Application des technologies de microencapsulation pour la formulation de probiotiques et mise au point d un coating entérique

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1 Jeudi 10 octobre 2013 Application des technologies de microencapsulation pour la formulation de probiotiques et mise au point d un coating entérique Alain Durieux Unité de Biotechnologie Institut Meurice - Heldb 1

2 I. Présentation de L unité de Biotechnologie Activités Expertises en technologies de microencapsulation 2

3 Unité de Biotechnologie Département de l Institut Meurice (Master Ingénieur industriel Chimie / Biochimie) - Haute Ecole Lucia de Brouckère Recherche appliquée / prestations de services : microbiologie appliquée et en développement de bioprocédés Collaborations avec le monde industriel et académique - Programmes subsidiés Collaborations sont établies au travers de l asbl Meurice R&D, Centre de Recherche Associé. 3

4 Savoir-faire s exprime dans les secteurs: La production de microorganismes sous forme sèche ou liquide (probiotiques, starters pour l industrie alimentaire ou la bioépuration, biofongicides ). Le scaling up et la validation de procédés de fermentation et de purification de protéines présentant un intérêt industriel. La production de métabolites d intérêt : acides organiques bioéthanol acides aminés Le développement de bioprocédés pour l épuration / technologies environnementales (biofiltration, bioremédiation, dénitrification ) Les opérations unitaires de séchage et de microencapsulation L immobilisation de microorganismes et développement de bioréacteurs continus 4

5 Infrastructure / équipement Unité de Biotechnologie - infrastructure pilote : Une salle de fermentation LS1 (1 x 200 litres, 1 x 100 litres, 4 x 10 litres, 1 x 5 litres et 6 x 2 litres) autonome disposant d une autorisation d utilisation pour MGM de classe de risque 1, Une salle de procédés de séchage : lyophilisation - atomisation - sécheurs à lit fluidisé Une salle de purification de protéines (échelle de laboratoire et échelle pilote). Labo analytique de support (HPLC, Electrophorèses,.) 5

6 Expertises en technologies de Microencapsulation - Enrobage 6

7 Atomisation (Spray-drying) : Mobile MINOR Capacité : 2 kg / h T d entrée d air : 150 à 250 C Tête d atomisation : turbine Récupération de la poudre par cyclone Production MINOR Capacité : 20 kg / h T d entrée d air : 150 à 350 C Tête d atomisation : turbine (vitesse variable) Récupération de la poudre : lourdes et fines 7

8 Lit fluidisé : Séchage et enrobage Séchage Enrobage Glatt Powder Coater Granulator 1 Capacité : 300 g à 1,5 kg Cuves : Top Spray Bottom Spray/Wurster Tangential Spray/Rotor 3 surfaces de disques disponibles 8 Granulation/ Agglomération Coating particulaire (Wurster) 8

9 Lit fluidisé : Séchage et enrobage (2) Tangential spray Buse de pulvérisation Spheronisation Plaque tournante Enrobage avec cire protectrice Optimisation : Débit Vitesse de rotation Charge T agent d enrobage T du lit. Extrusion Spheronisation - Séchage 9

10 II. Application des technologies de microencapsulation pour la formulation de probiotiques et mise au point d un coating entérique 10

11 Définition Probiotique Les probiotiques sont des microorganismes vivants qui lorsqu ils sont consommés en quantité suffisante confèrent des effets bénéfiques à la santé de l hôte - Vivants - Quantité requise: au moins 10 6 à 10 7 UFC par gramme du produit fini. Et une consommation quotidienne de 100g pour apprécier les effets bénéfiques - Effets bénéfiques à la santé de l hôte 11

12 Effets bénéfiques pour la santé Maintien de l équilibre de la flore intestinale Stimulation du système immunitaire Soulagement des troubles intestinaux Amélioration de la tolérance au lactose Effets bénéfiques Réduction du taux de cholestérol allégations de santé Preuves scientifiques (études in vitro, in vivo, et des tests cliniques) 12

13 Effets bénéfiques pour la santé (2) Mais depuis le 14 décembre 2012 l Union Européenne a supprimé les allégations de santé pour les probiotiques: preuves scientifiques lacunaires et contradictoires 13

14 Souche modèle :Lactobacillus plantarum Bactérie lactique à Gram positif, ph optimal de croissance 6.5, température optimale de croissance 37 C, anaérobie facultative Produits laitiers, viandes, légumes et aussi dans le tractus gastro-intestinal Lactobacille hétérofermentaire facultatif Sensible à l acidité Lb. plantarum 299v reconnue comme probiotique 14

15 Objectif Développer des formulations sèches de la bactérie Lactobacillus plantarum en vue de la protéger de l acidité gastrique et donc optimiser son accès à l intestin en quantité suffisante et métaboliquement active La microencapsulation de la biomasse dans une matrice d alginate et d amidon par la technique du Jet Cutter couplée au séchage en lit fluidisé et à un enrobage entérique 15

16 Méthodologie (1) Lactobacillus plantarum Culture en mode «Batch» sur milieu LAB, ph 6.5, 37 C en fermenteur Propagation Récolte de la biomasse Centrifugation Récolte de la biomasse après 4 heures de phase stationnaire Formulations T in = 30 C Débit de 175 à 80 m 3 /h Charge = 1 kg Encapsulation dans une matrice d alginate par la technique du Jet Cutter Séchage en lit fluidisé Enrobage des microsphères Concentration d agent enrobant Agents d enrobage Eudragit FS 30 D Eudragit L 100 Eudragit S 100 Eudragit L 30 D-55 16

17 Profil de croissance de Lactobacillus plantarum Densité optique (660 nm) Récolte Caractéristiques Temps de génération (h) Données 1.26 µ (h -1 ) 0.57 Poids sec (g/l) Consommation du glucose (g/l) Production d acide lactique (g/l) , Y x/s 0.13 Y p/s 0.86 Temps (heures) 17

18 Technique d encapsulation par le Jet Cutter Encapsulation de la biomasse dans une matrice d alginate Mélange: Biomasse «Lactobacillus plantarum» 15% p/v Solution d alginate de sodium 2% p/v Amidon (maïs/pois) 30% p/v comme agent de charge 18

19 Technique d encapsulation par le Jet Cutter CaCl 2 1% p/v 19

20 Reproductibilité du procédé de production N = 3 Viabilité résiduelle (%) Le séchage est l étape critique du procédé de microencapsulation 0 Fermenteur Centrifugation Mélange Billes humides Billes sèches 20

21 Forme et distribution en taille 70 Distribution massique (%) > 1000 Diamètre (µm) Microsphères sèches contenant Lb. plantarum 84% des microsphères possèdent une taille comprise entre 355 et 850 µm Conservation à 4 C sous vide: 64 à 72% de viabilité résiduelle après 50 à 100 jours 21

22 Enrobage entérique des microsphères Mise au point réalisée sur des billes d amidon de µm Taux d enrobage: 12 à 15% (p/p) (Vandamme et al., 2007) 22

23 Enrobage entérique des microsphères (données communiquées par Evonik) Matériaux d enrobage ph de dissolution Site de libération dans l intestin Eudragit L 30 D-55 ph >5.5 Duodénum Eudragit L 100 ph> 6.0 Jéjunum Eudragit S 100 ph >7.0 Iléon/Côlon Eudragit FS 30 D ph >7.0 Iléon/Côlon (1)Oesophage (2)Estomac (3)Duodénum (4) Jéjunum + iléon (5)Caecum (6) Appendice (7) Côlon (8) Rectum (9) Anus (Cuillerier et Marteau, 2002) 23

24 Influence de l enrobage sur la viabilité de Lb. plantarum Matériaux d enrobage Viabilité dans les billes avant enrobage(ufc/g sec) Viabilité dans les billes après enrobage (UFC/g sec) Viabilité résiduelle (%) Eudragit FS 30 D (1.7±0.5)10 10 (1.6±0.5)10 9 (9.5±3.2) Eudragit L 100 (4.4±1.9)10 10 (1.9±1.1) ±3.9 Eudragit S 100 (2.5±0.3)10 10 (1.1±0.1) ±4.5 Eudragit L 30 D-55 (1.8±0.3)10 10 (1.7±0.05) ±2.5 Taux d enrobage 12 à 15% p/p 24

25 Evaluation de la qualité de l enrobage Test de résistance gastrique (HCl 0.1M, ph 1.2) durée 2 h T = 37 C Test de désintégration après addition de phosphate de sodium tribasique (0.2 M). Trois ph testés pour simuler les conditions rencontrées dans l intestin: 5.5; 6.5; 7.5 durée 1 h T = 37 C Matériaux d enrobage Valeurs du fournisseur Dissolution à ph 5.5 Dissolution à ph 6.5 Dissolution à ph Microsphères non enrobées Eudragit FS 30 D Eudragit L 100 Eudragit S 100 Eudragit L 30 D-55 / ph > ph > ph > ph >

26 Enrobage entérique: Evaluation de la viabilité de Lb. plantarum après tests de résistance gastrique Microsphères non enrobées Microsphères enrobées à l Eudragit L 100 Microsphères enrobées à l Eudragit S 100 Perte totale de viabilité de Lb. plantarum encapsulé dans des microsphères non enrobées ainsi que celles enrobées à l Eudragit L 100 et à l Eudragit S 100 et ce pour les trois ph testés. 26

27 Evaluation de la viabilité de Lb. plantarum après tests de résistance gastrique - L30 D-55 Concentration en cellules viables avant incubation à ph 1.2 (UFC/g sec) Concentration en cellules viables après dissolution (UFC/g sec) Viabilité résiduelle (%) ph 5.5 (1.7±0.2)10 10 (1.1±0.2) ±10 (1.7±0.2)10 10 (1.6±0.3) ±16.6 Microsphères enrobées à l Eudragit L 30 D-55 L Eudragit L 30 D-55 est le meilleur agent d enrobage ph 6.5 offrant un bon compromis entre une bonne résistance (1.7±0.2)10 10 (1.5±0.1) ±7.5 gastrique et une bonne désagrégation au ph de ph 7.5 l intestin L Eudragit L 30 D-55 reste intègre après les deux heures d incubation à ph 1.2 Influence du ph de dissolution sur la viabilité à confirmer 27

28 Conclusions et perspectives Eudragit L 30 D-55: ph de désintégration mesuré correspond à celui rencontré dans le côlon (ph 7.5) optimiser le protocole de dissolution ( ph 6.5 à 7.0) Etude de la reproductibilité de l enrobage Réduction de la taille des particules : 100 à 200 µm Simulation du système digestif: ajout de sels biliaires et d enzymes digestifs 28

29 Objectif Développer des formulations sèches de la bactérie Lactobacillus plantarum en vue de la protéger de l acidité gastrique et donc optimiser son accès à l intestin en quantité suffisante et métaboliquement active La granulation / sphéronisation de la biomasse couplée au séchage en lit fluidisé et à un enrobage entérique 29

30 Méthodologie (2) Lactobacillus plantarum Culture en mode «Batch» sur milieu LAB, ph 6.5, 37 C en fermenteur Propagation Récolte de la biomasse Centrifugation Récolte de la biomasse après 4 heures de phase stationnaire Formulations Agents de charge Concentrations d antiagglomérant Formation des granules par extrusionsphéronisation Enrobage des granules Concentration d agent enrobant Agent d enrobage : Eudragit FS 30 D 30

31 Extrusion - spheronisation séchage en lit fluidisé: o Mélange: Biomasse Agent de charge : cellulose microcristalline 30% (p/p) Antiagglomérant : stéarate de Mg o Extrusion (filière 1,1 mm) o Spheronisation et séchage en lit fluidisé (T in = 30 C) Diam. : 0,5 à 1 mm Extrusion Viabilité résiduelle après séchage: 50 +/- 8% 31

32 Enrobage entérique: Microgranules de Lb. plantarum Echantillons Concentration initiale en cellules viables (UFC/ml) Concentration en cellules viables après désagrégation à ph 6.8 à 37 C (UFC/ml) Pâte de Lb. plantarum obtenue après centrifugation de la biomasse Microgranules Lb. plantarum formées par extrusion-sphéronisation Microgranules l intestin Lb. plantarum enrobées à l Eudragit FS 30D L enrobage confère aux microorganismes une excellente résistance à l acidité gastrique ainsi qu une désagrégation correcte des granules dans des conditions similaires à celles de Viabilité résiduelle après désagrégation: 66% 32

33 Remerciements Duynstee Céline Vandeville Anne-Catherine Bodo Elisabeth Tchonang Ponka Christelle Najjar Noura Tanimomo Jean 33

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