Test ELISA Anticorps Anti-Ribosomal P

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1 Test ELISA Anticorps Anti-Ribosomal P IVD ENCART DU PRODUIT REF ELISA Anticorps Anti-Ribosomal P USAGE PREVU Test ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) pour la détection et la quantification des anticorps antiribosomal P dans le sérum humain. GENERALITES Le lupus érythémateux systémique (SLE) est une maladie auto-immune à multiples facettes caractérisée par la présence d une variété d auto-anticorps en circulation 1,2. Des manifestations du système nerveux central (CNS) se produisent chez de nombreux patients atteints de SLE 3 ainsi que des comportements anormaux ressemblant à la schizophrénie 4. Cependant, il n y pas de test unique disponible pour un usage diagnostique, qui puisse détecter les manifestations de CNS du lupus avec une sensibilité et spécificité suffisante. Bluestein et al 5 ont démontré une association entre le lupus cérébral et les anticorps cytotoxiques dans le liquide cérébrospinal le long de la ligne de cellules neuroblastiques. Chez les patients avec SLE psychotique, un groupe d auto-anticorps est ciblé contre les phosphoprotéines ribosomales appelées Po (38kD), P1 (19kD), et P2 (17kD) 6. Avant le développement des épisodes psychotiques chez ces patients, il y a une augmentation sélective des anticorps anti-ribosomal P 7. Les anticorps anti-ribosomal P en circulation sont détectables chez environ 90% des patients atteints de psychose SLE par les techniques de Western blot et RIA 7. Les sérums de SLE contenant des anticorps anti-ribosomal P de façon invariable montre une forte immunofluorescence cytoplasmique sur les HeLa fixés ou les cellules HEp-2 et le tissu de foie de souris à cause de la distribution des ribosomes et du cytoplasme de ces protéines. Il existe des rapports d auto-anticorps agissant directement contre les protéines ribosomales P exprimées sur la surface de la cellule. Les auto-anticorps dirigés contre la membrane ou les isoformes des cellules de surface ont été impliqués dans des mécanismes pathologiques directs du SLE psychotique 8. De plus, il a été démontré que les auto-anticorps anti-ribosomal P coexistent habituellement avec les anticorps anti-rrna qui sont ciblés contre le rrna 28S situé dans le centre ribosomal GTPase 9. Ceci suggère que les deux auto-anticorps anti-ribosomal P et anti-rrna peuvent contribuer à la pathogenèse du CNS dans le SLE 10. PRINCIPES DU TEST Le test ELISA est réalisé sur phase solide. Les micro-puits sont recouverts avec l antigène purifié Ribosomal P. Les contrôles, les étalons et les sérums de patients dilués sont ajoutés dans différents puits, autorisant chaque anticorps présent à se lier à l antigène ribosomal P. Les anticorps non liés et les autres protéines du sérum sont éliminés par lavage des micro-puits. Les anticorps liés sont incubés avec une enzyme marquée au conjugué anti-igg humaines. Le conjugué non lié est éliminé par lavage. L activité enzymatique résiduelle est quantifiée grâce à l addition d un substrat enzymatique (pnpp) suivie d une étape de mesure de l intensité de la coloration ainsi développée. Après avoir arrêté la production enzymatique de produit coloré, la présence ou l absence d anticorps spécifiques sera déterminée par lecture au spectrophotomètre à 405 nm. Les résultats sont exprimés en unités ELISA par millilitres (EU/ml). REACTIFS Conservation et Préparation Conserver tous les réactifs du coffret entre 2 et 8 C. Ne pas congeler. Ne pas employer le réactif si il est trouble ou si un précipité s est formé. Tous les réactifs doivent être portés à la température ambiante (20-25 C) avant 30

2 de les utiliser. Le tampon de lavage est stable jusqu à la date limite d utilisation s il est conservé entre 2 et 8 C. Reconstituer le tampon de lavage en y ajoutant de l eau distillée ou déionisée pour un volume de 1 L. Les micropuits ne peuvent être utilisés qu une seule fois. Précautions Pour Usage Diagnostic in vitro. Le matériel d origine humaine utilisé a été testé en respectant les recommandations de la FDA et sont négatifs aux virus de l hépatite B (Ag HBs), aux anticorps dirigés contre le virus de l hépatite C (anti-hcv) et aux anticorps dirigés contre les virus de l immunodéficience humaine (anti-vih1, anti-vih2 et HTLV-I). Du fait qu aucune méthode de test connue ne peut offrir une garantie absolue de l absence d agents infectieux, considérer les réactifs ainsi que tous les échantillons de patients comme potentiellement infectieux et les manipuler avec les précautions d usage 17. ATTENTION - Certains réactifs contiennent de l azide de sodium (NaN 3 ). Ce composé peut former dans les canalisations en plomb ou en cuivre des azotures métalliques hautement explosifs. Afin d éviter la formation et l accumulation de tels azotures dans les canalisations, rincer l évier à grande eau lors de l élimination de ces réactifs. L azide de sodium est toxique en cas d ingestion. En cas d ingestion, informer immédiatement le responsable du laboratoire et contacter le centre antipoison. La qualité des résultats est dépendante du respect des instructions figurant dans la présente notice. Ne pas échanger des réactifs du kit par d autres provenant d autres fabricants. Ne pas utiliser au-delà de la date de péremption. Respecter les techniques de laboratoire réduisant au minimum la contamination microbienne et chimique. Ne pas employer après la date d échéance. Matériel fourni Menarini ELISA Anticorps Anti-Ribosomal P REF Les kits contiennent les réactifs suffisants pour effectuer 96 tests chacun. 12 x 8 MICROPLATE RIB P Micro-lamelles prêtes à l emploi avec micro-puits individuels recouverts d antigène Ribosomal P. 1 x 1.5 ml CONTROL + RIB P * Contrôle Positif (capuchon rouge), prêt à l emploi. Contient du sérum humain positif aux anticorps anti-ribosomal P. La gamme de concentration attendue en EU/ml est imprimée sur l étiquette. 1 x 1.5 ml CONTROL - * Contrôle Négatif (capuchon blanc). Contient du sérum humain. 1 x 1.5 ml CALIBRATOR A RIB P * Etalon A (capuchon vert), prêt à l emploi. Sérum humain contenant l antigène aux anticorps contre Ribosomal P. 1 x 1.5 ml CALIBRATOR B RIB P * Etalon B (capuchon violet), prêt à l emploi. Sérum humain contenant l antigène aux anticorps contre Ribosomal P. 1 x 1.5 ml CALIBRATOR C RIB P * Etalon C (capuchon bleu), prêt à l emploi. Sérum humain contenant l antigène aux anticorps contre Ribosomal P. 1 x 1.5 ml CALIBRATOR D RIB P * Etalon D (capuchon jaune), prêt à l emploi. Sérum humain contenant l antigène aux anticorps contre Ribosomal P. 1 x 12 ml IgG-CONJ ALKPHOS * Conjugué Phos. Alc. anti- IgG humaines, prêt à l emploi. Code couleur rose. 2 x 60 ml DIL * Diluant sérum, prêt à l emploi. Code couleur bleu. 31

3 1 x 12 ml SUBSTRATE * Substrat enzymatique, prêt à l emploi. Contient du pnpp. Protéger de la lumière. 1 x 12 ml STOP Solution d arrêt prête à l emploi. 2 vials BUF WASH Tampon de lavage en poudre. Reconstituer pour 1 litre/flacon. * Contient < 0.1% NaN 3 Symboles utilisés sur les étiquettes: Numéro de lot Numéro de référence catalogue A utiliser avant Température de conservation Lire les instructions d utilisation Pour usage diagnostique In vitro Fabricant Nombre de tests Matériel nécessaire mais non fourni Eau distillée ou déionisée Bouteille pour le tampon de lavage Pipettes de 5 à 1000 μl Bouts de pipette jetables Petits tubes 12 X 75 mm et porte-tubes Timer Papier absorbant Lecteur ELISA avec filtre de 405nm. Si la longueur d onde double est disponible, le filtre de référence sera de nm. Bac pour le lavage automatique capable de dispenser 300 μl PRELEVEMENT ET PREPARATION DES ECHANTILLONS Utiliser uniquement du sérum pour réaliser ces tests. Il est recommandé de ne pas utiliser de sérums fortement hémolysés, lipémiques ou sujets à une contamination bactérienne car cela peut provoquer des interférences et modifier les performances du test. Conserver les sérums entre 2 et 8 C pendant maximum une semaine. Pour une conservation plus longue, congeler les sérums à -20 C. Eviter les congélations/décongélations successives des sérums. METHODE Préparation du test Lire ces instructions attentivement avant de commencer l analyse. Remettre immédiatement les micro-lamelles non utilisées dans le récipient contenant le dessiccateur, refermer hermétiquement pour minimiser toute exposition à l humidité. Replacer immédiatement le récipient au réfrigérateur

4 Laisser le substrat enzymatique s équilibrer à la température de la pièce avant utilisation. Replacer les produits au réfrigérateur immédiatement après l utilisation. Préparer toutes les dilutions des échantillons patients avant de commencer le test. Préparer le tampon salin et équilibrer sa température entre 2 et 8 C. Le tampon salin ne peut être préparé juste avant de réaliser le test. Il est important d utiliser une bonne technique de lavage. Si l opération est réalisée manuellement, diriger un jet puissant de vapeur de tampon de lavage froid à l aide d une large bouteille sur toute la superficie de la micro-lamelle. Il est recommandé d utiliser un bac de lavage des micro-lamelles automatique Utiliser une pipette multicanaux capable de remplir 8 puits simultanément. Ceci rend le processus plus rapide et fournit un temps d incubation plus uniforme. La synchronisation est importante. Les périodes d incubation commencent après la distribution des réactifs. L ajout de tous les échantillons et réactifs doit être réalisé à la même cadence et selon la même séquence. Enlever la quantité nécessaire de bandelettes de micro-puits du récipient et le refermer soigneusement pour prévenir la condensation sur les puits non utilisés. Replacer le récipient immédiatement au réfrigérateur. Exécution du test Etape 1 Etape 2 Etape 3 Laisser tous les réactifs et les échantillons s équilibrer à température ambiante. Indiquer sur une feuille du protocole la position des échantillons sur la micro-lamelle. Il est de bonne pratique de vérifier les échantillons en double. Pour une détermination qualitative, utiliser uniquement l Etalon D prêt à l emploi (flacon avec le capuchon jaune). ou Pour une détermination semi-quantitative, utiliser les Etalons A à D tels que décrits dans l exemple d échantillon ci-dessous. Détermination qualitative Détermination semi-quantitative Etape 4 Etape 5 Etape 6 Etape 7 Préparer une dilution 1:201 des échantillons patients en mélangeant 5 µl de sérum de patient avec 1.0 ml de diluant sérum. Prélever les micro-puits nécessaires du récipient et replacer les bandelettes non utilisées dans le récipient fermé au réfrigérateur. Placer les micro-puits sur le support fourni. Pipeter 100 µl d Etalon prêt à l emploi, de contrôles Positif et Négatif et de sérum patient dilué dans les micro-puits tel que décrit dans le protocole. Note: Inclure un puit avec 100 μl de diluant sérum comme blanco de réactif. La lecture ELISA de ce blanco devrait être nulle. Incuber 30 minutes (± 5 min) à température ambiante. 33

5 Etape 8 Etape 9 Etape 10 Laver 4x avec le tampon de lavage. Pour le lavage manuel, remplir chaque micro-puits avec du tampon de lavage reconstitué. Eliminer le liquide en retournant et en tapotant pour que le contenu de chaque puit sorte ou aspirer le liquide de chaque puit. Après le dernier lavage, retourner la plaque et la tapoter sur du papier absorbant pour enlever tout liquide de lavage résiduel. Pour le lavage automatique, programmer la machine selon les recommandations du fabricant. Pipeter 100 µl de conjugué dans les micro-puits. Incuber 30 minutes (± 5 min) à température ambiante. Etape 11 Laver tous les micro-puits comme à l étape 8. Etape 12 Etape 13 Etape 14 Etape 15 Contrôle qualité Pipeter 100 µl de substrat enzyme dans chaque micro-puit dans le même ordre et timing que pour le conjugué. Incuber 30 minutes (± 5 min) à température ambiante. Pipeter 100 µl de solution d arrêt dans chaque micro-puit en utilisant dans le même ordre et timing que pour l addition du substrat enzyme. Lire les valeurs d absorbance dans l heure suivant l addition de solution d arrêt. Lire l absorbance de chaque puit à 405nm en utilisant un lecteur simple ou à longueur d onde double 405/630nm en prenant le blanco de réactif comme référence d absorbance nulle. Les étalons, les contrôles positifs et négatifs et un blanc doivent être présents dans chaque série de test pour garantir l intégrité et la précision de ce dernier. La lecture d absorbance du blanco doit être inférieure à 0.3. L étalon A doit avoir une lecture d absorbance supérieure à 1.0, sinon le test doit être répété. Le contrôle négatif doit être inférieur à 20 EU/ml. Si le test est réalisé en double, prendre la moyenne des deux lectures pour déterminer EU/ml. Lors des déterminations qualitatives, la densité optique de l étalon D doit être plus grande que celle du contrôle négatif et plus petite que celle du contrôle positif. Pour les déterminations semi-quantitatives, le contrôle positif doit donner des valeurs dans les fourchettes figurant sur le flacon. RESULTATS Calculs Les concentrations des échantillons patients peuvent être déterminées par l une ou l autre de ces deux méthodes: 1. Determination Qualitative Abs. de l Echantillon X EU/ml de l Etalon D = EU/ml Echantillon Abs. de l Etalon D 2. Determination Semi-quantitative Tracer l absorbance des étalons A à D par rapport à leur concentration respective sur un graphique linéaire. Tracer la concentration en EU / ml sur l axe des X et l absorbance sur l axe Y et dessiner la courbe la plus proche. Déterminer les concentrations des échantillons patients provenant de la courbe par leurs valeurs correspondantes d absorbance. 34

6 Anti-RPP Menarini ImmuLisa Courbe Standard standard Curve 2 405/630nm Anti-RPP ImmuLisa Calibrators (EU/ml) Anti-RPP Menarini E talons Etalons Les étalons sont fournis pour une détermination semi-quantitative et doivent être employés lors de chaque test. Les échantillons patients contenant les niveaux les plus élevés d anticorps peuvent donner des valeurs d absorbance plus grandes que celles de l étalon A. Pour la détermination des valeurs semi-quantitatives précises de tels sérums, il faut les diluer et les retester jusqu à ce que les résultats puissent être lus sur la courbe d étalonnage. Pour la détermination en EU / ml, multiplier les unités obtenues par le facteur de dilution. Interprétation L information suivante sert seulement de guide dans l interprétation des résultats de laboratoire. Les valeurs présentées ci-dessous ont été déterminées en testant 61 donneurs de sang sains et représentent la moyenne des sains plus 3SD. Chaque laboratoire doit déterminer ses propres valeurs normales. valeurs Anti-Ribosomal P Interprétation <20 EU/ml Négative EU/ml Indéterminée (Limite) >25 EU/ml Positive LIMITATIONS D UTILISATION Les résultats obtenus servent seulement d aide dans le diagnostic et ne devraient pas être interprétés en tant que diagnostic à part entière. VALEURS ATTENDUES Les valeurs attendues dans une population normale sont négatives. Les auto-anticorps Anti-Ribosomal P sont particulièrement observés chez les patients atteints de SLE avec des manifestations de CNS. Des niveaux significatifs d auto-anticorps anti-ribosomal P ont été observés chez des patients avec lupus psychotique, sclérodermie et recouvrement SLE, et dépression. Un très faible pourcentage de patients sans manifestation CNS présente des anticorps anti-ribosomal P. Fréquence des anticorps anti-ribosomal P dans différents groupes de patients SLE anti-rpp % positif SLE Sans maladie neurologique 1.3 Lupus psychotique Sclérodermie/recouvrement SLE 30 Dépression

7 Contrôles Individus sains 0 Arthrite rhumatoïde 0 Sclérodermie 0.6 De Référence 12, 13 et 14. La figure suivante décrit l incidence des anticorps anti-ribosomal P dans une population normale avec le test anti- Ribosomal P Menarini TM. Distribution of Normal Population with Anti-Ribosomal P ImmuLisa TM % population normale % normal individuals Anti-Ribosomal P (EU/ml) Anti-Ribosomal Ρ (EU/ml) CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCE Précision: Deux sérums positifs anti-ribosomal P ont été testés avec le test ELISA Ribosomal P Menarini pour déterminer la variabilité inter-tests et intra-test. Les résultats sont les suivants: Recouvrement: inter-tests %CV intra-test %CV Echantillon Echantillon Des échantillons avec des concentrations connues d anticorps anti-ribosomal P ont été mélangés avec des dilutions appropriées d un autre échantillon. Des échantillons déterminés et à partir des valeurs obtenues, le pourcentage de recouvrement a été calculé. Les résultats sont les suivants: conc.ribosomal P-Ab Ajoutée (EU/ml) conc.ribosomal P-Ab Obtenue (EU/ml) % Recouvrement Echantillon Echantillon Echantillon

8 REFERENCES 1. Christian CL, Elkon KB. Autoantibodies to intracellular proteins: clinical and biologic significance. Am J Med; 1986, 80: Tan EM, Schur PH, Carr RI, Kunkel HG. Deonyribonucleic acid (DNA) and antibodies to DNA in the serum of patients with systemic lupus erythematosus. J Clin Invest; 1996, 45: Estes D, Christian CL. The natural history of systemic lupus erythematosus by prospective analysis. Medicine (Baltimore); 1971, 50: Feinglass EJ, Arnett FC, Dorsch CA, Zizic Stevens MB. Neuropsychiatric manifestations of systemic lupus erythematosus: diagnosis, clinical spectrum, and relationship to other features of the disease. Medicine (Baltimore); 1976, 55: Bluestein HG, Williams GW, Steinberg AD. Cerebrospinal fluid antibodies to neuronal cells: association with neuropsychiatric manifestations of SLE. Am J Med; 1981, 70: Elkon KB, Parnassa AP, Foster CL. Lupus autoantibodies target ribosomal P proteins. J Exp Med; 1985, 162: Bonfa E, Golombek SJ, Kaufman LD and Elkon KB. Association between lupus psychosis and anti-ribosomal P protein antibodies. N Engl J Med; 1987, 317: Koren E, Reichlin MW, Koscec M, Fugate RD and Reichlin M. Autoantibodies to the Ribosomal P proteins react with a plasma membrane-related target on human cells. J Clin Ivest; 1992; 89: Chu JL, Brot N, Weissbach H et al. Lupus anti-ribosomal P antisera contain antibodies to a small fragment of 28S rrna located in the proposed ribosomal GTPase center. J Exp Med; 1991, 174: Teh LS, Lee MK, Wang F. Manivasagar M and Williams BD. Anti-ribosomal P protein antibodies in different populations of patients with SLE Br J Rheumatol; 1993, 32: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control, National Institute for Health, HHS Pub. No {CDC} ) Isshi K, and Hirohata S. Association of anti-ribosomal P protein antibodies with neuropsychiatric systemic lupus erythematosus. Arth Rheum; 1996, 39: Fujimoto M., Sato S. and Tamaki K et al. Detection of anti-ribosomal P protein antibodies in patients with systemic sclerosis. Br J Rheumatol; 1995, 34: Schneebaum AB, Singleton JD, Sterling G. et al. Association of psychiatric manifestations with antibodies to ribosomal P proteins in SLE. Am J Med; 1991, 90:

9 S.r.l. via Sette Santi Firenze Italia UK UNITED KINGDOM Distributed by Ltd 405 Wharfedale Road Winnersh - Wokingham Berkshire RG41 5RA EL Διανέμεται στην ΕΛΛΑΔΑ από την S.A. 575, Vouliagmenis Ave Argyroupolis Attiki ES ESPAÑA Distribuido por A. Menarini Diagnosticos S.A. Avenida del Maresme, Badalona Barcelona DE DEUTSCHLAND Vertrieb durch Eine Division der Berlin- Chemie AG Glienicker Weg Berlin AT Österreich Vertrieb durch A. Menarini Ges.m.b.H Pottendorfer Straße, 25/27 A Wien FR FRANCE Distribué par France S.A.R.L. 3-5, Rue du Jura BP Rungis Cedex BE Belgique Distribué par Benelux S.A./N.V. Belgicastraat, Zaventem IT ITALIA Distribuito da Via lungo l Ema, Bagno a Ripoli Firenze PT Portugal Distribuido por A. Menarini Diagnósticos, Lda Quinta da Fonte Edifício D.Manuel I, 2 B Paço de Arcos NL NEDERLAND Distributed by Benelux N.V. De Haak, XK Valkenswaard EN > Revision date: April 2008 EL > Ημερομηνία αναθεώρησης: Απρίλιος 2008 ES > Fecha de revisión: Abril de 2008 DE > Datum der Überarbeitung: April 2008 FR > Date de révision: Avril 2008 IT > Data di revisione: Aprile 2008 PT > Data de revisão: Abril de 2008 Document No. PI4133 CE M 52