1) Informations Techniques. - a) Comment ça marche? - b) Purification - c) Calculs - d) Contrôle Qualité. 2) Synthèse Standard

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1 Distribio privilégie la qualité aussi bien en purifiant tous ses oligos qu'en assurant un contrôle qualité complet incluant le contrôle par spectrométrie de masse systématique. 1) Informations Techniques - a) Comment ça marche? - b) Purification - c) Calculs - d) Contrôle Qualité 2) Synthèse Standard - a) Echelles de Synthèse - b) Oligonucleotides Modifiés - c) Envois et Délais de Livraison - d) Comment commander? 3) Réactifs Chimiques par ChemGenes Informations Techniques GeneCust produit des oligonucleotides de la plus haute qualité correspondant à tous les besoins de la recherche. Notre servive offre une large gamme d'échelles, de formats, d'oligos modifiés et de degrés de pureté. Comment ça marche? Les oligonucléotides sont synthétisés chimiquement à l'aide de phosphoramidites. Un phosphoramidite est un nucleotide normal comprenant des groupements protecteurs sur ses fonctions amine, hydroxyl et phosphate. 1 / 11

2 Réactifs de départ : da(bz) Phosphoramidite dc(bz) Phosphoramidite dg(bz) Phosphoramidite dt(bz) Phosphoramidite Ces groupements protecteurs préviennent les réactions aspécifiques et forcent la synthèse du produit d'intérêt. L'extrémité 5' Hydroxyl est protégée par du DMT (dimethoxytrityl), le groupement phosphate par un groupement diisopropylamine (ipr2n) et un groupement 2-cyanoéthyl (OCH2CH2CN). Les bases sont également protégées au niveau des amines exocycliques (benzoyl or isobutyryl). A la fin de la synthèse, tous ces groupes protecteurs sont éliminés. Lors de la synthèse en phase solide, l'extrémité 3' de l'oligonucléotide est lié à une colonne où la réaction a lieu. Le groupement 3' de la première base est immobilisé via un linker sur le support solide (billes de polystyrène ou autre). Ceci facilite l'addition et l'élimination des réactifs. A chaque étape, la solution contenant les nucléotides pour la réaction suivante est pompée au 2 / 11

3 travers d'une colonne, puis est éliminée avant l'ajout du nucléotide suivant. A la fin du programme de synthèse, l'oligonuclétide est détaché de son support solide et élué de la colonne. Le Cycle de Synthèse La synthèse d'oligonucléotides est réalisée selon un cycle de quatre réactions répétées jusqu'à l'obtention de l'oligo d'intérêt. - Etape 1 - Détritylation (De-blocking) : Le DMT est éliminé à l'aide d'un acide, tel que le TCA (Acide Trichloroacétique). Il en résulte un groupement 5'hydroxyl libre sur la première base. - Etape 2 - Couplage (coupling) : Un nucleotide phosphoramidite (ou un mélange) est activé par du tétrazole : le groupement ipr2n sur le phosphate est éliminé. Puis, la fonction 5' OH déprotégée de la première base et le groupement phosphate de la seconde base réagissent ensemble afin de former une liaison phosphite. Ces reactions n'ont pas lieu dans de l'eau mais dans du tétrahydrofurane ou du DMSO (Dimethylsulfoxid). Les bases non fixées et les produits aspécifiques sont éliminés par lavage. - Etape 3 - Capping : Environ 1% des groupements 5' OH ne réagissent pas avec une nouvelle base. Il est donc nécessaire de les bloquer afin de prévenir les réactions aspécifiques et la formation d'oligonucleotides comportant des délétions. Ceci peut être évité par l'ajout d'un groupement protecteur sous forme d'anhydride acétique et de 1-méthylimidazole : il en résulte une acétylation. L'excès de réactif est éliminé par lavage. 3 / 11

4 - Etape 4 - Oxydation : La liaison phosphite entre la première et la seconde base se doit d'être stabilisée en rendant le groupement phosphate pentavalent. Ceci est rendu possible par l'ajout d'iodine et d'eau. Il en résulte l'oxydation des phosphites en phosphates. Cette étape peut être remplacée par une étape de sulphorylation pour nucleotides thiophosphates. A la fin de la synthèse, 2 étapes sont indispensables. D'une part, l'oligo doit être détaché de son support solide par traitement à l'ammoniaque concentré. Et d'autre part, les groupements protecteurs doivent être éliminés des différentes bases. Pour libérer les fonctions amines exocycliques, la solution d'ammoniac doit être incubée entre 50 C et 80 C pendant 1 à 8 hrs. selon le protocole et les groupements protecteurs utilisés. Purification Le choix de la méthode de purification dépend du type d'oligonucléotides et de vos critères concernant le niveau de purification et le rendement minimum. Il y a une relation entre degré de pureté et rendement. Plus le degré de pureté est élevé, plus le rendement sera faible. Plus le rendement sera élevé, pus le degré de pureté sera faible. Purification par Cartouche en Phase Inverse La Purification cartouche en phase inverse offre généralement le degré de pureté le plus faible (80%). Le principe de séparation est basé sur la différence d'hydrophobicité entre les produits longs (avec groupement protecteurs DMT) et les séquences tronquées (sans groupements DMT). Comme la différence d'hydophobicité entre les produits portant le DMT et les produits tronqués (sans DMT) est réduite lorsque la longueur de l'oligo augmente, la purification cartridge n'est pas recommandée pour les oligos > 50 bases. Purification par HPLC en Phase Inverse 4 / 11

5 Le principe de l'hplc est le même que celui de la purification cartridge, mais le degré de pureté atteint généralement les 90%. La capacité et la résolution des colonnes HPLC sont aussi plus importantes que celles de la purification cartridge, l'hplc est donc la méthode de choix pour la purification de grandes quantités d'oligos (> 1 µmol). Comme pour la purification cartridge, l'hplc n'est pas recommandée pour les oligos supérieurs à 50 bases. Purification par Gel de Polyacrylamide (PAGE) La purification par cette méthode est considérée comme le «Gold Standard» pour la purification d'oligonucléotides et permet d'obtenir jusqu'à 95-99% de pureté. Cette méthode peut être utilisée quelque soit la longueur de l'oligonucléotide. La purification par gel est fortement recommandée pour toutes les applications impliquant des étapes de clonage : mutagénèse et construction de gène par exemple. Les rendements obtenus par la méthode PAGE sont inférieurs à ceux des autres méthodes. Ceci est dû à la difficulté d'extraction des oligos du gel. Calculs : comment estimer l'échelle dont vous avez besoin? Les oligonucléotides sont commandés en fonction d'une échelle de synthèse et non d'une quantité. En fait, chaque oligonucléotide est une molécule unique, avec des propriétés de synthèse uniques basées sur la séquence et les modifications. C'est pourquoi, le rendement de synthèse peut être différent d'une synthèse à l'autre. Ce dernier peut également être rapporté en différentes unités de masse comme le milligramme ou le gramme, en mole ou en unité de DO. Ainsi, quelle échelle devriez vous demander afin d'obtenir des quantités suffisantes? Comment est calculé le rendement? Le rendement est déduit de la mesure de l'absorbance. La spectrophotométrie correspond au moyen le plus précis de mesurer un rendement du fait qu'elle ne tient pas compte des sels, de l'eau et tout autres résidus de synthèse qui pourraient influencer les résultats. Les oligonucléotides sont dissous dans de l'eau ou du tampon et l'absorbance est déterminée à 260 nm. Conversions 5 / 11

6 Les unités DO 260 peuvent être converties en mmoles grâce à la loi de Beer-Lambert qui relie l'absorbance à la concentration à l'aide d'un coefficient d'extinction (ε), une constante propre à chaque substance : ε : ml.µmole -1 Concentration : µmole.ml -1 Le coefficient ε doit être déterminé pour tout oligonucléotide. Différents moyens existent pour cela. La méthode la plus précise consiste à déterminer ε expérimentalement, mais cela serait un processus bien trop long à mettre en place. Il existe donc une autre solution : la méthode du «plus proche voisin». Cette méthode correspond à la somme des coefficients d'extinction (ε) de chaque oligonucléotide de la séquence. Ainsi, en utilisant les données de la séquence de l'oligo et la valeur de DO, il est possible de calculer la concentration et la quantité de matériel comme présenté ci-dessous: A,G,C,T: nombre des bases dans l'oligonucléotide 6 / 11

7 Pour déterminer la masse de l'oligonucléotide, il suffit de multiplier le nombre de moles par le poids moléculaire : Le poids moléculaire d'un oligonucléotide est calculé à partir du nombre de nucléotides dans l'oligonucléotide et à partir d'éventuelles modifications : A,G,C,T: Nombre de bases dans l'oligo MWmod: Poids moléculaire d'une éventuelle modification Qu'est ce qui affecte le rendement de votre oligonucléotide? La quantité de matériel que l'on peut théoriquement obtenir est fonction de la qualité de la synthèse, elle-même réalisée à l'aide d'un synthétiseur automatique. Le rendement de couplage de la synthèse joue un rôle très important. Ceci est facilement démontrable en calculant le rendement théorique avec la formule suivante : 7 / 11

8 X représente le taux de couplage et y le nombre de couplages. Par exemple, la synthèse d'un oligo de 30 mers (soit 29 couplages) avec un taux moyen de couplage de 99% permet d'obtenir théoriquement un rendement de 75% (0.9929). La même synthèse à 98% de taux de couplage permettra d'obtenir seulement 55% de produit. Le graphique suivant représente le rendement de synthèse avec un taux de couplage de 98,5%. Beaucoup de facteurs peuvent influencer le taux de couplage, comme la teneur en eau dans l'acétonitrile ou les phosphoramidites. Le conditions climatiques jouent également un rôle. Les jours très humides peuvent compromettre la qualité de la synthèse malgré des techniques chimiques anhydres et des plus rigoureuses. Les réactions aspécifiques peuvent aussi conduire à une perte de rendement. En fonction de la qualité de la synthèse, la purification peut être l'étape où le plus de matériel est perdu. Une synthèse de haute qualité ne contient qu'une faible teneur d'impuretés à éliminer. Les synthèses de plus faibles qualités contiendront plus de contaminants. Il y aura donc plus de pertes afin d'obtenir une pureté acceptable. Ainsi, en règle générale, le process de purification est coûteux en matériel. Néanmoins, malgré toutes ces difficultés, GeneCust vous garantit un rendement minimum pour les oligos standards, non marqués, inférieurs à 30 bases : 8 / 11

9 * Echelle 10 nmol : 4,5 nmoles * Echelle 40 nmol : 20 nmoles * Echelle 200 nmol : 95 nmoles * Echelle 1000 nmol : 400 nmoles Contrôle Qualité Un contrôle stringent vous garantit des oligonucléotides de la plus haute qualité. Avant la synthèse, tous les produits chimiques sont contrôlés. Pendant la synthèse automatique, toutes les étapes sont monitorées par des fonctions de commande multiples sur les synthétiseurs. C'est ainsi que nous pouvons vous assurer un taux de couplage toujours plus proche de vos attentes. Les oligonucléotides sont ensuite déprotégés, désalés, et la densité optique mesurée à 260 nm. De plus, les oligos sont analysés par electrophorèse et chaque oligonucléotide est contrôlé par spectrométrie de masse. Tous les oligos présentant un mauvais profil sont re-synthétisés aux frais de GeneCust. Synthèse d'oligonucleotides Standards Echelles de Synthèse GeneCust propose quatre échelles de synthèse différentes : 10 nmol, 40 nmol, 200 nmol et 1000 nmol. Pour les oligos standards, non marqués, inférieurs à 30 bases, nous garantissons 9 / 11

10 un rendement minimal : * Echelle 10 nmol : 4,5 nmoles * Echelle 40 nmol : 20 nmoles * Echelle 200 nmol : 95 nmoles * Echelle 1000 nmol : 400 nmoles Longueurs Maximums : 10 nmol : 40 bases 40 nmol : 70 bases 200 nmol : 90 bases Pour des oligos plus longs, GeneCust utilise un protocole de synthèse spécial 1000 nmol. Oligonucleotides Modifiés GeneCust propose une large gamme de modifications de haute qualité synthétisées à l'aide d'un protocole très strict. Vous pouvez notamment trdans notre liste de prix, une liste des fluorochromes que nous proposons pour le marquage des oligonucléotides. Ces derniers peuvent être placés en 5', en 3', ou de manière interne. Vous trouverez également d'autres modifications comme des phosphorylations, des modifications thiol, du marquage à la biotine ou encore la synthèse d'oligonucléotides ARN, de molecular beacons... Si vous êtes à la recherche d'un marquage ou d'une modification absente de notre liste, n'hésitez pas à nous contacter. Nous pourrions être à même de vous la proposer. Envois et Délais de Livraison Les oligos sont expédiés sous forme lyophilisée dans un délai d'une semaine pour les oligos standards. Pour les commandes plus importantes ou contenant des oligos purifiés ou marqués, les délais seront rallongés de quelques jours. N'hésitez pas à nous contacter pour plus d'informations à ce sujet. Frais de port via des transporteurs express : 10 / 11

11 Pour l'europe : 18,00 Reste du monde : 65,00 Devis et Commandes Pour un devis gratuit, contactez nous via info@genecust.com ou par téléphone ( ) ou fax ( ). Pour passer commande, merci de télécharger et de compléter notre formulaire Excel et de l'envoyer à info@genecust.com. Note : Réactifs Chimiques par ChemGenes GeneCust vous propose une large gamme de réactifs pour la synthèse d'oligonucléotides. Tous ces produits sont conçus par ChemGenes et sont strictement identiques aux produits que vous avez l'habitude d'utiliser, et ce avec des prix très compétitifs! GeneCust est le détaillant européen de la gamme de produit ChemGenes. Dans la gamme ChemGenes, vous trouverez des phosphoramidites pour la synthèse d'arn et d'adn, des bases modifiées pour ADN, tout comme des modifications ARN. De plus, une grande variété de phosphoramidites modifiés pour l'introduction de chromophores et de ligands sont produits. Une grande variété de réactifs pour la synthèse d'adn/arn est aussi disponible, elle comprend beaucoup de nucléosides naturels ou modifiés, du tétrazole, du 5-thioethyltétrazole, du DMT-chloride, des deoxy et ribo nucléosides protégés par le DMT, des 2'-O-méthyl and 2'-O-propargyl nucléosides, des ribonucléosides protégés par groupement silyl, et différents types de réactifs de phosphorylation, et bien plus encore... N'hésitez pas à nous contacter via info@genecust.com pour un devis gratuit. 11 / 11