Hématologie biologique en 2013:
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- Valérie Normandin
- il y a 8 ans
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1 Hématologie biologique en 2013: du microscope au séquençage de nouvelle génération à haut débit. L.Mauvieux Laboratoire d Hématologie EA3430 Faculté de Médecine de Strasbourg Pôle de biologie CHRU Strasbourg
2 ACNBH ODPC N ème Colloque National des Biologistes des Hôpitaux Strasbourg, 1 4 octobre 2013 DECLARATION D INTERET DANS LE CADRE DE MISSIONS DE FORMATION REALISEES POUR L ACNBH Pr Laurent Mauvieux Exerçant au CHU de Strasbourg déclare sur l honneur ne pas avoir d'intérêt, direct ou indirect (financier) avec les entreprises pharmaceutiques, du diagnostic ou d édition de logiciels susceptible de modifier mon jugement ou mes propos, concernant le DMDIV et/ou le sujet présenté.
3 L invention de la microscopie Antoni van Leeuwenhoek ( ) X300, résolution 1,4µm Arcana Natura Detecta, Delphes, 1695
4 Georges Hayem ( ) Nombreux travaux de physiologie sanguine Elabore les principes fondamentaux de l hématimétrie Caractérise les anémies Dr Cholera
5 Les automates d hématologie Technologies utilisées Focalisation hydrodynamique Impédance Radiofréquence Spectrophotométrie Diffraction laser Fluorescence laser Cytochimie (perox) numération et volumes complexité cellulaire mesure Hb numération, volumes, contenus contenu, ARN, ADN, marqueurs de surface contenu Sysmex XN
6 La cytométrie en flux développée en 1968 dans l université de Münster et commercialisé par Phywe TM en 1969 FACS BD 1974 EPICS Coulter 1977 Très forte intégration de analyseurs 10 couleurs, 4 lasers Gallios 18 couleurs, 5 lasers BD LSRFortessa
7 La cytométrie en flux en hématologie Etude des sous-populations lymphocytaires Onco-hématologie: Typage des hémopathies score de Matutes (syndromes lymphoprolifératifs), score EGIL (LA) Recherche des cibles thérapeutiques: Rituximab Mabthera (anti-cd20) Alembtuzumab Campath (anti-cd52) Gemtuzumab (anti-cd33) Contenu en ADN (cycle cellulaire / LAL de l enfant) Diagnostic des hémoglobinuries paroxystiques nocturnes (déficit prot Gpi) Recherche de transporteurs de drogues (P-gp / phénotype MDR) Fonctions plaquettaires, microparticules membranaires.
8 3 applications récentes Recherche d anomalies des protéines membranaires du globule rouge Recherche de l activation fonctionnelle de p53 Maladie résiduelle dans les leucémies
9 1) Sphérocytose héréditaire Test àl Eosine 5 maléimide (EMA) anémie hémolytique chronique déficit de protéines membranaires du GR => perte membranaire CCMH augmentée (>36g/dl) présence de sphérocytes sur le frottis sanguin Examen de référence: Ektacytométrie (Kremlin Bicêtre) Protéine Bande 3, Ankyrin, Protéine 4.2, Spectrine Maladie autosomique dominante dans 75% des cas; 1/5000 naissances
10 Test àl EMA Colorant fluorescent se fixant aux protéines Band3 Coloration proportionnelle àla quantité de protéine Band 3, et donc à la surface membranaire Un défaut de 10% de fluorescence est en faveur du diagnostic Quelques faux positifs: elliptocytose et pyropoikilocytose, rares dysplasies congénitales Evènements Sphérocytose Fluorescence Témoin Test àl EMA Résistance Globulaire Pink test Sensibilité % % 91% Sensibilité % 71% Conservation préanalytique 72 heures 2 heures 2 heures
11 2) Etude fonctionnelle de la voie p53 dans les LLC Fludarabine p53: facteur de transcription induisant l apoptose ou l arrêt du cycle cellulaire en réponse à l altération de l ADN Fréquentes délétions et mutations de TP53 dans les LLC (FISH; 17p) Associé à: Une instabilité chromosomique une résistance àla fludarabine Confèrent un pronostic défavorable Incorporation dans l ADN Cassures double brin Activation de la voie p53 Apoptose
12 Etude fonctionnelle de TP53 LLC après 24h de culture cellulaire en présence d Etoposide et de Nutilin 3a Profil normal (induction TP53) Profil anormal (haut niveau basal, faible induction) Profil anormal (aucune induction) M Le Garff Tavernier et al., Blood Cancer Journal (2011)
13 3) Maladie résiduelle dans les leucémies aigues myéloïdes par CMF Virtuellement applicable àtous les patients Y compris en l absence de marqueurs moléculaires Expression des marqueurs d immaturité (CD34; CD117; CD133) Expression d antigènes aberrants: Lignée Asynchronisme de maturation Expression augmentée ou diminuée Rapide, sensible (seuil 0,1%)
14 517 patients inclus 27 centres LAM faible risque MRD induction 2 mois LAM risque intermédiaire MRD induction 2 mois LAM bon risque élevé
15 Vers le futur: la cytométrie de masse? 1 Anticorps couplés àdes isotopes stables de métaux Europium Strontium 2 Dont la masse peut être mesurée très précisement par spectrométrie de masse Scott Tanner DVScience TM
16 L idée: coupler la spectrométrie de masse atomique avec le marquage cellulaire Cellules marquées introduites dans torche à plasma Les masses atomiques des ions des métaux sont analysés par spectrométrie de masse jusqu à 100 Ac différents analysées simultanément (100,000 cellules en 4 minutes) DVScience Cytof II TM
17 Mass spectrometry analysis Analyse multidimensionnelle Immunophénotype Signalisation cellulaire Expression de cytokines
18 L étude du génome 1) Cytogénétique 2) Biologie moléculaire
19 Etapes de la cytogénétique 1888: Waldeyer découvre les chromosomes 1902: Theodor Boveri propose que les tumeurs pourraient être liées àla mauvaise ségrégation des chromosomes Années 50: Utilisation de techniques de culture cellulaire Banding en 1969=> identification de la t(9;22) dans la LMC 1977: essor de la FISH 2004: premiers CGH Array (comparative genomic hybridization)
20 Origine génétique acquise des leucémies: remaniements génomiques
21 Cytogénétique moléculaire Leucémie myéloïde chronique FISH interphasique BCR ABL Peinture chromosomique MULTI FISH
22 Classification OMS (WHO) 2001/2008 CBF, RARa Caryotype normal Anomalies de MLL, del 5q, del 7
23 Biologie moléculaire des hémopathies malignes Approches: PCR, RT PCR et séquençage Diagnostic: Recherche de transcrits de fusion: ex. BCR ABL; Mutations ex: JAK2 / polyglobulies primitives Expression anormales de gènes ex: Cycline D1/ LNH du manteau Pronostic Mutation du domaine Tyr kinase d ABL / LMC résistantes au GLIVEC Mutations de FLT3, CBF dans les LAM classification WHO 2008 Suivi des patients : maladie résiduelle: Quantification transcrit BCR ABL Recherche de clonalité lymphoide
24 Les limites de la «biomol» Onéreux, long Cibles en augmentation constante (hématologie et tumeurs solides) Tests compagnons pour les traitements Marqueurs «théranostiques» Organisation des plate formes ont trouvé leurs limites Besoin d approches plus puissantes, plus globales
25 Approche globale le séquençage «génome entier» Next Generation Sequencing (NGS) Recherche des anomalies génétiques (variants) àl échelon du génome Séquençage du génome entier (whole genome sequencing) Séquençage direct des ARNm (RNA seq) Séquençage des microarn Séquençage des séquences d ADN methylées (CHIP seq)
26 Séquençage «Sanger» Dideoxynucléotides bloquant l élongation d une matrice d ADN Radiomarqués: P 32, P 33 Fluorescents prix Nobel de chimie en 1980
27 Séquençons le Génome Humain Log (prix) : Human Genome Project (HUGO) 3 milliard $, 10 ans James Watson's genome : 454 1M$, 3 months 2001: Celera 300M$, 3 years 2008: ABI SOLiD 60K$, 2 weeks 2009: Illumina, Helicos 40-50K$ 2010: 6K$, 2014: 1000$?, <24 hrs?
28 Le séquençage Haut Débit, c est quoi? Approche miniaturisée: Densité de séquences: ~10.000/ mm2 Massivement parallèle: Plusieurs millions de séquençage simultanés possibles, voire plusieurs milliards Productions de quantités impressionnantes de données: de 35 millions de bases à 600 Gb par réaction de séquençage («run») Taille du génome humain ~3 Gb de paires de nucléotides
29 Approche 454 (Roche Ltd) Etapes principales Fragments d ADN capturés sur une bille PCR en émulsion (huile/eau) Réaction de pyroséquençage: production de photons capturés par une caméra CCD Production d un «flowgram»
30 Solexa/ Illumina Fragments d ADN capturés sur une surface solide Chaque brin est multiplié (clusters) Chaque cluster correspond à1 séquence Capture par caméra CCD
31 Approche semi conducteurs Proton /PGM (Life technologies ) Incorporation d un nucléotide Génération d un proton H+ 1 proton = 1 base, signal intégré dans un microprocesseur
32 Particularités du NGS «profondeur» de séquençage «Etiquettes» des ADN: Multiplexage (=> 96) Ciblage possible des régions séquencées: «amplicons» «Capture»de séquences par sondes biotinylées Combinaisons pour optimiser la capacité de séquençage: nombre de cibles nombre d ADN différents Profondeur de séquençage souhaitée
33 Analyses des données Importance d une équipe: Techniciens Biologistes Bio informaticiens Informaticiens
34 1) Données brutes: format Fastq + EAS582_157:6:1:1:1606/1 NCTGGCACCTTGATTTTGGACTTCCCAGCCTCCAGAACTGTGAG + Score de qualité Sequence Nom de l appareil Cellule de séquençage Zone de la cellule de séquençage Coordonnées x du cluster Coordonnées y du cluster Index de multiplexage Simple ou double lecture
35 2) Alignement des séquences A partir de séquences de référence du génome humain (Hg19) algorithmes Bowtie Smith Waterman BWA Production d un fichier «.bam»
36 3) Recherche de «variants» génétiques
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39 Ré analyse informatique du patient précédent: identification d une mutation de l AA 723 de DNMT3A (DNA methyl transférase 3) Décalage du cadre de lecture => codon stop prématuré
40 Analyse des mutations de DNMT3A chez 188 patients
41 Survie chez les patients atteints de LAM selon le statut de DNMT3A
42 200 patients avec cytogénétique intermédiaire ou favorable étudiés (génomes entiers de leucémies séquencés ou exome) Séquençage de l ARNm, de l ADN méthylé(chip Seq) + contrôle génome constitutionnel
43 Résultats 2315 variants génétiques identifiés 270 insertions ou délétions de petite taille MAIS: Seuls 23 gènes sont le siège de mutations récurrentes (mutations «driver») En moyenne 3 mutations driver nécessaires pour qu une LAM surviennent jusqu à 3 sous clones identifiés (50% avec 1 sous clone) Autres mutations: «passenger»
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45 Catégorisation des anomalies génétiques des LAM 1) Fusions génétiques impliquant des facteurs de transcription 2) Gènes suppresseurs de tumeurs 3) Gènes impliqués dans la méthylation de l ADN 4) Gènes impliqués dans le transduction du signal 5) Gènes de la différenciation myéloïde 6) Gènes modifiant la chromatine 7) Cohésines 8) Spliceosome
46 Conclusions L Hématologie en 2013: Repose toujours sur une routine de qualité: Automates performants Revue raisonnée des frottis sanguins /bonne coloration Prise en charge en milieu spécialisé des hémopathies malignes diagnostic: faisceau d arguments cliniques et biologiques Orientation affirmée vers une médecine de + en + personnalisée
47 Merci pour votre attention Laboratoire d Hématologie des HUS A Eischen AC Galoisy L Miguet C Mayeur Rousse L Monier Laboratoire de recherche EA3430 D. Guenot N. Perrusson Plate forme hospitalière de séquençage de l Institut régional du Cancer de Strasbourg
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