Maintenance, stabilité et remaniements du Génome. A. Galmiche,

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1 Maintenance, stabilité et remaniements du Génome A. Galmiche,

2 1. Mutations et Réparation 2. Recombinaison et Plasticite du genome 3. Polymorphisme 4. Vieillissement, Cancer et stabilité du génome

3 1. Mutations et Reparation 2. Recombinaison et Plasticite du genome 3. Polymorphisme 4. Vieillissement, Cancer et stabilité du génome

4 Agents lésant l ADN Radiations (rayt γ, X, UV) Radicaux libres oxygénés, oxydants (superoxyde) Chimiothérapies anti-cancéreuses (agents alkylants) Composés chimiques environnementaux: hydrocarbones (cigarette)

5 Tabac et Mutations Tabagisme: facteur de risque essentiel dans cancer poumon Séquençage comparé cellule cancéreuse du poumon / cellules du sang: mutations 1 mutation introduite pour 15 cigarettes fumées! Nature 2010;463:

6 Types de Lésions de l ADN Altérations des bases: deamination, alkylation liaisons covalentes intra/inter-brin (dimères pyrimidine induits par les UV) Mismatches, produits par defauts de replication Cassures simple/double brins

7 Mécanismes limitant les Lésions de l ADN Mécanismes Préventifs: systemes regulateurs Redox Mécanismes de Réparation Réparation directe par reversion du mécanisme chimique Base Excision Repair (BER) Nucleotide Excision Repair (NER) Correction des mésappariements / Mismatch Repair (MR) Reparation Cassure simple / double brins

8 Réparation directe par réversion du mécanisme chimique Les agents alkylants utilisés comme chimiotherapies anti-cancéreuses. Alkyltransferases: O 6 -methylguanine-dna methyltransferase (MGMT)

9 Base-Excision Repair (BER) 1. reconnaissance base anormale par DNA glycosylases 8 gènes au moins chez l homme spectre propre modifications 2. Laisse site abasique (AP: apurique/apyrimidique) 3. AP endonucléase enlève le deoxyribose phosphate 4. Réparation par DNA polymerase 5. Ligation

10 Déamination de la Cytosine Cytosine Uracil deamination Excision de Base BER

11 Nucleotide-Excision Repair (NER) Ce système s applique à la reconnaissance de lésions volumineuses, altérant la conformation de la double hélice (typiquement les lésions UV, qui induisent des pontages intra-brin: dimères thymines)

12 Nucleotide-Excision Repair (NER) 1. Reconnaissance de la lésion 2. Ouverture ADN au niveau d une bulle par une helicase 3. Coupure en 3 et 5 de la region endommagée 4. Synthèse ADN à partir du brin intact: DNA polymerase 5. ADN ligase

13 Effet mutagénique des UV Défauts NER à l origine du Xeroderma pigmentosum Hypersensibilite cutanee: coups de soleils, atrophie, anomalies de la pigmentation dès le plus jeune age et augmentation marquée du risque de cancers cutanes

14 Réparation des Mésappariements (Mismatch Repair, MR) Erreurs d appariements peuvent survenir au cours de la réplication de l ADN typiquement petites insertions et délétions Cette fois, un problème spécifique: reconnaître le brin d ADN sur lequel réside la mutation Système de reparation des mésappariements, basé les différences de méthylation pour repérage de l ADN néosynthétisé

15 Conséquences Pathologiques des défauts de Réparation des Mésappariements (I) Défaut de système MR se traduit par un syndrome de prédisposition au cancer cancer colorectal héréditaire sans polypose (HNPCC) ou syndrome de Lynch

16 Conséquences Pathologiques des défauts de Réparation des Mésappariements (II) Diagnostic moléculaire du défaut du système de réparation des mésappariements: mise en évidence de l instabilité des microsatellites, des séquences courtes et répétées du génôme: typiquement motif (CA)n

17 Cassures double brin Ce type de lésions peut survenir accidentellement (oxydation de l ADN), ou dans un contexte programmé (les gènes des immunoglobulines / du récepteur des cellules T) Réparation est possible grace à 2 systemes de recombinaison 1. Recombinaison homologue (HR) 2. Recombinaison entre extremites non homologues (NHEJ)

18 Recombinaison Homologue Cassure double brin réparée à partir de chromatide homologue Privilégiée au cours du cycle cellulaire (phases S, G2) et permet restauration de l ADN

19 Réparation des coupures double brin par jonction des terminaisons non-homologue (NHEJ) La jonction des extrémités de l ADN se fait indépendamment de la séquence.. Ce qui peut résulter en l introduction d erreurs

20 Rôle physiologique du système NHEJ Système NHEJ mis en jeu lors de la recombinaison VDJ Déficits du système NHEJ à l origine de déficits immunitaires combinés sévères (SCID)

21 1. Mutations et Reparation 2. Recombinaison et Plasticite du genome 3. Polymorphisme 4. Vieillissement, Cancer et stabilité du génome

22 Recombinaison et Plasticité du Génome Remodelage du génome programmé dans certaines circonstances Méiose: crossing-over entre chromosomes permet brassage de l information génétique au cours de la gamétogenèse Réponse immunitaire: lymphopoièse B / T

23 Les récepteurs à l antigène des cellules B et T Lymphocyte B: immunoglobulines Lymphocyte T: TCR Récepteurs de ces cellules sont générés grâce à recombinaison

24 Recombinaison génétique et genèse du répertoire des Immunoglobulines Les gènes codant les immunoglobulines (ou les récepteurs des cellules T) ne sont pas présents sous forme active dans les précurseurs de ces cellules Gènes d immunoglobulines sont assemblés par combinaison de segments de gènes: - variable (V), diversity (D), Joining (J), formant la région de reconnaissance de l antigène - Constant (C), pour la portion constante

25 Recombinaison des gènes Ig / TCR Locus IgH

26 Combinatoire et répertoire des Immunoglobulines Vκ 40 Jκ 5 Vλ 31 Jλ chaines légères VH 51 JH 25 DH chaines lourdes Soit au total plusieurs millions de spécificités immunoglobulines Par le biais de la combinatoire, les cellules B sont capables de fabriquer plusieurs millions d Ig différents à partir de peu de gènes

27 Lymphopoièse et Réarrangements des Gènes des Immunoglobulines

28 Switch d Isotype Changement d isotype au cours maturation de la réponse immunitaire IgM: réponses innées, précoces IgG, A, E, ultérieurement, après activation par antigène permettant la «spécialisation» de la réponse immunitaire humorale, adaptée à la confrontation de pathogènes parasitaires (IgE), présents dans le sérum (IgG), ou au contact des muqueuses (IgA) Le switch d isotype est réalisé par recombinaison dans la région constante dans chaine lourde des Ig. La région variable est conservée: l Ig conserve donc sa spécificité antigène

29 Switch d Isotype

30 Conclusions Intermédiaires Le génome subit constamment des altérations, et il est en permanence l objet de réparations Réparation prévient l apparition de certaines pathologies: notamment cancers! Génome est aussi plastique, et certains systèmes de réparation cooptés pour homéostasie tissulaire (cellules immunitaires)

31 1. Mutations et Reparation 2. Recombinaison et Plasticite du genome 3. Polymorphisme 4. Vieillissement, Cancer et stabilité du génome

32 Plusieurs types de mutations / réarrangements

33 Conséquences Physiologiques et Pathologiques des mutations 99.6% d identité entre séquences génomiques comparées entre individus Altérations du génome à l origine de l existence de variants des gènes, appelés allèles Certaines mutations à l origine de pathologies: mucoviscidose, anémies, etc. À voir dans le cours de génétique (Pr Rochette)

34 1. Mutations et Reparation 2. Recombinaison et Plasticite du genome 3. Polymorphisme 4. Vieillissement, cancer et stabilite du genome

35 Le Cancer est une maladie du Génome Effet cancérigène des mutagènes (UV, cigarette) Les défauts de réparation des anomalies génétiques engendrent des syndromes de prédisposition aux cancers Des altérations du génome sont notées dans pratiquement toutes les tumeurs Theodor Boveri

36 Le Cancer est une maladie du Génome Certaines mutations transforment des gènes normaux en oncogènes, favorisant ainsi la transformation en cellule cancéreuse D autres mutations possèdent le même effet pro-oncogénique, mais par le biais de la perte de fonction des anti-oncogènes

37 L accumulation progressive de ces anomalies génétiques dicte la progression tumorale

38 Anomalies Génétiques et Cancers Altérations qualitatives: mutations activantes d oncogènes ou inactivantes d anti-oncogènes oncogènes RAS et RAF Altérations quantitatives: amplifications oncogènes, pertes anti-oncogènes oncogène HER2

39 Les Oncogènes RAS, RAF, activés par mutations ponctuelles dans les Cancers RAS et RAF, des protéines impliquées dans la signalisation en aval des récepteurs mitogènes Mutations activantes ponctuelles de K-RAS et B-RAF sont retrouvées dans 1/3 des cancers humains: mutations KRAS V12 du cancer colique et BRAF E600 dans mélanomes Ces mutations réalisent une activation constitutive de la voie RAS- RAF, ce qui contribue à transformer la cellule en cancer

40 La voie RAF est l une des voies biochimiques les plus souvent activées dans les tumeurs humaines Récepteurs RAS RAF Prolifération, résistance à l apoptose

41 Altérations Quantitatives Cellules cancéreuses présentent en moyenne amplification 1/5e du génome pertes de matériel génétique avec une proportion similaire Ces remaniements possèdent des retentissements importants sur la physiologie des cellules cancéreuses: prolifération accrue, apoptose réduite Cancer du sein: oncogène Her2 (rose), centromères du chromosome 17 (vert)

42 Génome et Vieillissement

43 Le Vieillissement Altération fonctionnelle progressive des tissus endocriniens, vasculaire, cardiaque, cérébral, neurosensoriel, musculaire squelettique, osseux Fréquence accrue de cancers

44 Le Vieillissement: une maladie du génome? Altérations ADN produisent vieillissement précoce de certains tissus (ex. UV et la peau) De nombreuses altérations du génome détectées dans les tissus des individus agés

45 Deux types d atteintes biologiques pour expliquer les mécanismes génomiques du vieillissement 1. Sénescence réplicative: lésions des télomères 2. Les lésions oxydatives de l ADN: lésions de l ADN mitochondrial

46 Sénescence Réplicative En culture, les cellules d un individu connaissent un nombre limité de doublements cellulaires: divisions chez l homme (Hayflick). Après quoi survient arrêt de la prolifération: sénescence réplicative Potentiel réplicatif va de pair avec la conservation des télomères

47 Les télomères, des structures spécifiques qui protègent l extrémité des chromosomes Telomeres caracterises par presence motif TTAGGG repete sur 3-20 kb.

48 Télomères et vieillissement Les télomères tendent à s altérer au fil des réplications. Leur réduction progressive constitue peut-être un parametre important dans le vieillissement. Les télomères ne sont pas répliqués comme le reste du génôme Telomerase, une enzyme qui assure maintenance de ces extremites et est active dans lignee germinale et les cellules cancereuses (Prix Nobel de Médecine 2009 à Blackburn, Greider, et Szostak)

49 Lésions oxydatives de l ADN et vieillissement Rôle du stress oxydant évoqué de longue date dans le processus de vieillissement Marqueurs suggérent degrés accrus d oxydation des macromolécules dans les tissus des personnes agées

50 Espèces oxydantes et Mitochondrie Mitochondrie est le siège de la respiration cellulaire Repose sur extraction des électrons de haute énergie à partir des substrats alimentaires Echappements d électrons: combinaison avec O2 produit des espèces réactives de l oxygène Espèces radicalaires: superoxyde (O2-), ou hydroxyle (OH), Espèces non radicalaires (H2O2) Sources d altérations de la plupart des macromolécules biologiques

51 ADN mitochondrial chez l homme ADN circulaire de pb, environ 4000 copies par cellule Porte 22 trna, 2 ARN ribosomaux, et 13 gènes codant protéines mitochondriales, notamment certaines protéines de la chaine respiratoire Les altérations de l ADN mitochondrial compromettent le fonctionnement de la chaine respiratoire mitochondriale!

52 L ADNmt possède un taux de mutation élevé par rapport à l ADN nucleaire! La proximite de la chaine respiratoire est source de mutations du fait de l action des radicaux libres oxygénés qu elle produit En plus, pas d histones (nucleoides), et peu de systèmes de réparation des lésions de l ADN (pas de NER ou de MR dans la mitochondrie. BER est la seule modalité connue pour la reparation des erreurs de l ADNmt) De plus, les lésions de l ADNmt sont potentiellement à l origine d un cercle vicieux favorisant leur amplification et la production d espèces oxydantes par la mitochondrie

53 Lesions mitochondriales: un cercle vicieux? mutations mtdna production accrue ROS Défaut respiration Les lesions de l ADN mitochondrial initient un cercle vicieux en altérant la chaine respiratoire, ce qui accroit encore la production d espèces réactives de l oxygènes... Une base moleculaire pour le vieillissement?

54 Mutations de l ADNmt et Vieillissement 1. Mutations ADN mitochondrial s accumulent au fil de l âge dans pratiquement tous les tissus 2. Introduction artificielle de mutations de l ADNmt dans la souris induit l apparition d un phénotype évoquant un vieillissement prématuré

55 Un modèle murin de vieillissement d origine mitochondriale Remplacement POLG par version introduisant des erreurs dans mtdna reduction esperance de vie perte de poids, reduction du tissu graisseux sous-cutane, alopecie, insuffisance cardiaque cyphose, osteoporose, anemie, reduction fertilite Trifunovic A et al. (2004) Nature 429:

56 Conclusion Générale Le génome est constamment en évolution. Structure dynamique, dont la plasticité est mise en jeu de façon physiologique (gamétogenèse et système immunitaire) Rôle pathologique probable... le vieillissement et les pathologies qui lui sont associées, comme le cancer