Fiche de validation de méthode analytique
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- Étienne Théodore Alain
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1 Page : 1/8 Cellule Contaminants Analyte (ou groupe d analytes) PCDD/Fs et DL-PCBs Matrice (ou groupe de matrices) Huile végétale à destination animale Date de création Décembre 2013 Auteur GE, GS
2 Page : 2/8 1 Objet & Domaine d application Ce dossier a pour objet la validation d une méthode d analyse des PCDD/Fs et DL-PCBs dans les huiles végétales à destination animales par GC-MS/MS suivant le MO-dioxMS-MS et en accord avec le règlement européen 278/ Les étapes de la validation 2.1 La courbe d étalonnage La courbe d étalonnage consiste à déterminer la relation mathématique entre la réponse instrumentale et la concentration d analyte à l état pur. Dans le cas présent, il s agit d une droite. Néanmoins, le choix d un modèle linéaire soulève la question de ses limites d application et dès lors il faut toujours préciser les limites du domaine de linéarité. Tableau 1 : Limites des domaines de linéarité pour les congénères PCDD/Fs et DL-PCBs Domaine de linéarité Nombre de points de RSD Critères RRF (pg injecté) courbe d étalonnage mesuré 2,3,7,8 TCDD R 2 >0.995 RSD RRF <15% 7.1 1,2,3,7,8 PeCDD R 2 >0.995 RSD RRF <15% ,2,3,4,7,8 HxCDD R 2 >0.995 RSD RRF <15% 8.2 1,2,3,6,7,8 HxCDD R 2 >0.995 RSD RRF <15% 9.4 1,2,3,7,8,9 HxCDD R 2 >0.995 RSD RRF <15% 6.2 1,2,3,4,6,7,8 HpCDD R 2 >0.995 RSD RRF <15% 2.0 OCDD R 2 >0.995 RSD RRF <15% 1.3 2,3,7,8 TCDF R 2 >0.995 RSD RRF <15% 9.2 1,2,3,7,8 PeCDF R 2 >0.995 RSD RRF <15% 8.8 2,3,4,7,8 PeCDF R 2 >0.995 RSD RRF <15% 7.3 1,2,3,4,7,8 HxCDF R 2 >0.995 RSD RRF <15% 9.6 1,2,3,6,7,8 HxCDF R 2 >0.995 RSD RRF <15% 8.3 1,2,3,7,8,9 HxCDF R 2 >0.995 RSD RRF <15% 3.6 2,3,4,6,7,8 HxCDF R 2 >0.995 RSD RRF <15% 8.8 1,2,3,4,6,7,8 HpCDF R 2 >0.995 RSD RRF <15% 4.4 1,2,3,4,7,8,9 HpCDF R 2 >0.995 RSD RRF <15% 2.3 OCDF R 2 >0.995 RSD RRF <15% 2.6 PCB R 2 >0.995 RSD RRF <15% 1.5 PCB R 2 >0.995 RSD RRF <15% 0.7 PCB R 2 >0.995 RSD RRF <15% 4.1 PCB R 2 >0.995 RSD RRF <15% 1.6 PCB R 2 >0.995 RSD RRF <15% 5.5 PCB R 2 >0.995 RSD RRF <15% 5.7 PCB R 2 >0.995 RSD RRF <15% 9.4 PCB R 2 >0.995 RSD RRF <15% 4.8 PCB R 2 >0.995 RSD RRF <15% 3.7 PCB R 2 >0.995 RSD RRF <15% 5.5 PCB R 2 >0.995 RSD RRF <15% 5.1 PCB R 2 >0.995 RSD RRF <15% 4.4
3 Page : 3/8 2.2 Spécificité/sélectivité La spécificité/sélectivité est la capacité d'une méthode à discerner l'analyte mesuré d'autres substances. Cette caractéristique est essentiellement une fonction de la technique de mesure décrite, mais peut varier selon la classe du composé ou de la matrice. La procédure d analyse et la détection chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse en tandem déterminent la spécificité de la méthode. La sélectivité est évalué sur : Temps de rétention : Rapport d ions : le temps de rétention relatif de l analyte par rapport aux étalons internes est de maximum 0.25% le rapport entre les ions filles produits par les 2 transitions sélectionnées doit être compris dans un écart de ± 15% du rapport théorique Ces critères ont été vérifiés pour chaque analyte de chaque échantillon et point de courbe d étalonnage. 2.3 Les Limites de Quantification (LOQ) La limite de quantification est un critère très répandu en chimie. Malheureusement, les définitions et les méthodes de calcul foisonnent, créant une certaine confusion. En outre, utilisant le détecteur étant la spectrométrie de masse en tandem, nous ne pouvons utiliser aucune méthode faisant intervenir le rapport signal sur bruit (S/N). Dès lors, 2 méthodes ont été sélectionnées suivant que le congénère soit présent ou non dans le blanc de procédure : 1. Congénère présent dans le blanc de procédure : La LOQ correspond à la concentration moyenne présente dans le blanc de procédure à laquelle on a ajouté 6 fois l écart type associé à cette concentration. LOQ = X b + 6 SD 2. Congénère non présent dans le blanc de procédure La LOQ correspond au plus petit point de la courbe d étalonnage pour lequel l écart à la moyenne des réponses est inférieur à 30%. Tableau 2 : synthèse des résultats des blancs et calcul des LOQs (prise d essai 4 g) Moyenne des blancs SD LOQ (pg/g ; n=6) (ng/g ; n=6) (ng/g) 2,3,7,8 TCDD ND ,2,3,7,8 PeCDD ND ,2,3,4,7,8 HxCDD ND ,2,3,6,7,8 HxCDD ND ,2,3,7,8,9 HxCDD ND ,2,3,4,6,7,8 HpCDD ND OCDD ND ,3,7,8 TCDF * 1,2,3,7,8 PeCDF ND ,3,4,7,8 PeCDF ND ,2,3,4,7,8 HxCDF ND ,2,3,6,7,8 HxCDF ND ,2,3,7,8,9 HxCDF ND ,3,4,6,7,8 HxCDF ND ,2,3,4,6,7,8 HpCDF ND ,2,3,4,7,8,9 HpCDF ND
4 Page : 4/8 OCDF * PCB * PCB * PCB * PCB169 ND PCB * PCB * PCB * PCB123 ND PCB * PCB157 ND PCB167 ND PCB189 ND * : LOQ liées au niveau moyen mesuré dans les blancs de procédure. Tableau 3 : synthèse des LOQs pour les sommes en utilisant les WHO-TEF 2005 (prise d essai 4 g) LOQ (pg WHO-TEQ / g) Somme PCDD/Fs 0.37 Somme DL-PCBs 0.35 Somme PCDD/Fs et DL-PCBs 0.72 Avec ces LOQs, la méthode ne peut pas être utilisée que pour du screening (pour la confirmation, les LOQs des sommes doivent être inférieures à 20 % du niveau maximum autorisé). 2.4 La fidélité La fidélité est l étroitesse d'accord entre des résultats de tests indépendants obtenus dans des conditions stipulées (prédéterminées). La fidélité d une méthode d analyse est évaluée ici via sa fidélité intermédiaire en analysant 3 séries de 2 replicats et ce à 3 niveaux de concentration (0,5x - 1x et 2 x le niveau d intérêt) La fidélité intermédiaire Tableau 4 : fidélité intermédiaire pour le niveau 1 (0,5 fois le niveau d intérêt) Valeur cible Valeur moyenne RSD Justesse (pg/g) (pg/g ; n=6) 2,3,7,8 TCDD % 101% 1,2,3,7,8 PeCDD % 98% 1,2,3,4,7,8 HxCDD % 86% 1,2,3,6,7,8 HxCDD 0.13 * % 105% 1,2,3,7,8,9 HxCDD 0.13 * % 73% 1,2,3,4,6,7,8 HpCDD 0.13 * % 103% OCDD 0.13 * % 108% 2,3,7,8 TCDF 0.13 * % 116% 1,2,3,7,8 PeCDF % 88% 2,3,4,7,8 PeCDF % 94% 1,2,3,4,7,8 HxCDF % 107% 1,2,3,6,7,8 HxCDF % 99% 1,2,3,7,8,9 HxCDF % 93% 2,3,4,6,7,8 HxCDF % 91% 1,2,3,4,6,7,8 HpCDF 0.13 * % 95% 1,2,3,4,7,8,9 HpCDF % 72% OCDF 0.13 * % 116%
5 Page : 5/8 PCB * % 287% PCB * % 107% PCB % 110% PCB % 90% PCB * % 86% PCB % 86% PCB * % 83% PCB % 90% PCB % 84% PCB % 85% PCB % 85% PCB % 92% *: <LOQ Tableau 5 : fidélité intermédiaire pour le niveau 2 (niveau d intérêt) Valeur cible (pg/g) Valeur moyenne (pg/g ; n=6) RSD Justesse 2,3,7,8 TCDD % 102% 1,2,3,7,8 PeCDD % 107% 1,2,3,4,7,8 HxCDD % 84% 1,2,3,6,7,8 HxCDD % 109% 1,2,3,7,8,9 HxCDD 0.25* % 88% 1,2,3,4,6,7,8 HpCDD 0.25 * % 97% OCDD 0.25 * % 126% 2,3,7,8 TCDF % 107% 1,2,3,7,8 PeCDF % 95% 2,3,4,7,8 PeCDF % 104% 1,2,3,4,7,8 HxCDF % 89% 1,2,3,6,7,8 HxCDF % 98% 1,2,3,7,8,9 HxCDF % 89% 2,3,4,6,7,8 HxCDF % 100% 1,2,3,4,6,7,8 HpCDF 0.25 * % 109% 1,2,3,4,7,8,9 HpCDF % 77% OCDF 0.25 * % 118% PCB * % 138% PCB * % 94% PCB % 103% PCB % 90% PCB * % 86% PCB % 86% PCB * % 86% PCB % 90% PCB % 82% PCB % 84% PCB % 84% PCB % 90% *: <LOQ Tableau 6 : fidélité intermédiaire pour le niveau 3 (2 fois le niveau d intérêt) Valeur cible Valeur moyenne RSD Justesse (pg/g) (pg/g ; n=6) 2,3,7,8 TCDD % 99% 1,2,3,7,8 PeCDD % 113% 1,2,3,4,7,8 HxCDD % 88%
6 Page : 6/8 1,2,3,6,7,8 HxCDD % 105% 1,2,3,7,8,9 HxCDD % 93% 1,2,3,4,6,7,8 HpCDD 0.50 * % 100% OCDD 0.50 * % 104% 2,3,7,8 TCDF % 109% 1,2,3,7,8 PeCDF % 95% 2,3,4,7,8 PeCDF % 110% 1,2,3,4,7,8 HxCDF % 90% 1,2,3,6,7,8 HxCDF % 104% 1,2,3,7,8,9 HxCDF % 92% 2,3,4,6,7,8 HxCDF % 98% 1,2,3,4,6,7,8 HpCDF % 103% 1,2,3,4,7,8,9 HpCDF % 82% OCDF 0.50 * % 109% PCB * % 102% PCB * % 100% PCB % 101% PCB % 90% PCB % 108% PCB % 86% PCB * % 99% PCB % 91% PCB % 83% PCB % 83% PCB % 83% PCB % 90% *: <LOQ Tableau 7 : résumé des valeurs de fidélité intermédiaire pour les sommes en WHO-TEQ Niveau 1 Niveau 2 Niveau 3 Paramètres Valeur cible Valeur moyenne RSD Justesse (pg WHO-TEQ / g) (pg WHO-TEQ / g ; n=6) Somme PCDD/Fs Somme DL-PCBs Somme PCDD/Fs et DL-PCBs Somme PCDD/Fs Somme DL-PCBs Somme PCDD/Fs et DL-PCBs Somme PCDD/Fs Somme DL-PCBs Somme PCDD/Fs et DL-PCBs Le critère de fidélité intermédiaire (RSD < 20%) est rempli pour les sommes à chacun des 3 niveaux. La fidélité intermédiaire de certains congénères (PCB77, PCB118 entre autre) n a pu être évaluée car la valeur cible est inférieur à la LOQ. 2.5 La justesse En plus des résultats sur échantillons dopés pour l étude de la fidélité, la justesse a aussi été évaluée via l analyse d un échantillon d EIL. Tableau 8 : Résultat pour l échantillon de l EIL organisé par l EU-RL dioxines en janvier 2013 Valeur concensus Valeur mesurée (pg/g) (pg/g) z-score 2,3,7,8 TCDD - <LOQ (0.09) - 1,2,3,7,8 PeCDD - <LOQ (0.09) -
7 Page : 7/8 - : non évalué 1,2,3,4,7,8 HxCDD - <LOQ (0.09) - 1,2,3,6,7,8 HxCDD - <LOQ (0.23) - 1,2,3,7,8,9 HxCDD - <LOQ (0.45) - 1,2,3,4,6,7,8 HpCDD 0.26 <LOQ (1.80) - OCDD 2.42 <LOQ (18.00) - 2,3,7,8 TCDF ,2,3,7,8 PeCDF ,3,4,7,8 PeCDF ,2,3,4,7,8 HxCDF ,2,3,6,7,8 HxCDF ,2,3,7,8,9 HxCDF - <LOQ (0.09) - 2,3,4,6,7,8 HxCDF - <LOQ (0.09) - 1,2,3,4,6,7,8 HpCDF - <LOQ (0.45) - 1,2,3,4,7,8,9 HpCDF OCDF - <LOQ (1.25) - PCB PCB <LOQ (11.34) - PCB PCB169 - <LOQ (1.44) - PCB PCB PCB PCB PCB PCB PCB PCB189 - <LOQ (25.00) - Tableau 9 : Résultat pour l échantillon de l EIL organisé par l EU-RL dioxines en janvier 2013 Valeur consensus Valeur mesurée (pg WHO-TEQ / g) (pg WHO-TEQ / g) z-score Somme PCDD/Fs Somme DL-PCBs Somme PCDD/Fs et DL-PCBs Bien que le z-score pour la somme des PCDD/Fs soit trop élevé, les résultats sont acceptables car ce sont les valeurs de LOQs qui contribuent majoritairement à cette somme. 2.6 Les incertitudes de mesure L incertitude de mesure a été déterminée en utilisant l approche Top-Down. Elle n a été mesurée que pour les sommes qui sont utilisées pour prendre les décisions. Trois composantes ont été prises en compte : - Les résultats de fidélité - Le résultat de justesse - La pureté du standard Tableau 10 : RSD pour le pool d échantillon utilisé pour l étude de fidélité RSD (% ; n=17) Somme PCDD/Fs 13 Somme DL-PCBs 4 Somme PCDD/Fs et DL-PCBs 8
8 Page : 8/8 Tableau 11 : Etude de la justesse Avec Et R m Somme PCDD/Fs Somme DL-PCBs Somme PCDD/Fs et DL-PCBs _ R m _ C C obs CRM u(r m ) u(r m )/R m 2 sobs u( CCRM ) u( R m ) R m _ 2 CCRM n * C obs Tableau 12 : Incertitude associé à la pureté des standards (98%) suivant une distribution rectangulaire U pureté Somme PCDD/Fs 0.03 Somme DL-PCBs 0.04 Somme PCDD/Fs et DL-PCBs 0.06 Tableau 13 : Incertitude composée et incertitude élargie avec un facteur d élargissement de 2. U fidélité U justesse U pureté U composé U élargie Somme PCDD/Fs Somme DL-PCBs Somme PCDD/Fs et DL-PCBs On remarque que l incertitude de mesure pour la somme des PCDD/Fs est plus élevée que pour les autres sommes. C est une conséquence d une variabilité plus importante des mesures aux faibles niveaux rencontrés pour les dioxines, et du résultat d EIL où le résultat pour la somme des PCDD/Fs est «biaisé» par le poids des LOQs des congénères individuels.
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