Diagnostic biologique dans les pays en voie de développement Utilisation des tests rapides

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1 Diagnostic biologique dans les pays en voie de développement Utilisation des tests rapides 1

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3 Test de diagnostic rapide idéal - Facilité d emploi - Facilité d interprétation - Stabilité dans des conditions tropicalisées - Pas de traitement de l échantillon (sang total) - Nécessite pas d équipement - Résultat en un temps < 30 minutes - Bonnes Performances - Coût faible 3

4 Quels sont les tests qui répondent le mieux à ces critères? Tests sur bandelettes (détection analyte par réaction biochimique ex : ++++ recherche de sucre dans les urines) Tests sur bandelettes basés sur le principe de l immunochromatographie (ICT) +++ ou latéral Flow Tests d agglutination (particules de latex) ++ Microscopie + ELISA microplaque + 4

5 ICT tests procedure T C HBsAg Sample Sample HBsAg Test Contrôle Conjugate sample pad particle (colloidal gold) ) or latex anti Hbs conjugate Pad goat anti HBs goat anti Mouse IgG absorbent Pad nitrocellulose membrane 5

6 Cassette and Dipstick tests procedure HbSAg add a strip add sample C T HbSAg HbSAg Wait min cassette dipstick negative positive 6

7 Rapid Diagnostic : Worldwide Rapid diagnostic 1 2 Developing Countries Developed Countries 7

8 Rapid Rapid diagnostic DiagnosticOTC 1 Central Labs OTC 2 Pharmacy Point Of Care Emergency POL Community Clinic 8

9 HIV 38 million d individus infectés 4,8 millions de nouveaux cas par an 2,9 millions de morts par an 9

10 HIV : outils de diagnostic tests de dépistage Tests ELISA 3ème ou 4ème génération adaptés pour les grandes séries coût/test < 1 Tests rapides Flow through Immunochromatographiques très adaptés au dépistage sur le terrain Il existe de nombreux tests de qualités inégales, préconiser tests de 3ème génération, il n existe pas de test 4ème génération en format ICT. 10

11 Test rapide pour la détection qualitative Des anticorps anti HIV-1, anti HIV-2 dans le sérum humain, Plasma, sang total ou sang capillaire 11

12 Facile à réaliser : lecture au bout de 15 à 30 minutes 1-prélèvement 3-lectur Negative Negative Positive 15 min 12

13 Test se réalisant à côté du patient Formation minimum Pas de centrifugation avec sang capillaire Temps pour obtenir résultat : 15min Test 3ème génération marquage CE Prix abordable 13

14 Surveillance biologique de l infection HIV Numération lymphocyte CD4 Mesure charge virale : - tests quantitatifs faisant appel à des outils de biologie moléculaire : onéreux, nécessitent labos spécialisés, aide ONG - test immuno : dosage Ag P24 après dissociation immuns complexes : à valider, technologie plus simple et moins onéreuse que méthode de biologie moléculaire 14

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16 Mycobacterium tuberculosis un tiers de l humanité 3 millions de morts/an 8 millions de nouveaux cas/an 12 millions de nouveaux cas en

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19 Diagnostic de la tuberculose (suite) Examen direct microscopique Sensibilité : 17-60% Spécificité : 90% (Problème avec espèces autres que M.tuberculosis) pas adapté pour tuberculose extra pulmonaire faible sensibilité HIV/TB coinfecté besoin de collecter 3 échantillons 2 jours de suite (pas fait dans 50% des cas) 19

20 Diagnostic de la tuberculose (suite) Culture pour isolement et identification (méthode de référence) Milieu solide Délai de réponse : 3 à 8 semaines Milieu liquide Délai de réponse 1 à 8 semaines Sensibilité : 30 to 70% Spécificité : % 20

21 Diagnostic de la tuberculose (suite) Méthodes de biologie moléculaire - Réponse en 3 à 4 heures - Sensibilité 70 à 80%/culture - Coût élevé - Nécessite laboratoire spécialisé - possibilité de détecter rapidement résistance à rifampicine 21

22 Diagnostic de la tuberculose (suite) Tests immunologiques : Basé sur réponser cellullaire T : détecte d TB latente et active TB gold Quantiferron (Cellestis), T-Spot.TB T (Oxford Immunotec) Basé sur réponse r cellulaire B : détecte d TB active? tests sérologiques Un besoin urgent de développer d des nouveaux outils de diagnostic de la tuberculose 22

23 Potential Rapid tests for TB B cell-mediated responses With ELISA test Ideally simple (1 sample) cheap, Using mostly purified or recombinant protein Antigen, But usually very low reactivity of sera from patients with paucibacillary TB : extra pulmonary or in children HIV + patients Alternative: the use of T-cell independent antigens for ELISA, the cell-wall glycolipid antigens TB patients Ratanasuwan Mycodot (LAM) Boggian Mycodot (LAM) Somi Mycodot (LAM) Barrera Mycodot (LAM) Poultier A60 Daniel 30KDa Sensitivity HIV- HIV+ 63% 40% NT 12% 41% 3-16% 50% 5-36% 69.2% 36.5% 62% 28% 23

24 Priorité concernant le développement de nouveaux tests de diagnostic Améliorer diagnostic des tuberculoses pulmonaires: ex : test rapide pour remplacer la microscopie (développement en cours) Améliorer diagnostic coinfection HIV/TB: marqueur immunologique Améliorer diagnostic TB chez les enfants Adresser problème des souches multirésistantes 24

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30 Malaria 30

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35 Tests de diagnostic rapide du paludisme caractéristiques souhaitées Capable de détecter 100 parasites/µl possibilité de mesure semi quantitative : suivi efficacité du traitement résultats comparable à goutte épaisse 3 types Ag détectés : - phrp2 (P. falciparum) - pldh (P. falciparum, P. vivax) -Aldolase Stabilité à des températures élevées (40 C) 35

36 Méningites 36

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39 CSF CHUSS Gram Stain cytology Ag detection PCR Culture If delay < 2 h Identification Antibiogram test Immediate feedback to clinicians Feedback to clinicians within 3 days Quality Control CHUYO Weekly reporting to MoH authorities and WHO Nm and Sp : - Serotyping - Genotyping Data used for decision making Pharo Marseille Hospital R. Picqué Bordeaux 39

40 Neisseria meningitidis II Morphologie Diplocoques à Gram négatif 40

41 Diagnostic des méningites par test d agglutination de particules de latex 41

42 Principales bactéries détectées par les tests d agglutination de particules de latex Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae type b Neisseria meningitidis group A, B, C, Y and W135 E. Coli K1* }new-born meningitis Streptococcus B } Réaction croisée entre Ag de méningoccoque du group B et E. Coli K 42

43 Echantillons pouvant être utilisé pour la détection des Ag bactériens par un test d agglutina ntion de particules delatex Liquide céphalorachidien (LCR) permet la détection rapide des Ag polysaccharidique bactérien Sérum Urine Souches bactériennes isolées sur boîte de pétri 43

44 Principe d un test d agglutination de particules de Ag bactérien Anticorps spécifiques d Ag polysaccharidique Bille de latex (= particules depolystyrene) 44

45 Équipement minimum nécessaire Pipette de précision Microtube type eppendorf Bain d eau bouillante Mini centrifugeuse 45

46 Traitement de l échantillon LCR Les échantillons doivent être transporté le plus rapidement possible au Les méningocoques sont très sensible à la température Traitement du LCR - Chauffer pendant quelques minutes à 100 C (nécessaire pour dénaturer certaine protéines et éviter des réactions croisées) - Centrifuger et réaliser le test d agglutination 46

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49 Limites Absence d'agglutination n exclu pas une méningite bactérienne (concentration en Ag < limite de détection du test Possibilité de réaction croisée Cette technique ne devrait pas remplacer la culture Les réactifs doivent être stocké à 2-8 C 49

50 Avantages Diagnostic rapide réponse en moins de 10 minute Demande un équipement simple Peut être réalisé par du personnel non qualifié en laboratoire Identification du sérogroupe information indispensable pou mise en place d une stratégie vaccinale Coût abordable 50

51 Objectifs futures Développer un test de diagnostic rapide des méningites sur bandelette 51

52 laboratory Outside view 52

53 Mobile laboratory Inside view 53

54 Les virus des fièvres hémorragiques Fièvre jaune Dengue Marburg, Ebola, Lassa Hantaan (aussi dans pays tempérés) Machupo (Bolivie), Rift,... 54

55 Dengue Zone urbaine : réservoir homme Aedes aegypti Asie Sud Est, Inde, Afrique Amérique du Sud Amérique Centrale Océanie (îles) Caraïbes (Cuba) 55

56 Histoire : première épidémie à Philadelphie -XVIII et XIX siècle : la dengue gagne les principaux ports d Amérique : épidémie d ATHENES (1200 morts) : isolation des sérotypes 1 et 2 (Sabin) : épidémie de dengue hémorragique aux Philippines : épidémie de CUBA ( cas déclarés : DHF et 158 décès) 56

57 Dengue 100 millions de personnes infectées hospitalisées morts après paludisme, principale cause état fébrile après retour pays tropicaux 57

58 Dengue : distribution dans le monde 58

59 Une maladie émergente : une priorité pour l OMS Plus de 2 milliards de personnes exposées Augmentation de l incidence Augmentation de la sévérité des cas Entre et décès par an Une maladie du voyageur au retour des tropiques 59

60 La dengue est une ARBOVIROSE Virus de la dengue : ARN négatif, enveloppé 4 sérotypes (DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4) nombreux génotypes au sein d un même sérotype immunité spécifique de type, pas de protection croisée Dengue primaire, secondaire, multiple 60

61 Le moustique vecteur : Aedes Ae. aegypti, albopictus, pseudoscutelaris, polynesiensis, etc. Diurne Citadin (Ae. aegypti) ou rural (Ae. albopictus) Ubiquitaire Œufs résistent à la dessiccation, adultes résistent aux insecticides Lutte antivectorielle extrêmement difficile 61

62 En Amérique

63 Le réservoir de virus Cycle selvatique de la dengue : en Asie et en Afrique Les mammifères L homme malade Un vaccin efficace ne pourra jamais éradiquer la dengue 63

64 Clinique Incubation : entre 2 et 12 jours Formes cliniques Asymptomatiques Bénignes diagnostic différentiel difficile : grippe, rougeole, rubéole, diarrhée infectieuse Sévères mortelles dans 1 à 5% des cas suivant les épidémies débutent comme des cas bénins 64

65 Aspects cliniques et diagnostics utiles Période fébrile : pseudo-grippale de 3 à 4 jours Période post fébrile : période à risque choc, épanchement séreux hépatite complications neurologiques 65

66 J J4 Complications sévères : Choc hypovolémique hépatite encéphalite aplasie - surinfections Hyperthermie arthralgies petits saignements rash cutané Douleur abdominale trouble de conscience patraquerie pâleur leucopénie thrombopénie Guérison : mieux être 66

67 J0 virémie J4 J5 AC : IgM IgG PCR Culture virale? Test ELISA IHA 67

68 Traitement 2 candidats vaccins tétravalents atténués : en cours Pas de traitement spécifique La lutte antivectorielle est le seul moyen de prévention existant Une prise en charge précoce des cas sévères permet de réduire considérablement la létalité 68

69 LES MALADIES DIARRHEIQUES 3,3-6 millions d'enfants - choléra - dysenterie - typhoïde - rotavirus,,... 69

70 (enteropathogenic E. coli) (enterotoxigenic E. coli) 70

71 Les Rotavirus Traitement symptomatique Réhydratation par voie orale ou veineuse Pas de chimiothérapie spécifique 71

72 VIKIA Rota-Adeno Design Sample Pad Nitrocellulose Absorbent Pad Plastic backing Conjugate Pad monoclonal anti - Adeno Ab (red latex) - Rota Ab (blue latex) Test line 1 Monoclonal anti Adeno Ab Test line 2 Monoclonal anti Rota Ab Control line Sheep Anti mouse Ab 72

73 Vaccin commercialisé 73

74 Recommandation concernant l utilisation des tests de diagnostic rapide dans les pays en voie de développement Favoriser l utilisation de produits : - utilisés sur le marché européen dont les performances ont été largement évaluées par des experts - conditionnement en emballage unitaire (meilleur stabilité) - demandant minimum d étape pour le traitement de l échantillon - facilité d utilisation, ex: préférer format lateral flow à flow through Tenir compte du contexte épidémiologique de la région dans laquelle le test sera utilisé (ex : test malaria) Coût du test 74