase à amorce ARN pol III : procaryotes pol α : eucaryotes O exonucléase 5' 5' excision de l'amorce Procaryotes : polymérase I Eucaryotes : ribonucléase RESUME DES ETAPES DE LA REPLICATION D'UN BRIN MATRICE (2) ADN polymérase à amorce ARN O 5' 5' excision de l'amorce O 5' 5' 5' ADN polymérase à amorce ADN Procaryotes : polymérase I Eucaryotes : polymérase δ 5' O 5' ligase soude