Plate-forme technique Interactions moléculaires

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1 Plate-forme technique Interactions moléculaires Consommables Biacore 3000 les plus utilisés Supports d'immobilisation Il existe différents supports d'interaction selon la chimie d'immobilisation : Nom du produit Sensor Chip CM5 (Research grade) Description La puce la plus utilisée pour l'immobilisation via la fonction -NH2-SH-CHO-OH Ou COOH (ligands de petites molécules organiques jusqu'aux protéines, acides nucléiques, carbohydrates) Référence du produit unitaire BR Sensor Chip CM4 (degré de carboxyméthylations 30%< à celui des CM5) A utiliser pour des échantillons contenant des contaminants à charge positive élevée (capacité d'immobilisation réduite : recommandée pour les ligands fishnig et les analyses de cinétique BR Sensor Chip CM3 (Chaines de Dextran plus courtes que CM5) Quand le partenaire d'interaction est de grande taille (>1 KD, cellules, virus..., cinétiques) (capacité d'immobilisation est 30% < CM5) BR Sensor Chip C1 (pour des applications spéciales) Quand le partenaire d'interaction est multivalent ou de grande taille BR Sensor Chip NTA (Acide Nitrilotriacetique immobilisé sur le Dextran de manière covalente) Immobilisation des molécules taguées avec un Tag Histidine (Hexahistidine...) NTA puissant chélateur d'ions métalliques (Ni 2+ ) BR Sensor Chip SA (streptavidine attachée de façon covalente à la surface du dextran) Sensor Chip L1 (molécules lipophiles attachées de façon covalente au Dextran) Sensor Chip HPA (liaison covalente de chaînes d'alkanethiol attachées directement au film d'or) Immobilisation des molécules biotinylées (procédure de biotinylation d'acides nucléiques bien établie : pratique pour immobiliser les acides nucléiques) -Immobilisation des molécules hydrophobes -Capture des vésicules lipidiques et liposomes (alternative au HPA pour l'étude des protéines membranaires et conseillée pour l'étude des protéines transmembranaires) BR BR Immobilisation de préparations membranaires BR

2 Réactifs de couplage : Amine Coupling Kit (couplage avec Chip CM5) Procédure d'immobilisation Thiol coupling kit (substitution de groupements carboxyles par introduction de groupements disulfide actives (PDEA) dans le Dextran) (couplage avec Chip CM5) PDEA Thiol Coupling reagent Procédure d'immobilisation GST Capture Kit Mouse Antibody Capture Kit Human Antibody Capture Kit Immobilisation covalente des molécules exprimant des groupements Amine primaires (réaction ester) Kit pour 30 à 50 immobilisations 750 mg 1-ethyl-3-(3- dimethylamino-propyl) carbodimide hydrochloride (EDC), 115 mg N- hydroxysuccimidine (NHS), 10.5 ml 1.0 M ethanolamine-hcl ph activation de surface par injection EDC/NHS (5-10 µl/min pendant 6-10 min) 2- immobilisation du ligand par injection (5-10 µl/min pendant 6-10 min) 3- inactivation des esters non couplés par injection d'éthanolamine (5-10 µl/min pendant 6-10 min) Immobilisation covalente des molécules via la réaction thioldisulfide via les groupements thiol natives ou introduite sur le ligand (méthode alternative au couplage Amine lorsque : - Le ligand est inactivé par ce type de couplage - Le ligand est une protéine acide (augmenter le point isoélectrique de la protéine) - Peu ou pas de fonction amine dans le ligand - Pas d'éléments réducteurs dans les tampons Introduction des groupements disulfides sur les groupements carboxyles du Dextran 90 mg cystamine dihydrochloride, 61 mg L-cysteine, 154 mg 1,4-dithioerythritol (DTE), 10.5 ml 1.0 M ethanolamine-hcl ph 8.5, 750 mg 1-ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC), 115 mg N-hydroxysuccinimide (NHS), 100 ml 0.1 M 2-(4-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) ph 5.0, 100 mg 2-(2-pyridinyldithio) ethaneamine hydrochloride (PDEA), 25 ml 0.1 M sodium acetate 1.0 M, sodium chloride ph 4.0, 25 ml 0.15 M sodium borate ph mg 2-(2-pyridinyldithio) ethaneamine hydrochloride (PDEA) activation de surface par injection EDC/NHS (5-10 µl/min pendant 2 min) 2- PDEA (introduction de groupements disulfides réactifs) 5-10 µl/min pendant 4 min 3- injection du ligand (contenant des groupements thiol) 5-10 µl/min pendant 6 à 7min 4- désactivation de groupements réactifs en excès par injection de solution Cysteine/NaCl 5-10 µl/min pendant 4 min Capture des protéines de fusion avec la GST Capture des IgG de souris Capture des IgG humains et humanisés Goat anti-gst antibody, 0.8 mg/ml in 75 l coupling solution, 5 ml positive control: recombinant GST (Schistosoma japonicum), 0.2 mg/ml in 100 l HBS-EP regeneration solution, 70 ml Anti-Mouse IgG antibodies, 1 mg/ml in 0.15 M NaCl, 50 l, Immobilization buffer, 1 ml, Regeneration solution, 95 ml Anti-Human IgG (Fc) antibody, 0.5 mg/ml in 0.15 M NaCl, 50 l, Immobilization buffer, 1 ml, Regeneration solution, 95 ml

3 Préparation des solutions de couplage Ligand EDC NHS En général 20 à 50 µg/ml dans le tampon d'immobilisation (en fonction du type d'application) 0.4 M 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide dans l'eau 0.1 M N-hydroxysuccinimide dans l'eau Ethanolamine 1 M ethanolamine-hcl ph 8.5 PDEA 80 mm 2-(2-pyridinyldithio) ethaneamine dans 0.1 M sodium borate ph 8.5. à utiliser dans les 30 min de préparation Cysteine/NaCl 50 mm cysteine and 1 M NaCl dans 0.1 M sodium acetate, ph 4.0 Cystamine 40 mm cystamine dihydrochloride dans 0.1 M sodium borate ph 8.5 DTE 0.1 M dithioerythritol ou dithiothreitol in 0.1 M sodium borate ph 8.5 PDEA/NaCl 20 mm 2-(2-pyridinyldithio) ethaneamine et 1 M NaCl dans 0.1 M sodium acetate ph 4.0 Solutions de régénération des puces Regeneration Scouting Kit Contient 10 solutions prêtes à utiliser 11 ml ethylene glycol (p.a.), 11 ml 10 mm glycine-hcl ph 1.5, 11 ml 10 mm glycine-hcl ph 2.0, 11 ml 10 mm glycine-hcl ph 2.5, 11 ml 10 mm glycine-hcl ph 3.0, 11 ml 4.0 M magnesium chloride, 11 ml 0.2 M sodium hydroxide, 11 ml 0.5% sodium dodecyl sulphate (SDS), 11 ml 5.0 M sodium chloride, 20 ml Surfactant P

4 Tampons de course : HBS-EP HBS-P HBS-N 0.15 M NaCl 3 mm EDTA % v/v Surfactant P M NaCl 6 x 200 ml x 200 ml % v/v Surfactant P M NaCl 6 x 200 ml Additifs : NSB reducer Surfactant P20 Réduit les liaisons non spécifiques au carboxyméthyl à la surface du Dextran Utilisable pour 650 échantillons Plolyoxyéthylenesorbitan : surfactant non ionique recommandé pour l'inclusion dans les tampons Carboxyméthyl Dextran Sodium Salt (10 mg/ml) dans 0.15 M NaCl contenant 0.02% sodium azide (NaN3), 10 ml ml Entretien du système BIAmaintenance Kit Kit pour le nettoyage de l'appareil après usage, utilisable sur 6 mois pour un usage normal de l'appareil BIAtest solution (65 ml), BIAnormalizing solution (30 ml), BIAdesorb solution 1 (90 ml), BIAdesorb solution 2 (90 ml), BIAdisinfectant solution (conc.) (10 ml), Sensor Chip Maintenance 98.00

5 Accessoires Tubes : Tubes en verre, 9 mm Ø 1.8 ml Tubes en verre 16 mm Ø 4.0 ml Tube en plastique, 7 mm Ø Tube plastique, 11 mm Ø 0.8 ml microtubes en plypropylene 1.5 ml microtubes en plypropylene Tube plastique, 15 mm Ø 4.0 ml tubes en plypropylene Tube plastique et bouchons 11 mm Ø A utiliser uniquement que pour le stockage et pas dans l'instrument 500 tubes et bouchons Bouchons : Bouchons 9 mm Bouchons et septa 16 mm Bouchons 16 mm Septa pénétrables à travers les bouchons Bouchons à vis en polypropylène et septa en silicone ou polytétrafluoréthylène. Peuvent être utilisés après usage. (ces bouchons ne sont à utiliser que pour le stockage ensemble avec BR ne pas utiliser dans l appareil) 500 bouchons bouchons et 500 septa bouchons Bouchons 7 mm Polyethylène 1000 bouchons