Modulation de l épissage alternatif par la protéine de fusion EWS-FLI1 dans le sarcome d Ewing

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1 Olivier SAULNIER Master 2 biologie informatique Université Paris Diderot, Paris Modulation de l épissage alternatif par la protéine de fusion EWS-FLI1 dans le sarcome d Ewing Directeur d équipe : Dr. Olivier Delattre Responsable de stage : Dr. Franck Tirode Encadrants : Dr. Sandrine Grossetete-Lalami Dr. Olivier Mirabeau Tuteurs : Pr. Catherine Etchebest Dr. Jean-Christophe Gelly Durée : 12 janvier juin 2015 Institut Curie Centre de recherche U830 INSERM Génétique et biologie des cancers Équipe génétique et biologie des tumeurs pédiatriques 26 rue d Ulm Paris CEDEX 05, France

2 Abstract Ewing's sarcoma is the second most common bone tumor affecting children and young adults. The primary oncogenic event is a balanced chromosomal translocation leads to the formation of a fusion gene between the EWSR1 gene and the FLI1 gene. This oncogenic fusion protein is an aberrant transcription factor playing a key role in regulating the expression of many genes essential to the development of Ewing's sarcoma. It has been shown that EWSR1-FLI1 had multiple partners especially within spliceosomal complexes and it would have a potential role in the modulation of alternative splicing. In order to study the involvement of EWSR1-FLI1 on alternative splicing, I analyzed RNA-seq data of Ewing cell lines using cufflinks tool. Differential analysis of isoforms expression confirmed 17 genes for which EWSR1-FLI1 directly modulate isoforms expression in at least two cell lines. To date, two genes have been confirmed by RTQ-PCR: the ADD3 gene and the MAT2B gene. These results indicate a relative implication of EWSR1-FLI1 in alternative splicing mechanisms and suggest interesting candidates for the development of therapeutic targets. Résumé Le sarcome d Ewing est la seconde tumeur osseuse la plus fréquente affectant les enfants et jeunes adultes. L événement oncogénique principal est une translocation chromosomique équilibrée qui, dans 85% des cas, conduit à la formation d un gène de fusion entre le gène EWSR1 et le gène FLI1. Cette protéine de fusion est un facteur de transcription oncogénique aberrant jouant un rôle primordial dans la régulation de l expression de nombreux gènes, essentiels au développement du sarcome d Ewing. Il a été montré qu EWSR1-FLI1 interagissait de façon directe avec des protéines du complexe du splicéosome et qu il aurait un rôle potentiel dans la modulation de l épissage alternatif. Dans le but d étudier l'implication d EWSR1-FLI1 sur l'épissage alternatif, j ai étudié des données de RNA-seq de lignées cellulaires Ewing par l outil cufflinks. L analyse différentielle de l expression d isoformes a permis de confirmer 17 gènes pour lesquels EWSR1-FLI1 modulerait l expression dans au moins deux lignées cellulaires. À ce jour, deux gènes ont été confirmés par RTq-PCR : le gène ADD3 et le gène MAT2B. Ces résultats indiquent une implication relative d EWSR1-FLI1 dans les mécanismes d épissage alternatif et proposent des pistes intéressantes pour le développement de cibles thérapeutiques.

3 Table des abréviations ADD3 : Adducin 3 Gamma ADN : Acide DésoxyriboNucléique ARN : Acide ribonucléique CCND1 : Cyclin D1 CDKN2A : Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A cdna : ADN complémentaire ERG : V-Ets Avian Erythroblastosis Virus E26 Oncogene Homolog ETS : E26 transformation-specific ETV1 : Ets variant 1 ETV4 : Ets variant 4 EWSR1 : EWSR RNA-binding protein 1 FEV : FEV (ETS Oncogene Family) FLI1 : Fli-1 proto-oncogene FPKM : Fragments Per Kilobase Of Exon Per Million Fragments Mapped IGV : Integrative Genomics Viewer MAT2B : Methionine AdenosylTransferase II, Beta OMIM : Online Mendelian Inheritance in Man PCR : Polymerase Chain Reaction PLK1S1 : Kizuna Centrosomal Protein qpcr : PCR quantitative en temps réel RFS : Relpase-free survival RT-qPCR : Reverse Transcription quantitative Polymerase Chain Reaction SF3B1 : Splicing Factor 3b, Subunit 1 shrna : Short hairpin RNA SMART : Simple Modular Architecture Research Tool STAG2 : Stromal antigen 2 TAD : Transcription Activation Domain TET : TLS/FUS EWSR1 TAF15 TLS/FUS : Fused In Sarcoma TP53 : Tumor protein p53 UTR : UnTranslated Region WBP5 : WW Domain Binding Protein 5

4 Sommaire Le sarcome d Ewing... 1 Le contexte du projet et objectifs... 2 Matériel et méthodes 1) Échantillons biologiques ) Données transcriptomiques ) Quantification de l expression des transcrits ) Validation en RT-qPCR... 7 Résultats 1) Pipeline ) Transcrits régulés par EWSR1-FLI ) Validation en RTq-PCR Discussion et perspectives Références bibliographiques Annexes... 21

5 Le sarcome d Ewing Le sarcome d Ewing est une tumeur osseuse maligne décrite par James Ewing en C est la seconde tumeur osseuse la plus fréquente affectant des enfants et des jeunes adultes avec un âge moyen au diagnostic de 15 ans et une incidence annuelle de 3/ Cette tumeur se caractérise par une ostéolyse agressive et un risque métastatique important : au diagnostic, 25% des patients présentent des métastases. Malgré l existence d un traitement multimodal lourd (chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie), le pronostic est hétérogène. Le taux de survie globale à 5 ans est de 60 à 70% pour les patients présentant une tumeur localisée et de seulement 20% dans les cas de tumeurs métastatiques 3 (Annexe 1). L événement principal de l oncogenèse du sarcome d Ewing est, dans 85% des cas, une translocation chromosomique équilibrée t(11;22)(q24;q12) 4. Cette translocation conduit à la formation d un gène de fusion entre le gène EWSR1, appartenant à la famille TET, et le gène FLI1, appartenant à la famille des facteurs de transcription ETS. Cette protéine de fusion est constituée du domaine d activation de la transcription d EWSR1 et du domaine de fixation à l ADN de FLI1, représentés schématiquement en bleu et rouge, respectivement, sur la Figure 1. Figure 1 : Représentation schématique du gène de fusion EWSR1-FLI1 dans le sarcome d Ewing. TAD : transcription activation domain. p. 1

6 D autres translocations minoritaires ont été décrites impliquant d autres gènes de la famille ETS, comme les gènes ERG 5, ETV1 6, ETV4 7 ou FEV 8 ainsi qu un autre gène de la famille TET, le gène TLS/FUS 9. Comme la plupart des cancers pédiatriques, ce type tumoral a un taux de mutation faible et seules quelques altérations génomiques récurrentes ont été décrites à ce jour : (i) la mutation du gène STAG2 (15-20%), (ii) la mutation du gène TP53 (5-10%) et (iii) la délétion chromosomique du gène CDKN2A (10%). Le sarcome d Ewing est donc caractérisé par l expression d un facteur de transcription aberrant EWSR1-FLI1. Cette protéine de fusion, en se fixant sur des séquences présentant des répétitions du motif GGAA 14, joue un rôle primordial dans la régulation de l expression de nombreux gènes cibles, essentiels au développement du sarcome d Ewing 15. De plus, il a été mis en évidence qu EWSR1-FLI1 interagissait de façon directe avec des protéines du splicéosome 16,17. De par cette capacité, EWSR1-FLI1 exercerait aussi son action en modulant l épissage alternatif de certains gènes 18. Cependant le rôle de ce processus dans l oncogenèse du sarcome d'ewing reste encore à établir. Le contexte du projet et objectifs L épissage alternatif est l un des principaux processus participant à l immense diversité et complexité du protéome. Chez l Homme, environ 95% des gènes subissent un épissage alternatif 19,20, conduisant, pour un gène donné, à la production de multiples ARN messagers pouvant avoir des rôles biologiques distincts. Il a été mis en évidence que l épissage alternatif peut être contrôlé par des facteurs de transcriptions selon deux mécanismes : (i) par le recrutement de co-régulateurs de la transcription, jouant un rôle direct dans la régulation de l épissage 21 et (ii) par la modulation du taux d élongation de la transcription 22. p. 2

7 L objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes et les conséquences des perturbations de l épissage alternatif par EWSR1-FLI1. En effet, les mécanismes d épissage étant couplés à ceux de la transcription, il est probable qu EWSR1-FLI1 module les deux processus de manière concomitante. Ainsi, notre hypothèse de travail est de comprendre comment l expression de variants oncogéniques induits par EWSR1-FLI1 contribuerait au développement tumoral du sarcome d Ewing. Cette hypothèse repose sur plusieurs travaux scientifiques : - l altération des mécanismes d épissage joue un rôle important dans le développement de maladies 23,24, y compris le cancer 25,26. Par exemple, la mutation de la protéine SF3B1 (complexe du splicéosome) a été directement impliquée dans la leucémie lymphoïde chronique les protéines de la famille TET et notamment FUS/TLS ont clairement été impliquées dans les mécanismes d épissage 28 et différentes études ont montré qu EWSR1-FLI1 interagissait de façon directe avec des protéines du splicéosome 16,17. - par ailleurs, EWSR1-FLI1 modulerait l épissage alternatif de certains gènes, comme la cycline D1 (CCND1) 18. Cependant, le mécanisme précis n est pas encore bien compris et l implication de ce processus dans l oncogenèse du sarcome d Ewing n est pas clairement établie. Ainsi, ce projet devrait nous permettre d identifier des cibles pour lesquelles la protéine de fusion EWSR1-FLI1 modulerait l expression d isoformes spécifiques. Cela nous permettrait d avoir une meilleure compréhension des perturbations de l épissage alternatif dans l oncogenèse du sarcome d Ewing. Pour cela, deux axes de recherches seront abordés au cours de ce projet : (i) l identification de transcrits d épissage alternatifs dont l expression est modulée par EWSR1-FLI1 (ii) la validation in silico et in vitro des résultats obtenus p. 3

8 Matériel et méthodes Au cours des dernières années, le séquençage haut débit du transcriptome a permis d accroître de façon considérable les connaissances sur les mécanismes transcriptionnels. En parallèle, une multitude de logiciels ont été développés afin de quantifier l expression de transcrits à partir de données RNA-seq comme cufflinks 29,30, DEXSeq 31, DiffSplice 32, FlipFlop 33, etc Ces outils utilisent des approches différentes, notamment pour assigner une lecture à un transcrit. Les deux grands modèles sont le modèle basé sur le comptage et le modèle de résolution d isoformes. Le premier permet d attribuer une lecture à une unité génomique (exon par exemple) sans ambiguïté tandis que le second permet d inférer, par un modèle probabiliste, quelle est l isoforme ayant la plus forte probabilité de provenir de cette lecture. Le second modèle est le plus adapté à ce jour pour la quantification de l expression d isoformes. C est pour cela que nous avons choisi d utiliser le package cufflinks afin de répondre au mieux à notre problématique en fonction de notre plan expérimental. 1) Échantillons biologiques Les expériences biologiques suivantes ont étés réalisées dans le laboratoire. Les données étudiées lors de mon stage proviennent principalement de la lignée cellulaire Ewing ASP14. Afin d étudier l implication d EWSR1-FLI1 sur l épissage alternatif, l expression de ce dernier a été inhibée grâce à un shrna (ciblant le transcrit de fusion EWSR1-FLI1) inductible par la doxycyline. Des réplicas biologiques ont été réalisés : 3 réplicas où EWSR1- FLI1 est exprimé (EWSR1-FLI1 High ) et 5 réplicas où l expression d EWSR1-FLI1 est inhibée (EWSR1-FLI1 Low ) (Figure 2). p. 4

9 A B Figure 2 : Système d inhibition d EWSR1-FLI1 après 7 jours de traitement par un shrna (ciblant EWSR1-FLI1) inductible par la doxycycline, dans la lignée cellulaire Ewing ASP14. A : Expression relative d EWSR1-FLI1 au niveau de l ARN messager (RT-qPCR). B : Expression relative d EWSR1-FLI1 au niveau de la protéine (Western-Blot) Les extractions d ARN ont été réalisées à l aide du kit NucleoSpin RNA (Macherey- Nagel) et la qualité a été vérifiée sur Bioanalyzer (Agilent). L ADN complémentaire (ADNc) a été obtenu en utilisant la reverse transcriptase High-Capacity cdna Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) avec 1µg d ARN initial. 2) Données transcriptomiques Le séquençage a été réalisé par la plateforme de l Institut Curie (HiSeq Illumina) en paired-ends 2x100 nucléotides. Les lectures brutes ont été alignées à l aide du logiciel TopHat v ,35 sur la version GRCh37 (hg19) du génome de référence humain. Environ 200 millions de lectures ont été générées par échantillon dont 75% mappent sur le génome avec un taux de duplicats de PCR de l ordre de 25%. J ai utilisé l outil PicardTools v1.45 ( pour supprimer les duplicats de PCR et j ai filtré les alignements de mauvaise qualité (score d alignement inférieur à 20) à l aide de samtools v Les données du rapport du séquençage des échantillons sont présentées dans l Annexe 2 et sont conformes à celles attendues. p. 5

10 En parallèle, afin de valider les résultats des analyses en aval, un jeu de validation a été constitué à partir de données de RNA-seq publiques dans les lignées cellulaires Ewing A673 et SKNMC avec 1 réplica biologique par condition. Les lectures brutes de RNA-seq des lignées A673 et SKNMC ont été obtenues via le code d accession GSE dans la banque de données publique Gene Expression Omnibus (GEO). 3) Quantification de l expression des transcripts J ai utilisé l outil cufflinks v ,30 avec la version GRCh37 (hg19) du génome de référence humain et la version 75 du transcriptome de référence Ensembl, en suivant les recommandations des auteurs (Figure 3). Figure 3 : Pipeline de l analyse d expression différentielle de variants d épissage. Adapté de Trapnell et al., p. 6

11 4) Validation RT-qPCR L ADN complémentaire (cdna) a été obtenu en utilisant le kit High-Capacity cdna Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). La quantification en PCR quantitative en temps réel (qpcr) a été réalisée à l aide du kit Power SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) via l appareil 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Afin de confirmer les résultats de RNA-seq, au moins deux couples d amorces par gène d intérêt ont été conçus : l un pour cibler uniquement le transcrit spécifique dont l expression est modulée dans les deux conditions et l autre pour cibler l expression globale du gène en ciblant une région commune. Ce dernier sera utilisé pour normaliser l expression afin d obtenir la fréquence relative de l isoforme par rapport à l expression du gène donné. La spécificité et l efficacité des couples d amorces ont été vérifiées en effectuant des courbes standards de concentration en ADNc connue. Les amorces utilisées sont présentées en Annexe 3. p. 7

12 Résultats 1) Pipeline Le package cufflinks permet, via l estimation du maximum de vraisemblance, d assigner chaque lecture à un transcrit spécifique et donc d inférer l abondance d un transcrit au sein d une population pour chaque réplica. La quantification pour chaque transcrit de l ensemble des réplicas dans chaque condition est réalisée via la commande cuffdiff. Cette commande permet de normaliser l expression d un transcrit selon plusieurs critères : (i) par la longueur du transcrit, (ii) par le nombre de lectures dans chaque expérience et (iii) par la médiane des moyennes géométriques de l expression de l ensemble des transcrits pour une expérience donnée 39. Les données de quantification sont exprimées en FPKM (Fragments Per Kilobase Of Exon Per Million Fragments Mapped). À notre connaissance, l ensemble des outils actuels réalisent un test statistique individuel pour chaque isoforme afin d identifier une différence d expression entre deux conditions. Cependant, cette approche comporte un défaut majeur : le biais apporté par l expression globale du gène. En effet, en effectuant de façon indépendante un test pour chaque isoforme issue du même gène, il est possible d inférer une différence significative d expression entre deux conditions alors que celle-ci serait simplement le résultat d une différence d expression globale du gène. Un exemple de faux-positif, détecté par l analyse différentielle de cuffdiff, est présenté dans l Annexe 4. On peut observer une surexpression significative de chaque isoforme dans la condition EWR1-FLI1 Low. Cependant, en calculant les fréquences d expression relatives de chaque isoforme en fonction de l expression globale du gène, on n observe aucun changement significatif. J ai donc effectué l analyse différentielle en me basant sur les fréquences relatives de l expression de chaque isoforme en fonction de l expression du gène donné. Pour tester ces différences, des tests exacts de Fisher ont été réalisés, car nous avons un faible nombre d échantillons. Du fait du nombre important de comparaisons statistiques, j ai ensuite réalisé une correction par la méthode de Bonferroni. p. 8

13 Par cette approche on limite le nombre de faux positifs provenant, par exemple, du fait qu EWSR1-FLI1 modulerait l expression globale du gène et non l expression spécifique d un transcrit. Tous les gènes exprimant au moins deux isoformes (FPKM > 2) dans l une des conditions expérimentales et pour lesquels la p-value ajustée est inférieure à 0,05 ont été conservés. 2) Transcrits régulés par EWSR1-FLI1 L'analyse différentielle a permis de détecter 331 gènes pour lesquels au moins une isoforme présentait un changement d expression significatif en fonction du niveau d expression d EWSR1-FLI1 (High ou Low). Il existe plusieurs biais connus dans l analyse de données transcriptomiques dont le principal provient du fichier d annotation utilisé. En effet, une étude récente a permis de mettre en évidence une variabilité, non négligeable, au niveau de l expression génique selon que l on utilise le fichier d annotation Ensembl ou RefSeq 40. Nous avons également pu montrer ce biais par la détection de faux positifs dus à des erreurs d'annotations des positions, notamment au niveau des régions UTR. L Annexe 5 montre un exemple de faux positif détecté lors de l analyse RNA-seq, sur le gène PLK1S1. Ce faux positif est causé par une erreur d annotation dans le fichier de référence Ensembl présentant deux isoformes qui diffèrent de 4 paires de bases à l extrémité 3 UTR. Par ailleurs, les deux principaux facteurs limitants de l étape de validation sont la couverture du gène et le nombre d isoformes exprimées. En effet, dans le cas où un gène comporte un grand nombre d isoformes ou si ce gène est faiblement exprimé, il devient très difficile d étudier le différentiel d expression d une isoforme. C est pourquoi l étape de validation sur Integrative Genomics Viewer (IGV) 41 est primordiale et ne peut pas être automatisable avec les outils dont on dispose actuellement. Ainsi, la visualisation des lectures de jonction entre deux exons sur IGV a permis de confirmer, pour le moment, 57 gènes pour lesquels EWSR1-FLI1 module l expression d au moins une isoforme. Parmi ces gènes, 49% présentaient un site de démarrage alternatif de la transcription (28/57), 46% présentaient un saut d exon (26/57), 3 % présentaient une rétention d intron (2/57) et seulement 2% un site de terminaison alternatif (1/57). p. 9

14 Grâce à l'analyse différentielle des données publiques de RNA-seq des lignées A673 et SKNMC, 17 des 57 gènes ont été retrouvés dans au moins une autre lignée cellulaire Ewing. La Figure 4 présente les 17 gènes pour lesquels une modulation d'expression d une isoforme par EWSR1-FLI1 a été détectée dans au moins 2 lignées cellulaires Ewing. Figure 4 : Validation des 17 évènements transcriptionnels dans les lignées cellulaires Ewing ASP14, A673 et SKNMC. Les gènes en rouge sont les gènes associés à une maladie dans la base de données OMIM ( Les cases vertes signifient la validation de l évènement transcriptionnel par l analyse en RNA-seq. Les cases rouges indiquent une invalidation de l évènement transcriptionnel par l analyse en RNA-seq. ASS : site de démarrage alternatif de la transcription. SE : saut d exon. ATS : site de terminaison alternatif. p. 10

15 Le gène ADD3 code pour une protéine du cytosquelette permettant l assemblage du réseau d actine/spectrine et joue un rôle dans la mobilité cellulaire. Dans la base de données Ensembl, 21 transcrits sont annotés pour le gène ADD3. Les données de RNA-seq de la Figure 5 présentent les 4 isoformes exprimées du gène ADD3 dans nos conditions expérimentales. On observe que la fréquence de l isoforme 1 (ENST ), incluant l exon 14, passe de 3% à 30% en présence d EWSR1-FLI1 (facteur 10). Ensembl Isoforme EWS-FLI1 Low EWS-FLI1 High Fold change (High/Low) ENST isoforme 1 3% 30% 10 ENST isoforme 2 84 % 65 % 0,8 ENST isoforme 3 3% 1% 0,3 ENST isoforme 4 10% 5% 0,5 Figure 5 : Expression relative des 4 isoformes exprimées du gène ADD3 en RNA-seq (P-value ajustée : 4,68E-03). La visualisation des lectures de jonction exon-exon sur IGV a permis de valider l inclusion préférentielle de l exon 14 en présence d EWSR1-FLI1 (Figure 6). A B iso 1 Figure 6 : Visualisation en Sashimi-plot sur IGV des lectures de jonction exon-exon sur le gène ADD3 représentant l'inclusion préférentielle de l exon 14 dans la condition EWSR1-FLI1 High correspondant à l isoforme 1 (ENST ). A : condition EWSR1- FLI1 High. B : condition EWSR1-FLI1 Low. p. 11

16 Le gène MAT2B code pour une enzyme, impliquée dans le cycle cellulaire, qui catalyse la formation de S-adénosylméthionine à partir de méthionine et d ATP. Dans la base de données Ensembl, 8 transcrits sont annotés pour le gène MAT2B. Les données de RNA-seq de la Figure 7 présentent les deux isoformes exprimées pour le gène MAT2B qui diffèrent par l utilisation du premier exon. On observe un changement d isoforme majeur en fonction de la présence d EWSR1-FLI1. En effet, l isoforme 1 (ENST ), majoritaire en absence d EWSR1-FLI1 (81%), a une fréquence relative divisée par deux lorsqu EWSR1-FLI1 est présent (41%). De plus, l isoforme 2 (ENST ) passe, elle, d une fréquence de 19% en condition EWSR1-FLI1 Low à une fréquence de 59% (facteur 3) en présence d EWSR1-FLI1. Transcrit Isoforme EWS-FLI1 Low EWS-FLI1 High Fold change (High/Low) ENST isoforme 1 81% 41% 0,5 ENST isoforme 2 19% 59% 3,1 Figure 7 : Résultats de l analyse RNA-seq des isoformes exprimées du gène MAT2B (P-value ajustée : 5,1E-05). La visualisation des lectures de jonction exon-exon sur IGV a permis de valider l utilisation différentielle du premier exon en fonction de la présence d EWSR1-FLI1 (Figure 8). A B iso 2 iso 1 Figure 8 : Visualisation en Sashimi-plot sur IGV des lectures de jonction exon-exon sur le gène MAT2B représentant l utilisation différentielle du premier exon via l isoforme 1 (ENST ) et l isoforme 2 (ENST ). A : condition EWSR1-FLI1 High. B : condition EWSR1-FLI1 Low. p. 12

17 3) Validation RT-qPCR À ce jour, deux des 17 gènes ont étés validés en RT-qPCR : le gène ADD3 (Adducine 3 Gamma) et le gène MAT2B (Méthionine Adénosyltransferase II, Beta). Pour le gène ADD3, seul le transcrit présentant la plus grande variation entre les deux conditions a été ciblé (transcrit ENST ). Les données de RNA-seq montrent que l expression globale du gène ADD3 est diminuée d un facteur 2 en présence d EWSR1-FLI1 (Figure 9A). Cependant en mesurant le niveau de l expression des isoformes, on observe que l isoforme 1 (ENST ), incluant le 14 ème exon, a une fréquence relative 15 fois plus élevée en présence d EWSR1-FLI1 (Figure 9B). L analyse par RT-qPCR confirme donc le résultat retrouvé en RNA-seq. A B Figure 9 : Résultats de l analyse en RT-qPCR du gène ADD3. A : expression globale du gène ADD3 en RNA-seq. B : mesure de l expression de l isoforme 1 (ENST ) du gène ADD3 en RT-qPCR. p. 13

18 Pour le gène MAT2B, les données de RNA-seq montrent que l expression génique n est pas modulée par la présence d EWSR1-FLI1 (Figure 10A). L analyse en RT-qPCR a permis de mettre en évidence que la fréquence de l isoforme 1 (ENST ) est 3 fois plus élevée en présence d EWSR1-FLI1 et que fréquence de l isoforme 2 (ENST ) est, elle diminuée par un facteur 2 (Figure 10B). Cela confirme donc les résultats retrouvés en RNA-seq. A B Figure 10 : Résultats de l analyse en RT-qPCR du gène MAT2B. A : mesure de l expression globale du gène MAT2B en RNA-seq. B : mesure de l expression des transcrits ENST et ENST du gène MAT2B en RT-qPCR. p. 14

19 Discussion et perspectives Ce projet a permis de mettre en évidence 17 gènes pour lesquels EWSR1-FLI1 module l expression d une isoforme dans au moins deux lignées cellulaires. Parmi ces 17 gènes, 9 gènes (53%) présentent une utilisation différentielle du premier exon. Ces résultats indiqueraient une implication relative de la protéine de fusion EWSR1-FLI1 dans les mécanismes transcriptionnels de l épissage alternatif. De plus, la fonction de certains gènes (Figure 4), tel que le gène ADD3, laisse supposer que l organisation du cytosquelette pourrait jouer un rôle dans le développement tumoral du sarcome d Ewing. Le gène ADD3 code pour la chaine polypeptidique gamma de l adducine. L adducine est impliquée dans le recrutement de la spectrine (dont fait partie la protéine STAG2) et interagit avec les filaments d actine de par sa région C-terminale 42. J ai pu montrer que l expression du gène ADD3 était régulée négativement par la présence d EWSR1-FLI1 et que ce dernier favorisait fortement l expression de l isoforme ENST En effet, cette isoforme a une fréquence d expression relative augmentée par un facteur en présence d EWSR1-FLI1 et conduit à une protéine plus longue de 32 acides aminés au niveau C- terminale. Une étude a montré que l ajout de ces 32 acides aminés conduisaient à la modification de la structure secondaire de la protéine par l'insertion d'une superhélice et d'une région de faible complexité dans la région C-terminale 43 (Figure 11). Cependant, l'implication de cette modification de structure secondaire dans l'oligomérisation des monomères d'adducine ou dans la fixation avec l'actine/spectrine/calmoduline n'a pas été clairement établie. A B Figure 11 : Prédiction des motifs de structure secondaire des deux isoformes du gène ADD3 via la base de données SMART. Les motifs vert et violet représentent respectivement une superhélice et une région de faible complexité A : Prédiction de la structure secondaire de l'isoforme ENST du gène ADD3, sans l'inclusion de l'exon 14. B : Prédiction de la structure secondaire de l'isoforme ENST du gène ADD3, incluant l'exon 14. p. 15

20 J'ai également pu mettre en évidence qu'ewsr1-fli1 joue un rôle sur le démarrage de la transcription du gène MAT2B. Cet évènement n'a, a posteriori, pas d'impact sur l'expression globale du gène mais influerait sur l'expression des isoformes. En effet, l'isoforme 1 (ENST ) est l isoforme majeur dans la condition EWSR1-FLI1 Low et devient minoritaire lorsque la protéine de fusion EWSR1-FLI1 est exprimée. C est le phénomène inverse pour l isoforme 2 (ENST ) qui devient majoritaire en présence d'ewsr1-fli1. Ces deux isoformes différent par 11 acides aminés au niveau N- terminale de la protéine. Une étude a montré que l isoforme 2 jouait un rôle dans la croissance cellulaire et que sa surexpression augmentait la croissance 44. Cette observation révèle un possible rôle de la surexpression de l isoforme 2 du gène MAT2B dans la prolifération cellulaire dans le développement du sarcome d Ewing. De manière intéressante, l analyse des profils de ChIP-seq sur des lignées Ewing dont le laboratoire dispose, montre l'absence de fixation d'ewsr1-fli1 au niveau des promoteurs minimaux du gène MAT2B. Cette observation suggère plusieurs hypothèses : (i) une fixation d EWSR1-FLI1 à une région distale du promoteur ou (ii) l'existence d'un mécanisme indirect par lequel EWSR1-FLI1 régulerait l'expression d'un facteur de transcription annexe, permettant de favoriser l'expression de l'isoforme 2 du gène MAT2B. De par ces résultats, nous souhaitons poursuivre l étude du rôle d EWSR1-FLI1 sur l épissage alternatif, notamment en se focalisant sur la détection de transcrits alternatifs non décrits dans les fichiers d annotations. La validation de ces résultats dans les RNA-seq de tumeurs, disponibles au laboratoire, permettrait de consolider cette analyse et d obtenir des cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement du sarcome d Ewing. De plus, nous souhaitons également nous intéresser d'avantage sur l impact du mécanisme de couplage entre la transcription et la structure de la chromatine sur l'épissage alternatif 45. Le gène STAG2 est muté dans 15 à 20% des patients atteints du sarcome d Ewing. Ces mutations ont pour conséquence de supprimer l expression de la protéine STAG2. Néanmoins, l implication fonctionnelle de cette inactivation dans le sarcome d Ewing n a pas encore été élucidée. La protéine STAG2 est une sous-unité du complexe de la cohésine qui joue un rôle dans la structure tridimensionnelle de la chromatine. L objectif serait d étudier l implication de la structure de la chromatine sur l accessibilité à l ADN par des facteurs de transcription, comme EWSR1-FLI1. p. 16

21 Références bibliographiques 1. Ewing James. Diffuse endothelioma of bone. Proc N Y Pathol Soc (1921). 2. Esiashvili, N. et al. Changes in incidence and survival of Ewing sarcoma patients over the past 3 decades: Surveillance Epidemiology and End Results data. J. Pediatr. Hematol. Oncol. 30, (2008). 3. Cotterill, S. J. et al. Prognostic factors in Ewing s tumor of bone: analysis of 975 patients from the European Intergroup Cooperative Ewing s Sarcoma Study Group. J. Clin. Oncol. Off. J. Am. Soc. Clin. Oncol. 18, (2000). 4. Delattre, O. et al. Gene fusion with an ETS DNA-binding domain caused by chromosome translocation in human tumours. Nature 359, (1992). 5. Sorensen, P. H. et al. A second Ewing s sarcoma translocation, t(21;22), fuses the EWS gene to another ETS-family transcription factor, ERG. Nat. Genet. 6, (1994). 6. Jeon, I. S. et al. A variant Ewing s sarcoma translocation (7;22) fuses the EWS gene to the ETS gene ETV1. Oncogene 10, (1995). 7. Kaneko, Y. et al. Fusion of an ETS-family gene, EIAF, to EWS by t(17;22)(q12;q12) chromosome translocation in an undifferentiated sarcoma of infancy. Genes. Chromosomes Cancer 15, (1996). 8. Peter, M. et al. A new member of the ETS family fused to EWS in Ewing tumors. Oncogene 14, (1997). 9. Ng, T. L. et al. Ewing sarcoma with novel translocation t(2;16) producing an in-frame fusion of FUS and FEV. J. Mol. Diagn. JMD 9, (2007). 10. Solomon, D. A. et al. Mutational Inactivation of STAG2 Causes Aneuploidy in Human Cancer. Science 333, (2011). 11. Brohl, A. S. et al. The genomic landscape of the Ewing Sarcoma family of tumors reveals recurrent STAG2 mutation. PLoS Genet. 10, e (2014). 12. Tirode, F. et al. Genomic landscape of Ewing sarcoma defines an aggressive subtype with co-association of STAG2 and TP53 mutations. Cancer Discov. 4, (2014). 13. Crompton, B. D. et al. The genomic landscape of pediatric Ewing sarcoma. Cancer Discov. 4, (2014). 14. Guillon, N. et al. The oncogenic EWS-FLI1 protein binds in vivo GGAA microsatellite sequences with potential transcriptional activation function. PloS One 4, e4932 (2009). 15. Prieur, A., et al. EWS/FLI-1 silencing and gene profiling of Ewing cells reveal downstream oncogenic pathways and a crucial role for repression of insulin-like growth factor binding protein 3. Mol. Cell. Biol. 24, (2004). 16. Knoop, L. L. et al. The splicing factor U1C represses EWS/FLI-mediated transactivation. J. Biol. Chem. 275, (2000). 17. Selvanathan, S. P. et al. Oncogenic fusion protein EWS-FLI1 is a network hub that regulates alternative splicing. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, E (2015). 18. Sanchez, G. et al. Alteration of cyclin D1 transcript elongation by a mutated transcription factor up-regulates the oncogenic D1b splice isoform in cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, (2008). 19. Wang, E. T. et al. Alternative Isoform Regulation in Human Tissue Transcriptomes. Nature 456, (2008). 20. Pan, Q., et al. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat. Genet. 40, (2008). 21. Auboeuf, D., et al. Coregulators: transducing signal from transcription to alternative splicing. Trends Endocrinol. Metab. TEM 18, (2007). 22. Cáceres, J. F. et al. Alternative splicing: multiple control mechanisms and involvement in human disease. Trends Genet. TIG 18, (2002). p. 17

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23 Annexes. Annexe 1 : Courbe de survie de patients atteints du sarcome d Ewing. RFS : relapse-free survival Issu de Cotteril et al., Annexe 2 : Rapport du séquençage des RNA-seq. Annexe 3 : Amorces utilisées en RT-qPCR pour la quantification d isoformes. ALL : amorces spécifiques ciblant une région commune à l ensemble des isoformes. p. 19

24 FPKM EWS-FLI1 high EWS-FLI1 low Cuffdiff pvalue iso A 63,4 164,6 5,5E-04 iso B 23,1 45,2 1,1E-03 % EWS-FLI1 high EWS-FLI1 low iso A 73,3 % 78,4 % iso B 26,7 % 21,5 % Annexe 4 : Exemple du biais de l analyse différentielle de cuffdiff induit par la surexpression du gène WBP5 dans la condition EWSR1-FLI1 Low. Annexe 5 : Exemple de faux positif dû à la dernière position de l UTR du gène PLK1S1, dans le fichier d annotation, qui diffère de 4 paires de bases. p. 20