TRANSPORTS MEMBRANAIRES Partie 1. Philippe D. CHAUMET-RIFFAUD Université Paris Sud 11 CHU de Bicêtre

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1 TRANSPORTS MEMBRANAIRES Partie 1 Philippe D. CHAUMET-RIFFAUD Université Paris Sud 11 CHU de Bicêtre Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 1

2 TRANSPORTS MEMBRANAIRES Le transport permanent de molécules entre le milieu extérieur et le milieu intérieur est la caractéristique la plus évidente du vivant au niveau de l absorption des aliments, des transferts à travers les parois capillaires, des échanges entre le milieu extracellulaire et les cellules et, à l'intérieur des différents compartiments cellulaires; ce qui permet: le renouvellement des composants structuraux des tissus, l apport énergétique nécessaire et la communication entre cellules et entre organes. Ceci assurant l'adaptation au milieu et la survie de l'organisme. Les signaux sont en nombre considérable, mais les mécanismes de fonctionnement obéissent à des règles communes. Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 2

3 POURQUOI LES ETUDIER? Objectifs de la pharmacocinétique: 1. Décrire les facteurs physiologiques et physico-chimiques qui influencent l absorption des médicaments, leur distribution dans l organisme, ainsi que leurs voies et mécanismes d élimination. 2. Décrire comment la biodisponibilité, la vitesse d absorption, le volume apparent de distribution, la clairance totale et la demi-vie d élimination influencent les concentrations plasmatiques, ceci en fonction de la voie d administration. Il est donc indispensable de connaître les caractéristiques des transports passifs et actifs de ces molécules pour construire les modèles adéquats. Un exemple parmi d autres Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 3

4 PBPK Bloo d model Paris, le 7 décembre 2009 He art Liv er Intest ine Fat kid Musc ney les other Séminaires du CNEBMN s 4

5 L ensemble des transferts nécessitent d être définis en termes d échanges. Bloo d He art Liv er Intest ine kid ney PBPK model Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 5

6 ROLE DES MEMBRANES CELLULAIRES La cellule est un milieu très structuré assurant le maintien de concentrations différentes en diverses régions de la cellule tout en permettant les échanges d une structure à une autre et d une cellule à une autre. Les membranes ne sont donc pas des barrières qui isolent les différents constituants des cellules et des tissus mais des structures qui assurent le transfert sélectif de molécules d'un milieu vers un autre. * Bien qu il ne s agissent pas à proprement parler de membranes cellulaires, nous aborderons les transferts à travers les parois des capillaires. Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 6

7 RAPPEL SUR LES MEMBRANES Relations Structure - Activité Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 7

8 Quelques questions: 1. La membrane cellulaire plasmique est connue depuis: Le 17 ème siècle Le 18 ème siècle Le 19 ème siècle Le 20 ème siècle. 2. Est ce que la composition en lipides d une cellule est une caractéristique de l espèce concernée? 3. L apparition de radeaux lipidiques dans une membrane cellulaire est-elle un signe précoce de l apoptose? Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 8

9 LES MEMBRANES CELLULAIRES De la plasmique érythrocytaire aux mitochondriale et nucléaire espace extracellulaire Aspect trilamellaire avec deux bandes sombres de part et d autre d une bande claire. Les deux lames sombres correspondent au dépôt métallique opaque aux électrons (tétraoxyde d osmium). Image de digestion/smallgut/anatomy.html Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 9

10 LES PHOSPHOLIPIDES LES MOLECULES ESSENTIELLES Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 10

11 Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 11

12 Une organisation grossièrement en bicouche unsaturated 1-stearoyl-2-docosahexaenoyl-sn-g lycero-3-phosphocholine (SDPC) Mais beaucoup de désordre molecular dynamics simulation Chaine insaturée en vert Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 12

13 UNE MEMBRANE N EST PAS UN PLAN Ondulations Les fluctuations thermiques entraîne des ondulations des membranes. La restriction des ondulations permises entre des membranes proches fluctuantes est à l origine d une interaction d ondulation via la pression exercée Contraintes sur l assemblage Le rapport volume/produit (rayon tête x longueur de la chaîne ) influence la forme de la molécule: <1/3 molécules coniques donnant des micelles Entre 1/3 et ½ cône tronqué donnant des micelles cylindriques entre ½ et 1 cône tronqué donnant des bicouches lipidiques flexibles ou des vésicules =1 forme cylindrique donnant une bicouche plane >1 cône tronqué inverse donnant des micelles inverses Forme de la molécule Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 13

14 MODELE DE SINGER (1972) Singer et Nicholson, se basant sur des résultats expérimentaux ont fait l'hypothèse que «les membranes consistent en une sorte de solution à deux dimensions formée de protéines globulaires intrinsèques dispersées dans une matière lipidique fluide". Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 14

15 LES ECARTS AU MODELE DE LA MOSAIQUE FLUIDE(1972) Adaptation de l épaisseur recrutement de lipides L environnement membranaire, la richesse en cholestérol et en sphingolipides des feuillets membranaires influence fortement les phases observées: Liquide ordonné (lo) Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 15

16 FORME et CYTOSQUELETTE Les propriétés mécaniques de certaines cellules et notamment la conservation de leur forme sont liées à l existence d un cytosquelette qui maintient l architecture. Le meilleur exemple en est le disque biconcave d une hématie normale. Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 16

17 Une organisation bien plus complexe. Les protéines s associent en oligomères. Les protéines ne diffusent plus au hasard mais dans des domaines Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 17

18 MOUVEMENTS DES LIPIDES éjection (épaisseur) friction contorsion (rare) (fluctuation d entassement) Beaucoup de mobilité Adaptabilité structurale Rôle critique de l interface Rôle de l eau Beaucoup de liberté individuelle Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 18

19 LES RADEAUX MEMBRANAIRES La membrane cellulaire: hétérogène dans sa composition et sa structure, il existe des domaines enrichis en certains types de lipides et protéines. Ces domaines du fait de cet enrichissement en cholestérol sont stabilisés. Ces microdomaines ont été identifiés au niveau des cavéoles (vésicules de 60 à150 nm caractérisées par la présence de la cavéoline) et de «radeaux» de 100 à 1000nm (les «rafts») dans des modèles membranaires. Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 19

20 DISTRIBUTION DES IONS A L INTERFACE Surface électriquement chargée Nuage de contre-ions Théorie de Gouy Chapman Stern Accumulation «exponentielle» des contre-ions Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 20

21 L EAU ET LES MEMBRANES Molécules d eau: Acide gras Glycérol Tête polaire Milieu extracellulaire rares Ordonnées Organisées (glace) répartition aléatoire Eau Dipole champ dipolaire vectorialité 7 décembre 2009 Transports membranaires: collége de biophysique

22 ASYMETRIE DES MEMBRANES Asymétrie de la composition en phospholipides et en protéines entre les feuillets interne et externe: face externe riche en lipides glycosylés, en phosphatidylcholine et en AG saturés alors que feuillet interne contient un large excès de phosphatidyléthanolamine et de phosphatidylsérine ainsi que d AG insaturés. Charges de surface différentes entre les deux feuillets ce qui jouera un rôle dans la genèse du potentiel transmembranaire. La perte de cette asymétrie physiologique peut avoir des conséquences drastiques pour la cellule ; ainsi lors de l'apoptose, le passage du phosphatidylsérine du feuillet interne vers l'externe est le signal de mort cellulaire (beaucoup de recherches sur des traceurs ciblant ce signal membranaire). Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 22

23 Sites de passage des molécules au niveau des membranes I. Sites de passage des molécules au niveau des épithéliums et des endothéliums A. Canaux et pores B. Canaux dans les membranes des cellules épithéliales C. Voies des passages à travers l endothélium capillaire II. Canaux artificiels dans les membranes A. Le canal gramicidine B. L ionophore valinomycine Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 23

24 SOLUBILITE DES GRAISSES Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 24

25 CELLULE TUBULAIRE RENALE Jonctions intercellulaires Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 25

26 LES DIFFERENTS TYPES DE TRANSPORT Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 26

27 COMPARAISON DES SYSTEMES MEMBRANAIRES Pores Canaux Transporteurs Aquaporine Canal Na+ Glucose transporter Toujours ouvert Intermittent Jamais ouvert Pas d événement Ouverture Cycle modifications unitaire conformationnelles 6 x à 5 molécules par 2 x10 9 par s par s 200 à par s Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 27

28 Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 28

29 PORES ET CANAUX Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 29

30 HEMOLYSINE L α-hémolysine est sécrétée comme un monomère soluble dans l eau. Sept de ces monomères s associent sur les membranes des cellules cibles (the rim domains ) et forment un pore Le pore permet la fuite des anions et des petites molécules, conduisant finalement à la lyse cellulaire Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 30

31 LA GRAMICIDINE A Les gramicidines forment un groupe de polypeptides (50 acides aminés) extrêmement insolubles dans l eau. La gramicidine se fixent de façon apparemment irréversible aux membranes lipidiques. Ces membranes deviennent alors perméables aux cations monovalents dont le rayon hydraté est inférieur à 0,2 nm, d'où leur nom d'ionophores. Formyl L Val Gly L Ala D Leu L Ala D Val L Val D Val L Trp D Leu L Trp D Leu L Trp D Leu L Trp NHCH2CH2OH Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 31

32 TRANSPORTEUR Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 32

33 CANAL IONIQUE Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 33

34 STRUCTURE CANAL K + voltage dépendant 5 sites de liaison des ions K+ avec 8 atomes d oxygéne par site STRUCTURE CANAL Na + voltage dépendant Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 34

35 JONCTIONS COMMUNICANTES Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 35

36 CAPILLAIRE FENETRE: SECTION TRANSVERSALE Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 36

37 DEPLACEMENTS ELEMENTAIRES TRANSPORTS PASSIFS L énergie nécessaire au transport n est pas fournie par un mécanisme membranaire I. Diffusion des solutés II. Diffusion du solvant III. Migration des solutés Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 37

38 Quelques questions 1. Le flux diffusif d un soluté dans une membrane est toujours conservatif? Oui Non 2. Concernant les solutés suivants, en comparant le transfert convectif et le transfert diffusif à travers une membrane biologique: La convection privilégie le transfert de l urée La convection privilégie le transfert de l inuline La convection est aussi efficace que la diffusion pour l albumine. 3. Le transfert convectif dans une solution est peu dépendant de la taille du soluté? Oui Non Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 38

39 DEPLACEMENTS MOLECULAIRES DIFFUSION T température Agitation thermique des molécules de solvant et de soluté Pas de force extérieure. Pas de direction favorisée. Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 39

40 FLUX DE MOLECULES PAR MIGRATION g Force appliquée sur la molécule: direction et sens spécifiés. Force gravitationnelle: sédimentation ou centrifugation (attention Ec>>Ep pour les petites molécules en solution) Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 40

41 FLUX DE MOLECULES MIGRATION ELECTROPHORESE cathode anode E Force électrique agissant sur les molécules Gradient de potentiel électrique Energie apportée par le champ électrique Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 41

42 FLUX DE MOLECULES TRANSPORT CONVECTIF Les molécules de soluté sont entraînées par les molécules d eau déplacées. Force appliquée de sens et de direction définis. L énergie nécessaire au flux est apportée de l extérieur. Les aliments sont apportés aux cellules grâce au cœur qui génère le débit sanguin. Si il fallait compter sur la diffusion. Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 42

43 CONVECTION(2) Solvent-drag: entraînement des molécules de solutés par les molécules de solvant qui sont beaucoup plus nombreuses. Si Q est le débit du solvant volumique du solvant et Ci la concentration molale, alors: J Ci = C i.q ConvectionA Il n a que peu d influence de la MM du soluté sur le transport convectif. La vitesse de la molécule est proportionnelle à B.V m. v v v Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 43

44 TRANSPORT PASSIF C La diffusion est liée à la différence de concentration entre les 2 compartiments et à l agitation thermique Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 44

45 U U U du = ds + dv + dn S V N V,N S,N S,V du = TdS pdv + µdn La fonction U de (S, V, N) U énergie interne S entropie Equilibre macroscopique : Thermique V et N Cst Mécanique N et S Cst Osmotique V et S Csr Une fonction qui caractérise un état d équilibre macroscopique est une fonction d état. S, V, N variables d état extensives Température thermodynamique Paramètres intensifs U U T = P = S V V,N S,N U µ = N S,V Potentiel chimique pression Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 45

46 POTENTIEL CHIMIQUE SOLUTÉ (1) Energie Variable intensive («tension») Variable extensive («capacité») Echange d énergie PV P V - P.dV TS T S T.dS = dq E. chimique µ n µ.dn Le potentiel chimique µ i d'un soluté i est la dérivée partielle de l'enthalpie libre (ou énergie libre de Gibbs), par rapport au nombre de moles du soluté. Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 46

47 LES LOIS DE LA DIFFUSION Les pionniers: Thomas Graham (chimiste écossais, ) et Adolf Fick (physiologiste à Zurich, 1855). Par analogie avec la loi d Ohm et la loi de Fourier*, il fut observé que: le transfert de matière par unité de temps est proportionnel à la différence de concentration; et à la surface traversée. * q dt = k. écoulement de la chaleur dx Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 47

48 RESISTANCE AU DEPLACEMENT L étude des déplacements des molécules nécessite d étudier la résistance à leur mouvement qui dépend des interactions intermoléculaires. dv m = F + F dt dv = 0 F = F dt F = f. v F F f [ ] [ ] 1-1 = coefficient de frottement en M. T (kg.s ) Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 48

49 COEFFICIENT DE FRICTION La résistance au déplacement de molécules d un soluté est dépendante de f = coefficient de friction moléculaire dont l unité est [M].[T] -1 (kg.s -1 ) et qui est relié à la force de frottement par la formule: 1 v =.F f Ce coefficient f est relié à la viscosité de la solution. La mobilité mécanique molaire b i est l inverse de N.f qui augmente avec la température et diminue avec la MM du soluté. B i est aussi en kg.s -1 Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 49

50 FRICTION ET VISCOSITE S v + dv F S dv = η dx x v η = F dx. en M. L. T S dv 1 1 [ ] [ ] [ ] 1 Poiseuille (Pl) =1 kg. m -1. s -1 Viscosité de l eau à 20 C = 10-3 Pl = 20 η eau Si la température augmente, la viscosité de l eau diminue et les coefficients de diffusion des solutés augmentent(êta). Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 50

51 VISCOSITE: CAS D UNE SPHERE f = 6. π. η. r Loi de Stokes k.t k.t D = = f 6. π. η. r 1 1 D or M= ρ.v 3 r V 3 donc D dépend de M Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 51

52 DEFINITIONS ET NOTATIONS A. Le flux de particules (atomes, ions, molécules) : Le flux de particules Φ à travers une surface S est le débit des particules qui traversent cette surface par unité de temps. C est une grandeur algébrique dépendant de l orientation de la surface. Pendant un intervalle élémentaire dt, nous aurons donc : dn =Φdt B. Le vecteur densité de courant de particules : En respectant les usages, il s exprime comme avec les relations suivantes : Φ = dn = Φdt j ( m, t ). ds m S m j m t ds m S ( (, ). ) m = C. En pratique J Di = débit molaire dn/dt pour un soluté donné i (en mol/s). dt Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 52

53 PREMIERE LOI DE FICK x J D J D = - D.S.grad(C) J D est le débit molaire diffusif en moles par seconde D : coefficient de diffusion du soluté i (m 2 /s) qui est égal selon la loi d Einstein à: D i = R T b i S : surface de membrane permettant le passage du soluté i R : constante des gaz parfaits (8,32 J.mol -1. K -1 ) et b i : mobilité mécanique molaire du soluté i C en concentration molale* en moles de soluté/masse du solvant. En fait C(x,y,z,t), est une fonction de l espace et du temps; ici les concentrations sont supposées constantes selon les axes y et z. * Liée à la fraction molaire qui intervient dans toutes les équations. Séminaires du CNEBMN 53

54 LA DIFFUSION d un colorant J D = - R.T.b.S. d(c) dt C = concentration molale du soluté i (mmol/kg de solvant) 0 L x Transport du soluté de la région la plus concentrée vers la moins concentrée. Séminaires du CNEBMN 54

55 LOI DE FICK membranes Cette loi s applique aussi bien au solvant qu au soluté. La différence est que le solvant diffuse du compartiment avec la plus faible concentration osmolale vers celui qui a la plus forte concentration, donc dans le sens du gradient d osmolalité. Le flux est supposé conservatif dans la membrane, c est-àdire qu il n y a pas de perte de matière ou de génération de matière lors de la traversée de la membrane (pas d accumulation dans la membrane): Sa divergence est nulle Gradient dj d /dx=donc j d est uniforme dans la membrane donc gradient de concentration uniforme dans la membrane.. Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 55

56 DEUXIEME LOI DE FICK Ci S C(x+h) C(x) h C x x x+h h C t =D. 2 C 2 x x x+h Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 56

57 C x ETAT D EQUILIBRE et ETAT STATIONNAIRE ETAT D EQUILIBRE C = 0 donc J D =0 et = 0 t ETAT STATIONNAIRE C = 0 concentration indépendante du temps t 2 C ceci implique que D. = 0 2 x C donc = Cst et J D = Cst 0 x Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 57

58 Glucose intracapillaire ETAT STATIONNAIRE Glucose extracellulaire Apport alimentaire de glucose C capillaire glucose CO 2 H 2 O Entrée = apport de glucose Glucose intracellulaire C cellulaire glucose Sortie= consommation de glucose Par la cellule Flux d entrée = Flux de sortie Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 58

59 Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 59

60 Molécule Milie u Temp. ( C) M (g/mol) D (cm 2 /s) Hydrogéne Air 0 2 6,11 x 10-1 Hélium Air 3 4 6,24 x 10-1 Oxygéne Air ,78 x 10-1 Benzéne Air ,60 x 10-2 Coefficients de diffusion air-solvant Molécule Milieu Temp. ( C) M (g/mol) D (cm 2 /s) Hydrogéne Eau ,5 x 10-5 Hélium Eau ,28 x 10-5 Oxygéne Eau ,1 x 10-5 Benzéne Eau ,02 x 10-5 Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 60

61 MOLECULES BIOLOGIQUES Molécule Milieu Temp. ( C) M (g/mol) D (cm 2 /s) Urée Eau ,38 x 10-5 Sucrose Eau ,23 x 10-6 Ribonucléase Eau ,19 x 10-6 Hémoglobine Eau ,9 x 10-7 Catalase Eau ,1 x 10-7 Myosine Eau ,16 x 10-7 DNA Eau ,3 x 10-8 Virus mosaïque du tabac Eau ,00 x 10-8 Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 61

62 x 1/2 t 1/2 Exemple 10 nm 100 ns Epaisseur de la membrane cellulaire 1 µm 1 ms «Taille» de la mitochondrie 10 µm 100 ms Rayon d une petite cellule de mammifère 100 µm 10 s Diamètre d une fibre musculaire large 250 µm 1 mn Rayon d un axone géant de calmar Estimations brutes de temps de diffusion pour des organelles, des cellules et des tissus en fonction de Leurs dimensions. (Macey, 1980) t 1/2 = (x 1/2 ) 2 /D Avec D = 10-5 cm 2 /s 1 mm 16,7 mn Demi-épaisseur du muscle sartorius de grenouille 2 mm 1,1 h Demi-épaisseur du cristallin de l oeil 5mm 6,9 h Rayon d un follicule ovarien mature 2cm 4,6 j Epaisseur du myocarde ventriculaire Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 62

63 TRANSPORTS PASSIFS DE SOLUTES L énergie nécessaire au transport n est pas fournie par un mécanisme membranaire Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 63

64 PERMEABILITE A TRAVERS LES MEMBRANES NON SELECTIVES C 1 C C1 > C2 Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 64

65 C1 MEMBRANES NON SELECTIVES ETAT STATIONNAIRE membrane h dc = Cste C(x) = A(x) + B dx à x 0 C(0) = B = C à x = h C(h) = Ah + C = C C2 0 h x Résolution d une équation différentielle mais en connaissant les conditions aux limites. C t ( ) D C = 0 = 0 2 x dc D jd = D j D = (C 1 - C 2) dx h j = P C - C P = D/h en m.s -1 Séminaires du CNEBMN 65

66 membrane α= 2 Solution 1 Solution 2 C 1 α = 1 α = 0,5 C 2 O h x La solution de la deuxième loi de Fick en état stationnaire donne maintenant: α D j = (C - C ) h α c( x ) = (C 2 - C 1). x + αc 1 D 1 2 h P α.d h J = P. S.(C - C ) = D 1 2 Séminaires du CNEBMN 66

67 APPLICATION AU CAPILLAIRE MEMBRANE POREUSE S=2. π.r.l et C=C int C ext m C D. Sp = D. Sp. =. S. C t x S. x Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 67

68 Valeurs de la perméabilité de l'endothélium du muscle squelettique pour trois molécules ainsi que les constantes de diffusion des mêmes molécules dans l'eau à 37 C. SUBSTANCE D(m 2.s -1 ) x (à 37 ) P(m.s -1 ) x 10 8 UREE 19,5 61 GLUCOSE 9 27 RAFFINOSE 6,4 11 Si on compare le rapport des perméabilités de deux molécules différentes vis-à-vis d'une même membrane, on doit s'attendre à ce que ces rapports soient identiques à ceux de leurs constantes de diffusion dans l'eau puisque : P1 D S 1 p S x = P D S x S p 2 Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 68

69 lumière capillaire cellule endothéliale interstitium 1000 nm jonction inter- cellulaire 10 nm Membrane artificielle à larges pores Membrane capillaire Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 69

70 TRANSPORTS DU SOLVANT L OSMOSE: diffusion du solvant LA FILTRATION: Transport convectif du solvant Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 70

71 OSMOSE DEFINITIONS Osmose : Transport de liquide (eau) à travers une membrane secondaire à l existence d un gradient de concentrations (exprimée en activités) de solutés de part et d autre de cette membrane. Pression osmotique : se définit dans un système formé par 2 compartiments, l un contenant de l eau pure et l autre un soluté, séparés par une membrane semiperméable ne laissant pas passer les solutés. C est la pression hydrostatique qui va exactement s opposer au mouvement de l eau vers la solution à travers la membrane idéale semi-perméable. Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 71

72 PRESSION OSMOTIQUE z 1 2 Jv à t 0 Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN

73 OSMOSE DEFINITIONS Solution isoosmotique, hypoosmotique ou hyperosmotique : ces notions s appliquent si nous comparons une solution A par rapport à une solution de référence B, par exemple le plasma. Solution isotonique, hypotonique, hypotonique ou hypertonique : ces notions s appliquent si nous étudions l osmolarité d une solution par rapport à la membrane d une cellule particulière ; les exemples les plus anciens et les plus classiques sont les cellules végétales ou les globules rouges. Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 73

74 TRANSPORT DU SOLVANT piston membrane F m = - grad P F f = - f v P F f v F m F m = - F f Débit moléculaire de l eau: dn/dt = S v = - (k S / f) grad P Débit molaire j c = (1/N) (dn/dt) = - (k S / N f) grad P donc j c = - k S b grad P avec b = 1/Nf = mobilité mécanique molaire j ch2o = - k H2O b H2O S grad P = - k H2O b H2O S (dp/dx) Adapté Thierry PETITCLERC Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 74

75 DIFFUSION OSMOTIQUE DE L EAU j dh2o = - (R T b H2O k H2O S / M 0 ) dc osm dx L eau diffuse dans le sens du gradient osmolaire Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 75

76 TRANSPORT D EAU A TRAVERS UNE MEMBRANE IDEALEMENT SEMI-PERMEABLE ω1 ω2 J = P V. ω V F E ω > ω2 Débit d eau par unité de surface: dimension d une vitesse. J v PFV = RT E π ω 1 ω 2 ω 1 > ω 2 Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 76

77 MESURE DE P F (Intensité de la lumière diffusée) ω2 = ω1 ω1 intracellulaire ω2 extracellulaire ω ω 1 2 ω ω 1 2 Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 77

78 Liposomes ou vésicules chargés avec des colorants dérivés de la fluorescéine. Petites molécules susceptibles d émettre de la fluorescence lorsqu elles sont excités à la longueur d onde convenable. La fluorescence varie en fonction de la concentration en molécules fluorescentes. Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 78

79 Liposomes ou vésicules en présence d une solution hyperosmotique: il en résulte un flux d eau sortant. Les molécules de colorant ne pouvant pas sortir des vésicules et le volume des vésicules diminuant, il en résulte que la concentration en colorant augmente, ce qui se traduit par une diminution de l intensité de la fluorescence en fonction du temps (phénomène appelé extinction de fluorescence). Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 79

80 COEFFICIENTS DE REFLEXION σ est appelé le coefficient de réflexion de la membrane vis-à-vis du soluté. C'est un nombre sans dimension compris entre 0 et 1. Il est égal à 0 en cas de membrane non sélective et égal à 1 en cas de membrane idéalement semi-perméable. Pour une membrane donnée, σ décroît lorsque le rayon de la molécule diminue. Une définition très précise de ce coefficient de réflexion est donnée par le rapport de la pression efficace osmotique divisé par la pression osmotique théorique qui aurait été mesurée avec une membrane idéale semi-perméable donc ne laissant pas passer les molécules de soluté. Dans le cas de pores de rayon a sur une membrane et pour une molécule de rayon r, une formule approchée donne : σ = 1 (1 a/r) 2 Le coefficient de réflexion dépendra aussi des forces de «friction» des molécules du soluté avec les parois des pores membranaires et des interactions avec d autres molécules dans le cas de solutions complexes. Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 80

81 COEFFICIENTS DE REFLEXION Mesure au niveau de divers organes pour quelques molécules. CŒUR POUMONS CERVEAU Nacl 0,09 0,05 - Urée - - 0,44 Glucose - 0,04 - Saccharose 0,17 0,05 0,98 Albumine 0,88 0,40 1,00 Les coefficients de réflexion de l'endothélium capillaire cérébral sont beaucoup plus élevés que ceux des autres membranes capillaires. Ceci est dû à l'étroitesse des pores de la barrière hémato-encéphalique. La barrière hémato-encéphalique peut être considérée comme une membrane semi-perméable vis-à-vis du saccharose alors que l'endothélium capillaire pulmonaire se comporte comme une membrane non sélective. Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 81

82 EXEMPLE DE L EFFET DES SOLUTES V V0 2 1 Effet d une solution isoosmotique d urée 0,3M; l urée pénètre à travers la membrane des globules rouges et se révèle incapable d exercer une pression extracellulaire pour équilibre l osmolarité intracellulaire. t Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 82

83 EXEMPLE DE L EFFET DES SOLUTES V V0 2 1 Effet d une solution isoosmotique contenant urée 0,3M et NaCl 0,08M t Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 83

84 MEMBRANE NON IDEALEMENT SEMI-PERMEABLE z Eau Urée J V Eau J S 1 2 Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 84

85 MEMBRANE REELLE z h Membrane idéalement semi-perméable 0 Membrane réelle t Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 85

86 TRANSPORTS DU SOLVANT L OSMOSE: diffusion du solvant LA FILTRATION: Transport convectif du solvant Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 86

87 LOI DE PROPORTIONALITE AU GRADIENT DE PRESSION Henry Philibert Gaspard Darcy ( ). la Loi de Darcy de l'écoulement en milieu poreux. P Jv = λ x λ conductivité hydraulique du milieu On attribue à Henry Darcy (1803 à 1858) la découverte de la forme moderne du tube de Pitot, il fut le premier chercheur à postuler l'existence d'une couche limite dans l'écoulement d'un fluide, il contribua au développement de l'équation de Darcy-Weisbach pour la résistance de l'écoulement dans un tuyau La loi de Darcy est la pierre angulaire de plusieurs domaines d'étude dont l'hydraulique des eaux souterraines, la physique des sols et le génie pétrolier Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 87

88 LA FILTRATION Transport convectif du solvant Q F = L H.S. P où Q F est le débit volumique L H est le coefficient de perméabilité diffusif, proportionnel à la mobilité mécanique molaire de l eau, à son volume molaire et inversement proportionnelle à l épaisseur de la membrane. Hypothèse de flux conservatif P est la différence de pression hydrostatique Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 88

89 COMMENT MESURER LE COEFFICIENT DE FILTRATION Evaluation du coefficient des Vaisseaux du myocarde Principe: contrôler la pression de perfusion et mesurer les variations de la masse du coeur. Séminaires du CNEBMN 89

90 COEFFICIENT DE FILTRATION DES PAROIS VASCULAIRES Le tableau suivant donne les valeurs du coefficient de filtration pour diverses parois capillaires. Organe PF en cm.s-1 Cerveau 1 x 10-3 Coeur 125 x 10-3 Poumon 45 x 10-3 Glomérule x 10-3 Le coefficient de filtration de l'endothélium capillaire cérébral est très petit comparé à celui de l'endothélium myocardique ou pulmonaire et surtout à celui du glomérule rénal. Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 90

91 TRANSPORT COUPLE D EAU ET DE SOLUTE INDUIT PAR PLUSIEURS FORCES Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 91

92 TRANSPORTS COUPLES Force C V P Flux J i J E JV Particules neutres ou chargées Membranes sélectives ou non. Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 92

93 PREMIER CAS: pas de gradient de Pression P=0 VE J Vosm =P F. σ. π = P F.V E.σ. C RT SECOND CAS: pas de gradient de [c] C=0 ( π = 0) V RT E J Vfilt =P F. P CAS GENERAL J = V P F.V E RT.( P+ σ π ) Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 93

94 TRANSPORTS COUPLES Flux de soluté 1 2 Jv Js J S = JV.(1 σ ) c + PD. C c = c + c convection diffusion V J P..( P π ) n V = F E + σ i RT i= 1 i π = RT C i i Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 94

95 PD C J = P C + J (1 σ ). C S D V JV (1 σ ). C avec J = σ P V C V F e m t = P S C D Membrane imperméable P=0 et σ=1 d où J S =0 Membrane dialysante σ=0 d où J V =0 et J S =P. C Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 95

96 Le transport de soluté à travers la membrane est donc la somme algébrique: du transport par diffusion (P D. C) et du transport des molécules entraînées par le mouvement d'eau que l'on appelle transport convectif. C barré est la concentration moyenne du soluté dans la membrane. J S s'exprime en mol.cm -2.s -1 puisque P D et J V sont en cm.s -1 et la concentration en mol.cm -3. Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 96

97 DIFFUSION DIFFUSION + CONVECTION t 0 t 0 t 1 t 1 t 2 t 2 Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 97

98 L ULTRAFILTRATION Filtration d une solution à travers une membrane sélective. Nécessite un gradient de pression hydrostatique La filtration du solvant est parasitée par la diffusion rétentat J UF = J F - J D en valeur absolue ultrafiltrat Q UF = Q F Q D Flux net résulte du flux de filtration-flux osmotique. Notion de pression efficace de filtration: P- π π Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 98

99 LE PHENOMENE DE STARLING Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 99

100 LE PHENOMENE DE STARLING Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 100

101 Flux net : flux de filtration-flux osmotique Pression efficace de filtration: P- π π Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 101

102 CAUSES DES OEDEMES P V J F E.. V RT ( P ) = σ π prot Les oedémes apparaîtront dans les cas: - la pression hydrostatique capillaire augmente: surchage hydrosodée primitive par excès d apport ou défaut d élimination ou augmentation de la pression veineuse - la pression oncotique diminue - la perméabilité capillaire augmente Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 102

103 OEDEME AIGU PULMONAIRE et CEREBRAL Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 103

104 APPLICATIONS RENALES Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 104

105 L UNITE FONCTIONNELLE LE NEPHRON Capsule de Bowman Tubule contourné proximal Artériole glomérulaire efférente Artériole glomérulaire afférente Glomérule Capillaires péritubulaires Tubule contourné distal ComposanteVASCULAIRE Composante TUBULAIRE Veine rénale Tubule collecteur Anse de Henlé Branche descendante Branche ascendante Vasa recta Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 105

106 Pédicelle de podocyte Corps du podocyte LE GLOMERULE RENAL Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 106

107 LA FILTRATION GLOMERULAIRE Artériole glomérulaire efférente Artériole glomérulaire afférente Lumière de la capsule Prolongements des podocytes Fente de filtration Pédicelles Corps du podocyte Capillaires glomérulaires recouverts de podocytes Tubule contourné proximal Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 107

108 LE GLOMERULE RENAL P Débit sanguin rénal et débit de filtration glomérulaire π Pc= 50 mm Hg SANG Π= 25 mm Hg Paris, le 7 décembre 2009 Pc= 15 mm Hg Filtrat glomérulaire PF VE J V =. π RT Séminaires du CNEBMN ( P P ) cap glom prot 108

109 PHYSIOLOGIE DU NEPHRON Eau et solutés Filtration Absorption (eau et solutés) Sécrétion Capillaires sanguins Le contrôle de la filtration glomérulaire. PF VE Jv. S =. S. P RT J. Sց si une des conditions suivantes: v Pց ou Sց ou Pց F Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 109

110 VALEURS DE DEBIT INTRA-RENAUX environ 1 million de néphrons par rein Débit sanguin rénal (DSR). environ 20 % du débit cardiaque...# 1-1,2 L/min. 90 % dédié au cortex Débit plasmatique rénal (DPR). DPR = DSR (1 - Ht)...# ml/min Débit de filtration glomérulaire (DFG). environ 20 % du DPR (fraction de filtration)...# ml/min Débit tubulaire rénal (DTR). Débit d urine primitive (DFG)....# 180 L/24 h. Débit à la sortie du néphron proximal (VEC, bilan sodé)... # 15 L/24 h. Débit à la sortie du néphron distal (gradient cortico-médul., ADH)..# 1-2 L/24 h Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 110

111 LES FONCTIONS ELEMENTAIRES DU REIN FILTRATION: transfert du capillaire glomérulaire dans la chambre glomérulaire, puis dans le tube contourné proximal SECRETION: transfert du capillaire péri-tubulaire dans la cellule tubulaire, puis de la cellule dans l urine REABSORPTION: transfert du fluide tubulaire dans la cellule tubulaire, puis de la cellule dans le capillaire péri-tubulaire EXCRETION: somme algébrique de ces transferts filtration + sécrétion - réabsorption = excrétion Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 111

112 CLAIRANCE: QUELQUES DEFINITIONS Clairance pulmonaire, biliaire, rénale, débit d élimination (ml/min) d une substance présente dans le sang par le poumon, le système hépato-biliaire ou le rein, Clairance urinaire (rénale): détermination de la clairance rénale d une substance excrétée par le rein au moyen des recueils urinaires et de prélèvements sanguins minutés Clairance plasmatique (rénale): détermination de la clairance rénale d une substance excrétée par le rein (et uniquement par le rein*) au moyen des seuls prélèvements sanguins * La quantité qui disparaît du sang apparaît en totalité dans l urine Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 112

113 L EQUILIBRE DE DONNAN GIBBS Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 113

114 MEMBRANE PLASMIQUE Importance des constantes de diffusion et de leur rapport entre anions et cations Rappel sur D D D Cl D = - + kt f Na 10 nm d épaisseur Capacité de 10-6 F par cm 2 DDP de 100 mv La charge Q =CV est de 10-7 coulombs soit environ moles d ions par cm 2 Mais le champ électrique est de volt par cm (DDP/h) Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 114

115 MEMBRANES NON CHARGEES SELECTIVES Na + R z- ou R Cl - Protéine non dissociée avec une osmolalité donnée: -pression osmotique entre les 2 compartiments - mais pas de DDP 1 2 Protéine dissociée exemple protéinate de sodium: - Effet Donnan Gibbs - et pression osmotique C1 < C2 Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 115

116 EFFET DONNAN GIBBS Na + R z- Cl - Equilibre Electroneutralité des solutions: R z-, zna + Rz- et zna C1 < C2 zr z- + Cl - = Na + dans le compartiment 1 Cl - = Na + dans le compartiment 2 Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 116

117 µ = µ NaCl1 NaCl 2 CALCUL DES CONCENTRATIONS A L EQUILIBRE DE DONNAN d) Le travail nécessaire pour amener de l'infini au point x une mole de soluté i portant z i charges positives ou négatives est donc la somme du potentiel chimique et du potentiel électrique, c est le potentiel électrochimique. ~ µ = µ + z FV i i i e) La condition d'équilibre entre les deux phases 1 et 2 s'écrit pour l'entité neutre NaCl : µ µ = NaCl1 NaCl 2 Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 117

118 µ = µ ~ + µ ~ NaCl 1 Na NaCl 2 Cl CALCUL DES CONCENTRATIONS A L EQUILIBRE DE DONNAN f) L électrolyte se dissocie en ions sodium et chlore: + NaCl Na + Cl µ = µ ɶ + µ ɶ NaCl Na Cl g) Il faut donc considérer le potentiel électrochimique : µ NaCl = µ Na + FV + µ Cl FV µ = µ ~ + µ ~ = µ + µ NaCl Na Cl Na Cl 0 0 NaCl Na Cl 0 0 Na Cl NaCl 0 [ ] RTLn [ Cl] µ = µ + RTLn Na + µ + µ + µ = µ [ ] [ ] ( ) µ NaCl = µ NaCl + RTLn Na. Cl Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 118

119 µ = µ ~ + µ ~ NaCl 1 Na NaCl 2 Cl CALCUL DES CONCENTRATIONS A L EQUILIBRE DE DONNAN µ = µ + [ ] [ ] ( ) 0 NaCl NaCl RTLn Na. Cl h) Ce qui permet de conclure que : la relation de Donnan : Na Cl = Na Cl [ ] [ ] [ ] [ ] Cette relation est une condition supplémentaire qui s'ajoute à la condition d'électroneutralité : [ ] [ ] et [ ] [ ] + = = z z R Cl Na Cl Na Pourquoi? Ln est une fonction monotone strictement croissante Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 119

120 EFFET DONNAN GIBBS Les points clés L ion protéique non diffusible est: - responsable de l apparition de la différence de potentiel transmembranaire; - impose son signe dans le compartiment où il se trouve présent; -Si la protéine est présente dans les deux compartiments, l ion impose son signe dans le compartiment avec la plus forte concentration; - le cation associé subit l influence du gradient de potentiel. Formules valables pour des concentrations molales. Cas des ions multivalents. Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 120

121 L UNITE FONCTIONNELLE LE NEPHRON Capsule de Bowman Tubule contourné proximal Artériole glomérulaire efférente Artériole glomérulaire afférente Glomérule Capillaires péritubulaires Tubule contourné distal ComposanteVASCULAIRE Composante TUBULAIRE Veine rénale Tubule collecteur Anse de Henlé Branche descendante Branche ascendante Vasa recta Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 121

122 EQUILIBRE DE DONNAN Glomérule rénal La filtration glomérulaire est un processus d ultrafiltration qui ne laisse passer que les molécules diffusibles, les molécules non diffusibles, comme les protéines, ne franchissent pas les membranes Concentration plasmatique (mmol/l) Filtrat glomérulaire (mmol/l) Cl Na Il fait apparaître une inégalité de distribution du Cl - et de Na + de part et d autre de la membrane glomérulaire. Paris, le 7 décembre 2009 Séminaires du CNEBMN 122