Colle UE2 N /2016 Enoncé

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1 Colle UE2 N /2016 Enoncé Ayham ALKASSAB & Julien GARYGA Ce sujet de biologie cellulaire est composé de 10 QCM. L épreuve dure 60 minutes. Chaque QCM compte pour 5 points. L ensemble correspond donc à un total de 50 points. Ce fascicule comprend 8 pages.. En réponse à chaque question, vous pouvez noircir zéro à cinq cases sur la grille correspondant à des propositions justes. Il n y a pas de pièges entre les parenthèses.

2 Le cytosquelette est un réseau de polymères filamenteux et de protéines régulatrices. La capacité d'une cellule eucaryote à résister à une déformation dépend du cytosquelette, et plus précisément des filaments intermédiaires. De nos jours, on essaie surtout de comprendre comment le cytosquelette réagit à une contrainte mécanique, de quelle façon il la transmet et quel rôle il joue dans la réponse cellulaire à cette contrainte. Un KO (knock out) tardif permet de désactiver l expression d un gène à un moment donné. On a utilisé cette méthode pour obtenir des cultures de cellules A, B et C : A B C Fibro1 Fibro2 Fibro WT -/- Actine -/- Tubuline α Expérience 1 QCM N 1 : A. Les trois cultures de cellules ont nécessité un KO tardif. B. Après KO, les cellules A ne devraient ne plus être capables de se déplacer mais seront capables de modifier leur morphologie. C. Après KO, les cellules B devraient continuer de réagir correctement à une contrainte mécanique. D. L actine joue un rôle lors de la cytodiérèse. E. Etant donné que le cytosquelette joue de nombreux rôles fondamentaux à la survie de la cellule, on peut penser qu après cette expérience les trois types cellulaires meurent rapidement. Le cytosquelette d'actine permet une variété de fonctions biologiques essentielles à toute cellule eucaryote. En plus de fournir un cadre structurel autour de laquelle la forme des cellules et la polarité sont définies, ses propriétés dynamiques fournissent la force motrice qui permet aux cellules de se déplacer et de se diviser. Comprendre les mécanismes biologiques qui contrôlent l'organisation de l'actine est donc un objectif majeur de la biologie cellulaire contemporaine, avec des implications dans le domaine de la santé. Les membres de la famille Rho, qui sont des petites guanosines triphosphatases ont émergé comme étant des régulateurs essentiels du cytosquelette d'actine. De plus, grâce à leurs interactions avec de multiples protéines cibles, les membres de la famille Rho assurent le contrôle coordonné d'autres activités cellulaires telles que la transcription et l'adhérence intercellulaire. Dans les fibroblastes Swiss 3T3, on a montré que Rho peut être activée par l'addition de ligands extracellulaires et que l'activation de Rho conduit à l'assemblage des filaments d'actine-myosine contractiles associés à des complexes d'adhérence. La protéine Rac7 est une protéine intervenant dans l arrimage de l alpha-actinine avec l actine, et donc agit en concert avec Rho dans la morphologie cellulaire. On construit une souris dans laquelle deux sites loxp sont introduits dans l exon 5 du gène de la protéine Rac7. L expression de Rac7 à partir de cet allèle est normale. Les sites loxp sont disposés de telle sorte que leur recombinaison catalysée par l expression de la recombinase CRE conduise à la délétion de l exon 5. Les souris exprimant le gène CRE sont nommées Rac7 CRE/CRE.

3 Avec un anticorps dirigé contre l extrémité C-Terminale de Rac7, on analyse en western blot la présence de cette protéine dans les muscles des souris WT et CRE. Le gène Rac7 a 38 exons. Le codon start est dans le 2 ème exon. Voici le résultat : QCM N 2 : A. Lors d un western blot, il y a électro-transfert des protéines sur une membrane. B. Il est probable que l anticorps reconnaisse mal la protéine mutée. C. La transgénèse classique consiste en une insertion aléatoire d un gène au sein du génome d une cellule. Son rendement est important. D. L export nucléaire de l ARN messager est perturbé par la délétion de l exon 5. E. Au cours de la migration sur gel, la protéine mutée a migré plus loin que la protéine normale. QCM N 3 : Toujours à propos du western blot, indiquer la (ou les) proposition(s) exacte(s) : A. La délétion de l exon 5 induite par CRE est probablement une délétion multiple de 3. B. C est le fait que la protéine mutée ait plus de charges négatives qui explique qu elle migre plus loin que la protéine non mutée. C. Ce qui peut expliquer que la protéine mutée migre plus loin est l éventuelle formation d un codon stop à l exon 5 suite à la mutation. D. On pourrait étudier l expression de la protéine Rac7 grâce à une étape de RT-PCR. E. A propos de la structure de l ADN, on parle de nucléotide pour l ensemble [base azotée + sucre].

4 La myopathie de Guignarddou est une maladie musculaire dégénérative caractérisée par une hypoplasie (=diminution du nombre de cellules) et une hypotrophie (= diminution de la taille des cellules). En général, les enfants atteints de cette pathologie sont en fauteuil roulant dès l âge de 12 ans et leur espérance de vie ne dépasse que très rarement 25 ans. On sait que dans cette pathologie, c est la liaison entre Rac7 et la myosine qui est mise en cause. Une bonne liaison permet une bonne fonction de la dystrophine (protéine impliquée dans le maintien des muscles). En parallèle, notre équipe de scientifiques étudie le gène ERBB2. Ce gène est impliqué dans la réparation de l ADN. Lorsqu il est affecté, certaines mutations de l ADN ne sont plus corrigées, ce qui mène à une multiplication anarchique et désordonnée des cellules. On étudie 4 types cellulaires : des cellules ERBB2 -/-, des cellules Myosin -/-, des cellules WT et des cellules Rhabdo1. Ces dernières sont les cibles d un sirna (small interfering RNA) contrôle, c est-àdire que le sirna ne s hybride nulle part. A l aide d une technique de biologie cellulaire, on suit l évolution des populations cellulaires sur plusieurs jours : QCM N 4 : (5/0) A. Ce sont les cellules cancéreuses qui sont immortelles. B. On voit que la courbe des cellules ERBB2-/- finit par devenir constante (horizontale) : les cellules arrêtent de proliférer par inhibition de contact. C. Le contenu en ADN des cellules ERBB2 -/- pourrait avoir été augmenté grâce à la technique de PCR (Polymerase Chain Reaction). D. Dans une cellule, la membrane nucléaire sépare directement le nucléole du cytoplasme. E. On pourrait utiliser la cytométrie en flux pour quantifier (= calculer le nombre de cellules) toutes les cultures.

5 Nos chercheurs s intéressent désormais à la culture Myosin -/-. On tient à rappeler qu une cellule qui ne peut pas effectuer son cycle cellulaire correctement a une très grande probabilité de mourir. QCM N 5: A. Tirer des conclusions grâce aux observations de la première journée semble être une bonne idée. B. Dans les cellules Rhabdo1, si le sirna s hybridait sur le gène de la myosine, on aurait le même résultat que pour les cellules Myosin -/-. C. Dans la culture Myosin -/-, le manque de myosine se fait ressentir au niveau de la rigidité des cellules : ces cellules sont moins rigides et donc moins solides. D. L assemblage de 13 protofilaments forme un microtubule. E. On peut penser que, dans la culture Myosin -/-, l étape de cytodiérèse ne s effectue pas correctement. Auparavant, on pensait que la mutation de la myosine était à l origine de la myopathie. Cependant, des tests cliniques ont mis en évidence que certains patients atteints de myopathie de Guignarddou n ont pas de mutation du gène de la myosine. Les chercheurs pensent que la myopathie peut être causée par une mauvaise interaction entre certaines protéines. Afin d étudier ces interactions, ils effectuent plusieurs expériences : -Expérience cellule P : les chercheurs ont fusionné Rac7 avec la GFP (Rac7-GFP) ainsi que la myosine avec la Yellow Fluorescence Protein (Myosin-YFP). La cellule P est ensuite excitée par un laser rouge. -Expérience cellule S : les chercheurs ont fusionné Rac7 avec la B(lue)FP (Rac7-BFP) ainsi que Rho (wild-type) avec la GFP (Rho-GFP). La cellule S est ensuite excitée par un laser violet. -Expérience cellule G : les chercheurs ont fusionné Rho (wild-type) avec la YFP (Rho-YFP) ainsi que la myosine avec la R(ed)FP (Myosin-RFP). La cellule G est ensuite excitée par un laser vert. Résultats de l expérience : La cellule S émet une forte fluorescence verte. La cellule P n émet aucune fluorescence jaune. La cellule G émet une forte fluorescence rouge. QCM N 6 : A. L expérience effectuée sur la cellule P permet d affirmer que Rac7 n interagit pas avec la myosine puisqu aucune fluorescence jaune n est détectée. B. Pour l expérience S, on aurait très bien pu utiliser une protéine Rac7-BFP et une protéine Rho-RFP. La conclusion de l expérience serait la même que dans l énoncé. C. Comme la lumière blanche est polychromatique, les chercheurs ne seraient pas obligés d exciter avec une lumière d une longueur d onde bien précise. Cela faciliterait leur travail (puisque, par exemple, dans la lumière blanche on trouve du rouge). D. Grâce à cette expérience, on peut conclure que Rho est capable d interagir directement avec Rac7 et avec la myosine. E. Les chercheurs ont utilisé cette technique pour s affranchir de la limite de résolution de la microscopie optique.

6 Suite aux expériences précédentes et à une lecture assidue de la littérature scientifique, nos chercheurs savent désormais que la protéine Rac7 est formée de plusieurs domaines, dont RBD (Rho Binding Domain). RDB permettrait donc à Rac7 d interagir avec la protéine Rho. On décide d étudier ces interactions d un peu plus près. Comme étape initiale, une fusion de RBD avec le glutathion S-transférase (GST-RBD) a été réalisée. On a ensuite mis cette protéine de fusion GST-RBD en présence de billes recouvertes de glutathion. Enfin, on rajoute des lysats de cellules qui expriment des protéines Rho mutées. Ces variants de la protéine Rho sont obtenus après délétion de certains acides aminés. On fait un rinçage puis on décide d étudier les protéines purifiées grâce à la technique de western blot. Voici le résultat du western blot : QCM N 7 : A. L expérience préliminaire au western blot est très probablement une chromatographie d affinité. B. Rien à voir, on a effectué une chromatographie échangeuse d ions et c est d ailleurs beaucoup plus judicieux. C. La localisation du chromosome dans le noyau change selon s il est actif ou non. D. Pour récupérer les protéines d intérêt, il sera nécessaire (à la fin de la chromatographie) de changer les conditions physico-chimiques du milieu. E. Les billes de glutathion permettent de retenir GST-RBD. QCM N 8 : A. La tubuline est ici utilisée comme témoin. B. Le résultat du 4 ème puits est inattendu. C. Parmi les 3 versions mutées de la protéine Rho, une seule est capable de fixer Rac7. D. S. Cerevisiae est une bactérie, donc procaryote. E. Vu que la thréonine 218 et la lysine 37 sont très éloignées l une de l autre (sur la protéine), on peut affirmer que la protéine Rho a deux domaines qui lient le RBD.

7 Notre fidèle équipe de chercheurs pensait enfin avoir trouvé la cause de la myopathie : Rho ne se liant pas à Rac7, cela aura une multitude de conséquences qui aboutissent à la pathologie. Cependant, un souci se présente à eux : certains patients ont des phénotypes plus ou moins sévères de myopathie. Deux phénotypes ressortent : -un phénotype sévère, où les patients meurent beaucoup plus rapidement : K37Rho. -un phénotype moins sévère, avec une espérance de vie significativement plus longue : T218Rho. Les chercheurs s intéressent donc aux mécanismes impliqués dans le phénotype moins sévère, car cela pourrait être une piste dans la recherche d un éventuel traitement de la myopathie de Guignarddou. Ils s intéressent à la vitesse de synthèse des variants de Rho. On utilise un laser pour cette expérience :

8 QCM N 9 : A. Cette expérience nécessite d utiliser la vidéo-microscopie et se nomme FRAP. B. Il est possible d avoir fixé les cellules pour faire cette expérience. C. A 0 min, on «bleach» grâce au laser. Cela nous permet d observer que le variant K37Rho met beaucoup plus de temps à être synthétisé de novo que les deux autres variants. D. On a nécessairement utilisé une technique pour rendre les variants de Rho fluorescents. E. Le laser permet d illuminer la cellule et donc de voir les protéines. Un chercheur plus brillant que les autres a eu l idée de vérifier le génome des patients au phénotype le plus sévère. Après séquençage, il s est avéré que ces patients ont aussi une duplication de l exon 5 (à l identique) du gène Rac7, ce qui empêche son activité de liaison à Rho. QCM N 10: A. L éventuel rôle d une protéine intermédiaire permettant l interaction entre Rac7 et Rho peut expliquer le phénotype moins sévère. B. En réalité, on peut fortement penser que l exon 5 joue un rôle fondamental dans la formation du RBD de Rac7. C. Dans le phénotype le plus sévère, on peut penser que c est la duplication de l exon 5 qui entraîne un décalage du cadre de lecture et donc l apparition d une protéine tronquée non fonctionnelle. D. Le phénotype le plus sévère correspond à une forme polygénique de la maladie. E. La protéine Rho a en fait un rôle très important : elle lie Rac7, rejoint la myosine pour la lier, cela entraîne la formation d un complexe multiprotéique. Ce complexe joue un rôle important dans la liaison des filaments d actines à la dystrophine. Cela permet ainsi l adhérence intercellulaire et donc le bon maintien des muscles.