ISOLEMENT DU PEPSINOGENE EQUIN

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1 ÉCOLE NATIONALE VETERINAIRE D ALFORT Année 2006 ISOLEMENT DU PEPSINOGENE EQUIN THESE Pour le DOCTORAT VETERINAIRE Présentée et soutenue publiquement devant LA FACULTE DE MEDECINE DE CRETEIL Le par Elsa, Gisèle, Huguette BOCQUET Née le 3 janvier 1979 à Bully-les-Mines (Pas-de-Calais) JURY Président : M. Professeur à la Faculté de Médecine de CRETEIL Membres Directeur : Bianca Carstanjen Maître de conférences à l Ecole Nationale Vétérinaire d Alfort Assesseur : Stéphane Blot Maître de conférences à l Ecole Nationale Vétérinaire d Alfort Invité : Benoît Rémy Service de physiologie de la reproduction - Université de Liège (Belgique)

2 LISTE DES MEMBRES DU CORPS ENSEIGNANT Directeur : M. le Professeur COTARD Jean-Pierre Directeurs honoraires : MM. les Professeurs MORAILLON Robert, PARODI André-Laurent, PILET Charles Professeurs honoraires: MM. BORDET Roger, BUSSIERAS Jean, LE BARS Henri, MILHAUD Guy, ROZIER Jacques DEPARTEMENT DES SCIENCES BIOLOGIQUES ET PHARMACEUTIQUES (DSBP) Chef du département : M. BOULOUIS Henri-Jean, Professeur - Adjoint : M. DEGUEURCE Christophe, Professeur -UNITE D ANATOMIE DES ANIMAUX DOMESTIQUES - UNITE D HISTOLOGIE, ANATOMIE PATHOLOGIQUE Mme CREVIER-DENOIX Nathalie, Professeur M. CRESPEAU François, Professeur M. DEGUEURCE Christophe, Professeur* M. FONTAINE Jean-Jacques, Professeur * Mlle ROBERT Céline, Maître de conférences Mme BERNEX Florence, Maître de conférences M. CHATEAU Henri, Maître de conférences Mme CORDONNIER-LEFORT Nathalie, Maître de conférences -UNITE DE PATHOLOGIE GENERALE, MICROBIOLOGIE, IMMUNOLOGIE Mme QUINTIN-COLONNA Françoise, Professeur* M. BOULOUIS Henri-Jean, Professeur -UNITE DE PHYSIOLOGIE ET THERAPEUTIQUE M. BRUGERE Henri, Professeur Mme COMBRISSON Hélène, Professeur* M. TIRET Laurent, Maître de conférences -UNITE DE PHARMACIE ET TOXICOLOGIE Mme ENRIQUEZ Brigitte, Professeur * M. TISSIER Renaud, Maître de conférences M. PERROT Sébastien, Maître de conférences -DISCIPLINE : BIOCHIMIE M. MICHAUX Jean-Michel, Maître de conférences - UNITE DE VIROLOGIE M. ELOIT Marc, Professeur * Mme LE PODER Sophie, Maître de conférences -DISCIPLINE : PHYSIQUE ET CHIMIE BIOLOGIQUES ET MEDICALES M. MOUTHON Gilbert, Professeur -DISCIPLINE : GENETIQUE MEDICALE ET CLINIQUE Melle ABITBOL Marie, Maître de conférences -DISCIPLINE : ETHOLOGIE M. DEPUTTE Bertrand, Professeur -DISCIPLINE : ANGLAIS Mme CONAN Muriel, Ingénieur Professeur agrégé certifié DEPARTEMENT D ELEVAGE ET DE PATHOLOGIE DES EQUIDES ET DES CARNIVORES (DEPEC) Chef du département : M. FAYOLLE Pascal, Professeur - Adjoint : M. POUCHELON Jean-Louis, Professeur - UNITE DE PATHOLOGIE CHIRURGICALE - UNITE DE MEDECINE M. FAYOLLE Pascal, Professeur * M. POUCHELON Jean-Louis, Professeur* M. MAILHAC Jean-Marie, Maître de conférences Mme CHETBOUL Valérie, Professeur M. MOISSONNIER Pierre, Professeur M. BLOT Stéphane, Maître de conférences Mme VIATEAU-DUVAL Véronique, Maître de conférences M. ROSENBERG Charles, Maître de conférences Mlle RAVARY Bérangère, Maître de conférences (rattachée au DPASP) Mme MAUREY Christelle, Maître de conférences contractuel M. ZILBERSTEIN Luca, Maître de conférences contractuel M. HIDALGO Antoine, Maître de conférences contractuel - UNITE DE CLINIQUE EQUINE M. DENOIX Jean-Marie, Professeur M. AUDIGIE Fabrice, Maître de conférences* Mme CARSTANJEN Bianca, Maître de conférences contractuel Mme GIRAUDET Aude, Professeur contractuel Melle VIREVIALLE Hameline, Maître de conférences contractuel -UNITE DE REPRODUCTION ANIMALE Mme CHASTANT-MAILLARD Sylvie, Maître de conférences* (rattachée au DPASP) M. NUDELMANN Nicolas, Maître de conférences M. FONTBONNE Alain, Maître de conférences M. REMY Dominique, Maître de conférences (rattaché au DPASP) M. DESBOIS Christophe, Maître de conférences Melle CONSTANT Fabienne, AERC (rattachée au DPASP) Melle LEDOUX Dorothée, Maître de conférences Contractuel (rattachée au DPASP) - UNITE DE RADIOLOGIE Mme BEGON Dominique, Professeur* Mme STAMBOULI Fouzia, Maître de conférences contractuel -UNITE D OPHTALMOLOGIE M. CLERC Bernard, Professeur* Melle CHAHORY Sabine, Maître de conférences contractuel - UNITE DE PARASITOLOGIE ET MALADIES PARASITAIRES M. CHERMETTE René, Professeur M. POLACK Bruno, Maître de conférences* M. GUILLOT Jacques, Professeur Mme MARIGNAC Geneviève, Maître de conférences contractuel -UNITE DE NUTRITION-ALIMENTATION M. PARAGON Bernard, Professeur * M. GRANDJEAN Dominique, Professeur Mme BLANCHARD Géraldine, Professeur contractuel DEPARTEMENT DES PRODUCTIONS ANIMALES ET DE LA SANTE PUBLIQUE (DPASP) Chef du département : M.MAILLARD Renaud, Professeur - Adjoint : Mme DUFOUR Barbara, Maître de conférences -UNITE DES MALADIES CONTAGIEUSES M. BENET Jean-Jacques, Professeur* M. TOMA Bernard, Professeur Mme HADDAD/ H0ANG-XUAN Nadia, Maître de conférences Mme DUFOUR Barbara, Maître de conférences -UNITE D HYGIENE ET INDUSTRIE DES ALIMENTS D ORIGINE ANIMALE M. BOLNOT François, Maître de conférences * M. CARLIER Vincent, Professeur M. CERF Olivier, Professeur Mme COLMIN Catherine, Maître de conférences M. AUGUSTIN Jean-Christophe, Maître de conférences - UNITE DE ZOOTECHNIE, ECONOMIE RURALE M. COURREAU Jean-François, Professeur M. BOSSE Philippe, Professeur Mme GRIMARD-BALLIF Bénédicte, Professeur Mme LEROY Isabelle, Maître de conférences M. ARNE Pascal, Maître de conférences M. PONTER Andrew, Maître de conférences* - UNITE DE PATHOLOGIE MEDICALE DU BETAIL ET DES ANIMAUX DE BASSE-COUR M. MILLEMANN Yves, Maître de conférences* Mme BRUGERE-PICOUX Jeanne, Professeur M. MAILLARD Renaud, Maître de conférences M. ADJOU Karim, Maître de conférences - DISCIPLINE : BIOSTATISTIQUES M. SANAA Moez, Maître de conférences Mme CALAGUE, Professeur d Education Physique * Responsable de l Unité AERC : Assistant d Enseignement et de Recherche Contractuel

3 A Monsieur le Professeur Professeur à la faculté de médecine de Créteil, Qui nous a fait l honneur d accepter la présidence de notre jury de thèse. Hommages respectueux. A Madame le Docteur Bianca CARSTANJEN Maître de conférences à l Ecole Nationale Vétérinaire d Alfort, Qui m a fait l honneur de diriger et corriger ce travail. Qu elle trouve ici l expression de ma reconnaissance et de mon plus profond respect. A Monsieur le Docteur Stéphane BLOT Maître de conférences à l Ecole Nationale Vétérinaire d Alfort, Pour l attention qu il a portée à l examen de ce travail. Qu il trouve ici l expression de mes sincères remerciements.

4 Table des matières Table des illustrations....5 Introduction 7 1- Partie bibliographique L'estomac du cheval: généralités Anatomie Conformation extérieure Conformation intérieure Rapports Moyens de fixité Vaisseaux et nerfs Artères Veines Vaisseaux lymphatiques Nerfs Histologie Séreuse Musculeuse Sous-muqueuse Muqueuse Muqueuse proventriculaire Muqueuse fundique Muqueuse cardiale Muqueuse pylorique Physiologie Activité digestive microbienne intra-gastrique Sécrétion Cellules productrices Cellules pariétales Cellules principales Autres cellules Régulation de la sécrétion gastrique Régulation de la production d HCl Phases de sécrétion gastrique Inhibition de la sécrétion gastrique Motricité Principales affections de l'estomac du cheval Syndrome des ulcères gastriques équins Etiopathogénie Epidémiologie Signes cliniques Diagnostic Traitement Prophylaxie Parasitisme

5 Gastérophilose équine Spiruroses digestives ou habronémoses... gastriques des Equidés Trichostrongylose du cheval Impaction / dilatation de l estomac Impaction gastrique Dilatation gastrique aiguë Néoplasie gastrique Le pepsinogène Propriétés physiques et chimiques des pepsinogènes et pepsines Poids moléculaires Composition en acides aminés Propriétés physiques Groupements C- et N-terminaux Structures secondaire et tertiaire Autres propriétés chimiques Sécrétion du pepsinogène La cellule peptique Distribution des cellules principales et. du pepsinogène dans la muqueuse Embryologie Lésion et régénération Relation structure-fonction de la cellule peptique Synthèse et sécrétion Mécanismes Effets endocrines Sécrétion du pepsinogène Considérations générales Stimulus commun Stimulation d un système Stimuli simultanés Inhibition et stimulation simultanées Inhibition secondaire Les stimuli «dominant» et «dominé» Mécanismes cellulaires de. la stimulation de la sécrétion Sécrétion basale Stimulation de la sécrétion Mécanismes cholinergiques Effets de la dénervation Histamine Stimuli hormonaux Syndrome Zolinger-Ellison L antre pylorique comme source de sécrétagogue Phase intestinale de la sécrétion gastrique Autres stimuli Inhibition de la sécrétion de pepsinogène Influences endocrines sur la sécrétion gastrique Hypophyse antérieure

6 Cortex surrénalien Autres substances endocrines Etudes cliniques de la sécrétion de.. pepsinogène gastrique Stimulants Sexe et âge Variations normales Ulcère duodénal Ulcère gastrique Tumeur gastrique Gastrite Anémie pernicieuse Autres anémies Le pepsinogène dans le sang et l urine Activation du pepsinogène en pepsine Dosages du pepsinogène Méthodes protéolytiques Méthodes immunologiques Dosages radioimmunologiques Dosage par la méthode ELISA Diffusion sur gel d agarose Description des méthodes utilisées dans l étude Précipitation des protéines Généralités Précipitation aux sels Dialyse Séparation des protéines par adsorption Chromatographie échangeuse d ions Chromatographie par adsorption Dosages Dosage des protéines par la méthode de Lowry Dosage du pepsinogène par la méthode Dorny Electrophorèse Généralités Préparation et déroulement d une électrophorèse sur gel de polyacrylamide Partie travail personnel Matériel et méthodes Préparation de la muqueuse glandulaire Origine Préparation de la muqueuse Précipitation des protéines Chromatographie Résultats Préparation de la muqueuse glandulaire Précipitation des protéines Résultats des différentes chromatographies Chromatographie sur colonne DEAE Séphadex A Chromatographie sur colonne DEAE Céramic

7 Chromatographie sur colonne hydroxyapatite Electrophorèse Discussion Comparaison des différentes purifications du pepsinogène équin Intérêt du dosage du pepsinogène sanguin chez le cheval..80 Conclusion...84 Bibliographie

8 Table des illustrations Figures Figure 1 : Conformation extérieure de l estomac du cheval (d après Barone, 1984) Figure 2 : Conformation intérieure et répartition des différents types de muqueuse de l estomac du cheval (d après Barone, 1984) Figure 3 : Organes abdominaux de la région diaphragmatique du cheval, vue caudale après isolement en bloc par désinsertion du diaphragme (d après Barone, 1984) Figure 4 : Musculature gastrique du cheval (d après Barone, 1984) Figure 5 : coupe transversale schématique de la muqueuse fondique de cheval (d après Barone, 1984) Figure 6 : Différents intervenants de la stimulation de la sécrétion gastrique et leurs relations (d après Lefrançois et Tiret, 2000) Figure 7 : Différents intervenants de l inhibition de la sécrétion gastrique et leurs relations (d après Lefrançois et Tiret, 2000) Figure 8 : Différents intervenants de la stimulation de la motricité gastrique et leurs relations (d après Lefrançois et Tiret, 2000) Figure 9 : Différents intervenants de l inhibition de la motricité gastrique et leurs relations (d après Lefrançois et Tiret, 2000) Figure 10 : Relation entre les structures du pepsinogène, de la pepsine et des autres molécules formées au cours de la conversion du pepsinogène en pepsine (d après Herriott, 1962) Figure 11 : Principe de la dialyse (d après Stryer, 1992) Figure 12: Principe de la résine échangeuse d anions (d après Stryer, 1992) Figure 13: Appareillage et gel d électrophorèse (d après Stryer, 1992) Figure 14 : Profil d'élution de la DEAE Céramic I (d après Benoît Rémy, 2005) Figure 15 : Profil d'élution de la colonne hydroxyapatite (d après Benoît Rémy, 2005) Figure 16 : Electrophorèse monodimensionnelle SDS-PAGE du chargement et des différents pics obtenus après passage sur colonne DEAE céramic. La ligne STD montre les standards de masse moléculaire (d après Benoît Rémy, 2005) - 5 -

9 Figure 17 : Electrophorèse monodimensionnelle SDS-PAGE du chargement et des différents pics obtenus après passage sur colonne d'hydroxyapatite. La ligne STD montre les standards de masse moléculaire (d après Benoît Rémy, 2005) Photos Photo 1 : Images endoscopiques normales et pathologiques de l estomac du cheval (a : muqueuses squameuse (blanchâtre) et glandulaire (rose foncée) normales d un cheval adulte ; b : idem pour un poulain ; c : desquamation de la muqueuse gastrique chez un poulain de 14 jours ; d : ulcération extensive de la muqueuse squameuse chez un cheval adulte ; e : ulcères sanguinolents de la muqueuse squameuse chez un adulte ; f : ulcère chronique (C), aigu (A) de la muqueuse squameuse et ulcère de la muqueuse glandulaire (GU) ; g : sévère ulcération de la muqueuse non glandulaire chez un poulain de 4 mois) (d après Murray, 1997) Photo 2 : Larves L3 de Gasterophilus spp dans l estomac d un poulain observé au cours de l autopsie (d après Elsa Bocquet) Photo 3 : Image endoscopique de carcinome épidermoïde gastrique (flèches) chez un cheval (d après Vatistas et al., 1997) Tableaux Tableau 1 : Mesure des quantités de protéines et de protéases dans les différents précipités au sulfate d ammonium Tableau 2 : Résultats obtenus à partir des dosages des différentes fractions de la chromatographie sur la colonne DEAE Séphadex A25 Tableau 3 : Résultats obtenus à partir des dosages des différentes fractions de la chromatographie sur la colonne DEAE Céramic Tableau 4 : Résultats obtenus à partir des dosages des différentes fractions de la chromatographie sur la colonne hydroxyapatite Tableau 5 : Tableau comparatif des deux études sur l isolement du pepsinogène équin publiées dans la littérature avec la nôtre - 6 -

10 Introduction Le cheval peut être atteint de différentes affections gastriques de fréquence et de gravité variables. En premier lieu, le syndrome d ulcères gastriques équins est rencontré couramment chez les chevaux de tout âge mais touche plus particulièrement les jeunes chevaux de course et les poulains (Murray et al., 1990 ; Murray et al., 1996). Les signes cliniques accompagnant ce syndrome peuvent être absents dans les cas où la lésion est découverte par gastroduodénoscopie ou nécropsie dans un but prospectif, ou constituer un ensemble de symptômes non spécifiques caractérisé par de la faiblesse, de l amaigrissement, de l inconfort, un appétit variable et des coliques ou des diarrhées récurrentes ; dans les cas les plus graves, une perforation suivie d une péritonite peuvent survenir. Par ailleurs, l estomac peut être l objet d une contamination parasitaire par des larves du genre Gasterophilus spp le plus souvent, Habronema spp ou Trichostrongylus spp. Ces infestations s accompagnent d amaigrissement, de troubles digestifs (colique ou diarrhée) voire de péritonite dans les cas les plus sévères (Beugnet, 2003 ; Bussiéras et Chermette, 1995). Enfin il existe des néoplasies gastriques qui sont rares et le plus souvent incurables (Tamzali, 2003). Ces entités pathologiques gastriques se traduisent par une atteinte de l intégrité de la muqueuse et par conséquent par une libération de plusieurs composés cellulaires. En particulier le pepsinogène qui est le précurseur d une enzyme protéolytique, la pepsine, est activé en milieu acide gastrique après avoir été sécrété par les cellules principales. Cette substance fait l objet de tests spécifiques de type ELISA ou radio-immunologie, utilisés avec succès en médecine humaine pour le diagnostic d affections gastriques notamment des ulcères. En raison du manque d anticorps spécifiques d espèce, le dosage du pepsinogène n est pas rapporté comme étant une technique diagnostique fiable et clairement établie chez le cheval, la vache et le mouton. De fait, l examen endoscopique de l estomac représente la seule méthode valable pour le diagnostic des ulcères, des néoplasies et dans une moindre mesure du parasitisme. Cependant l équipement requis et la réalisation technique de l acte sont des limites non négligeables pour le praticien non spécialiste. L objectif de cette étude est d isoler et de purifier le (ou les) pepsinogène(s) du cheval avec pour but, dans un deuxième temps, la production d anticorps spécifiques mis en œuvre dans des tests diagnostiques d affections gastriques. Nous nous intéressons d abord aux données déjà acquises sur le pepsinogène ainsi qu à quelques données générales sur l estomac puis à l explication du principe des différentes techniques employées. Dans un deuxième temps, nous détaillons le protocole expérimental que nous avons mis en œuvre ainsi que les résultats obtenus. Enfin nous évoquons l interprétation des résultats, leur qualité et une comparaison avec ceux acquis dans les études précédentes

11 1- Partie bibliographique 1-1 L estomac du cheval : généralités Anatomie (Barone, 1984) Conformation extérieure La forme varie selon l état de vacuité ou de réplétion et en fonction des contractions de la musculeuse. Dans un état moyen, l estomac apparaît comme un sac allongé, légèrement aplati crânio-caudalement et replié sur lui-même de telle sorte que le cardia et le pylore sont proches l un de l autre. Il forme un croissant à convexité gauche puis ventrale. Cette disposition permet de reconnaître à l estomac : - deux faces : l une est antérieure ou «pariétale» ou «diaphragmatique» et l autre postérieure ou «viscérale», toutes deux sont lisses, convexes, tapissées par le péritoine viscéral et parcourues par des vaisseaux flexueux ; - deux bords ou courbures : la plus courte est nommée petite courbure et constitue le bord droit, concave de l organe. Elle commence ventralement au cardia et se termine en région dorsale du pylore. La jonction de la partie pylorique avec le reste de l organe s y marque par une angulation appelée incisure angulaire. Sur toute sa longueur, la petite courbure donne insertion au ligament hépato-gastrique, partie du petit omentum. La plus longue s appelle la grande courbure et forme le bord gauche, convexe et très extensible de l estomac. Elle débute dorsalement au cardia et se termine en partie ventrale du pylore. Elle donne attache sur toute sa longueur au grand omentum ou épiploon. Vers son milieu, on peut observer avec un état moyen de réplétion un léger étranglement correspondant à la limite entre ses parties proventriculaire et glandulaire. - deux extrémités : la plus volumineuse est le fundus gastrique, encore appelé grosse tubérosité ou saccus caecus, cette partie dorsale gauche de l estomac apparaît renflée et forme un cul-de-sac, très développé chez les Equidés. Il détermine avec l insertion de l œsophage une sorte de sillon très accentué : l incisure cardiale. L autre extrémité est la partie pylorique qui fait suite au corps de l estomac en se rétrécissant progressivement et en se portant vers la droite et vers le haut. Elle se termine par le pylore que marquent un léger rétrécissement annulaire et une consistance plus ferme. Un léger rétrécissement subdivise la partie pylorique en deux segments : le premier, le plus large, constitue l antre pylorique puis suit le deuxième segment, plus étroit, qui aboutit au pylore et s appelle canal pylorique. On nomme corps de l estomac la partie de l organe comprise entre le fundus et la partie pylorique. L estomac des Equidés est peu volumineux. Chez le cheval, sa capacité moyenne est de 10 à 15 litres, avec des variations de 6 à 25, voire 30 litres selon les individus et en fonction des repas. La surface de la muqueuse est de l ordre de cm² dont la moitié environ appartient au proventricule. Le poids de l organe entièrement vidé est voisin de 2 kilogrammes en moyenne. Chez l âne, le viscère est relativement plus capasse : il contient en moyenne 10 litres et son poids à l état de vacuité est de l ordre de 1,5 kilogramme

12 Figure 1 : Conformation extérieure de l estomac du cheval (d après Barone, 1984) - 9 -

13 Conformation intérieure Elle ressemble en négatif à la conformation extérieure avec les mêmes subdivisions. La paroi stomacale a une épaisseur uniforme sauf au niveau du pylore où elle présente un épaississement marqué chez le cheval. La muqueuse gastrique montre des modifications dans sa couleur suivant la région de l estomac considérée. La grosse tubérosité gauche est tapissée intérieurement d une muqueuse proventriculaire résistante, sèche, blanchâtre et lisse, comme celle de l œsophage qu elle continue. Elle s étend en outre sur la petite courbure et la partie adjacente des faces, jusqu au niveau de l incisure gastrique. Elle est séparée de la muqueuse fundique par une ligne de suture (margo plicatus) formant une crête saillante, irrégulière et sinueuse. La muqueuse glandulaire est limitée à la moitié droite de l organe, elle est discrètement plus épaisse que la muqueuse proventriculaire, molle et enduite de mucus. Elle forme des gros plis gastriques distensibles, orientés plus ou moins parallèlement en direction du pylore. Elle comprend une partie fundique qui est rougeâtre et une partie pylorique qui montre une couleur jaunâtre ou grise. Le cardia présente des spécificités importantes. L ostium cardial est très étroit et presque obturé par les plis de la muqueuse oesophagienne qui s étalent autour de lui avec une disposition radiaire assez régulière. Cet agencement, lié au développement de la partie correspondante de la musculeuse, rend toute régurgitation impossible à moins d une déchirure du cardia. Le pylore est pourvu d un sphincter épais. Sa muqueuse forme des plis longitudinaux qui commencent dans le canal pylorique et disparaissent très vite sur le versant duodénal, lequel correspond à une dilatation brusque du début de l intestin

14 Figure 2 : Conformation intérieure et répartition des différents types de muqueuse de l estomac du cheval (d après Barone, 1984)

15 Rapports L estomac est en contact avec d nombreux organes : foie, pancréas, rate, côlons ascendant, descendant et transverse, jéjunum et diaphragme. En raison de son faible volume et du grand développement du côlon, l estomac n a jamais, quel que soit son état de réplétion, de rapports avec la paroi abdominale ventrale. Figure 3 : Organes abdominaux de la région diaphragmatique du cheval, vue caudale après isolement en bloc par désinsertion du diaphragme (d après Barone, 1984) Moyens de fixité La continuité avec l œsophage et l intestin maintient l estomac en place, surtout pour l œsophage qui, bien inséré dans le diaphragme, constitue un élément de fixité important. La pression des viscères digestifs intervient de façon importante chez les Equidés. Le péritoine forme des ligaments et des replis, les omentums. Tous ces ligaments et replis sont en continuité les uns avec les autres : ils résultent de l accolement des feuillets péritonéaux de chaque face (diaphragmatique et viscérale) autour de l organe. Il existe donc un véritable cadre de ligaments et replis péritonéaux qui s insère sur les deux courbures de l estomac. Le petit omentum est une lame grossièrement quadrilatère, ployée sur elle-même, qui s insère d une part sur toute la petite courbure gastrique, se prolonge au début du duodénum jusqu au pancréas, d autre part sur la face viscérale (caudale) du foie. Cette disposition permet de le diviser en deux ligaments : l hépato-gastrique et l hépato-duodénal. L extrémité gauche du petit omentum est attachée à la terminaison de l œsophage, du diaphragme au cardia. Quant à l extrémité droite, elle est libre et ourlée par la veine

16 Le ligament gastro-phrénique s étend du fundus (cul-de-sac gauche) de l estomac aux piliers gauches du diaphragme. Son insertion stomacale va de l œsophage jusqu à la rate où il devient le grand omentum. Il est court mais très fort : c est un véritable ligament suspenseur de l estomac. Le grand omentum est une vaste membrane mince, cribliforme, souvent chargée de graisse et qui flotte librement dans la cavité abdominale. Il est chargé d un riche réseau de vaisseaux sanguins et lymphatiques qui lui communiquent de remarquables aptitudes réactionnelles. Il prend pour origine toute la grande courbure de l estomac, où se rejoignent les feuillets séreux qui ont tapissé chacune des faces de l organe, depuis le sommet du fundus jusqu à l origine du duodénum. Depuis ces attaches initiales, le grand omentum se porte très peu ventralement et caudalement en constituant une lame ou paroi superficielle. Le deuxième feuillet constitue la lame ou paroi profonde. Elle se sépare de la précédente aux abords de l estomac où elle remonte dorsalement, entre l estomac et les intestins, pour aller s insérer sur le côlon transverse et le pancréas. Les deux lames de l omentum n étant pas adhérentes l une à l autre, elles délimitent une cavité, la bourse omentale, qui est presque entièrement fermée ; elle ne communique avec le reste de la cavité abdominale que par un orifice : le foramen épiploïque Vaisseaux et nerfs Artères Toutes les artères des organes de la région post-diaphragmatique dont l estomac proviennent de l artère cœliaque qui naît de la face ventrale de l aorte abdominale au niveau de la dernière vertèbre thoracique. L artère cœliaque donne trois branches après avoir longé le bord crânial du pancréas. L artère gastrique gauche se distribue à la petite courbure et sur les deux faces du corps, ainsi qu au cardia et au revers correspondant du fundus. La plus volumineuse des trois, l artère splénique ou liénale irrigue le reste du fundus, la moitié gauche de la grande courbure, la partie adjacentes des faces et le pylore. L artère hépatique distribue le sang à la région pylorique, à une partie de la petite courbure et aux zones qui bordent la moitié droite de la grande courbure. Toutes les divisions de ces artères sont très flexueuses pour pouvoir se prêter aux variations de volume de l organe et cheminent quelque temps sous la séreuse avant d alimenter les divers réseaux artériels de la paroi Veines Elles commencent par un réseau de gros capillaires anastomosés autour des cryptes, sous la surface de la muqueuse, où ils reçoivent les capillaires périglandulaires. De ce réseau plongent en profondeur des veinules anastomosées qui se collectent progressivement à chaque couche de la paroi gastrique pour aboutir finalement aux racines des veines proprement dites de l estomac. Ces veines accompagnent exactement les branches de distribution des artères. Elles sont en général au nombre de deux pour chacune de celles-ci, qu elles encadrent. Mais au voisinage du point où elles quittent le viscère, elles s unifient et il n y a jamais qu une seule veine pour accompagner une artère de n importe quelle importance. Les grandes veines de l estomac répètent d abord la disposition des artères puis s en séparent et les veines gastriques, liénale et gastro-duodénale aboutissent à la veine porte, qui draine leur sang vers le foie Vaisseaux lymphatiques Ils naissent en cul-de-sac sous l épithélium superficiel de la muqueuse. Ils s anastomosent rapidement en un réseau muqueux. Ce système alimente un réseau sous-muqueux dont les

17 efférents perforent la musculeuse, drainent au passage le plexus musculaire et aboutissent à un plexus sous-séreux. Ce dernier est surtout dense sur les faces de l estomac. Ses efférents effectuent un trajet souvent long pour rejoindre les nœuds lymphatiques gastriques qui appartiennent au lymphocentre cœliaque. Chez le cheval, ces nœuds sont constants, petits, nombreux (15 à 35) et placés le long de la petite courbure ; un groupe accessoire de 10 à 20 nœuds lymphatiques omentaux est logé le long de la grande courbure de l estomac dans le grand omentum Nerfs Ils proviennent du parasympathique (qui augmente le tonus, la motricité et a sécrétion gastriques) par les nerfs vagues et du sympathique, dont le rôle est ici modérateur, par le plexus cœliaque. Le trajet des premiers est en principe distinct de celui des vaisseaux. Le tronc vagal ventral distribue ses branches à la face antérieure du corps, à la petite courbure et à la partie pylorique, tandis que le tronc vagal dorsal en donne au fundus et à la face postérieure. Les nerfs sympathiques, au contraire, accompagnent les divers vaisseaux et forment autour d eux des lacis plexiformes Histologie (Barone, 1984) Quatre tuniques constituent la paroi de l estomac. De l extérieur vers l intérieur, ce sont : la séreuse, la musculeuse, la sous-muqueuse et la muqueuse Séreuse Elle est constituée par le feuillet viscéral du péritoine, continu au niveau des courbures avec les mésos précédemment décrits. Elle se sépare en deux feuillets entre lesquels est logé le viscère. Chacun d eux adhère très intimement à la face correspondante. C est seulement sur le trajet des vaisseaux et nerfs superficiels qu on trouve les éléments d une véritable sousséreuse. Au niveau des courbures, à l insertion des omemtums, on trouve un conjonctif souspéritonéal plus abondant et la séreuse devient mobile sur le plan sous-jacent. Cette disposition, favorable à la distension de ces zones, contribue à faciliter les variations de volume de l organe. En regard de la petite courbure, la séreuse est en outre doublée par une petite quantité de tissu élastique qui semble avoir pour rôle de maintenir les deux extrémités de l organe rapprochées l une de l autre Musculeuse Comme celles de l œsophage et de l intestin, la musculature de l estomac présente deux plans de fibres fondamentaux, l un superficiel, longitudinal et l autre profond, circulaire. Cependant la morphologie particulière du viscère entraîne des remaniements, surtout marqués sur le fundus et dans la partie adjacente du corps. Selon les niveaux, on observe une dissociation, un renforcement ou encore un changement d orientation des plans musculaires, en rapport avec la conformation et la fonction propres à chaque région de l organe. Aux deux couches fondamentales s ajoutent ainsi dans le fundus et le corps de l estomac deux couches obliques, l une externe et l autre interne, la plus profonde. Immédiatement sous-séreuse, la couche longitudinale est réduite à une bande le long de chacune des deux courbures. Dans la partie pylorique, la couche longitudinale se renforce de fibres élastiques, devient complète et se poursuit par la couche longitudinale de l intestin. Les fibres obliques externes représentent une dépendance de la couche précédente et n existent qu au niveau du fundus et de la partie adjacente du corps. Elles sont particulièrement développées et forment un plan relativement épais, presque partout superficiel

18 La couche circulaire est absente au niveau du fundus et mince dans la partie adjacente du corps. Elle occupe une situation intermédiaire entre les plans précédents et les fibres obliques internes, qui la laissent toutefois en rapport direct avec la sous-muqueuse dans la partie pylorique. Elle est surtout nette au niveau de la petite courbure, où elle continue la couche circulaire de l œsophage, et ses faisceaux se perdent sur les faces du corps. Elle devient plus nette et complète dans la partie pylorique, surtout en regard du canal pylorique où elle se renforce et constitue le sphincter pylorique, remarquablement épais et susceptible par sa contraction de fermer complètement la communication avec l intestin. Les fibres obliques internes ne sont présentes que dans le fundus et le corps de l estomac. Elles constituent une couche épaisse, qui se met en continuité avec les fibres circulaires de la face gauche de l œsophage et dans laquelle on peut reconnaître deux parties continues l une avec l autre : - L anse cardiale embrasse le côté gauche du cardia et présente son maximum d épaisseur au fond de l incisure cardiale. Ses branches se portent de part et d autre de la petite courbure, en s étalant jusqu à l incisure gastrique de sorte que leurs faisceaux s irradient dans les faces de l organe ce qui délimite une gouttière dont le fond est constitué par les fibres circulaires de la petite courbure qui ferment à droite l encadrement musculaire du cardia. Le sommet de l anse cardiale est particulièrement épais ; il participe avec les fibres circulaires de la partie droite du cardia à la formation d un système sphinctériel puissant, qui bloque normalement l orifice de ce dernier. - Quand aux fibres obliques internes proprement dites, on peut les considérer comme une expansion de l anse cardiale sur l ensemble de la partie gauche de l estomac, en croisant la direction des fibres obliques externes

19 Figure 4 : Musculature gastrique du cheval (d après Barone, 1984)

20 Sous-muqueuse Cette tunique n est que faiblement unie à la face interne de la musculeuse, alors que sa face cavitaire adhère de la façon la plus intime à la muqueuse. Elle est constituée par un conjonctif lâche, surtout abondant dans la partie pylorique et épouse les moindres plis de la muqueuse qu elle supporte. Elle contient un très riche réseau vasculaire et un important plexus nerveux sous-muqueux mais elle est dépourvue de glandes Muqueuse Muqueuse proventriculaire Elle est sèche, blanchâtre et très comparable à la muqueuse oesophagienne. Sa musculaire muqueuse est relativement épaisse et présente deux plans de fibres irréguliers, souvent dissociés ; elle délègue de nombreux faisceaux dans la muqueuse propre qui est épaisse, fibreuse et résistante, riche en fibres élastiques. Il s en élève un grand nombre de petites papilles, toutes noyées dans l épithélium qui est épais, stratifié pavimenteux et non kératinisé. Les glandes font totalement défaut. L étude du développement a permis de mettre en évidence que la formation du proventricule correspond à une métaplasie de la muqueuse gastrique et non à une invasion de l estomac par l œsophage Muqueuse fundique Elle est considérée comme type de muqueuse gastrique proprement dite. Elle est refoulée entièrement dans le corps de l estomac et ne se trouve donc plus dans le fundus. Elle est épaisse, molle et rougeâtre. Son organisation générale est soulignée par l agencement de la musculaire-muqueuse. Celle-ci est forte, pourvue de deux plans de fibres dont l externe est longitudinal et l interne transversal. Ce dernier délègue entre les glandes de la muqueuse de nombreux faisceaux de fibres lisses qui forment des travées ou relèvements. Des relèvements majeurs isolent nettement des groupes glandulaires formant de véritables lobules qui se traduisent à la surface de la muqueuse par de minuscules champs surélevés : les aires gastriques séparées par d étroits sillons. Chaque lobule est à son tour subdivisé par des relèvements mineurs en petits groupes glandulaires dont les canaux excréteurs s ouvrent sur d étroites et profondes dépression : les cryptes gastriques percées sur les aires gastriques ou dans les sillons. La présence de ces multiples dépressions détermine sur les aires un réseau de faibles crêtes intermédiaires : les replis villeux. Le chorion conjonctif ou lamina propria est un tissu conjonctif qui entoure et soutient les structures épithéliales. Il est discret et riche en vaisseaux notamment sanguins mais également souvent infiltré de cellules lymphoïdes qui peuvent se regrouper en points lymphoïdes, surtout nombreux en zone pylorique. L épithélium est simple, formé d une seule rangée de cellules portée par une mince limitante et dont les caractères varient selon les points considérés. Il s enfonce en effet dans l épaisseur du chorion pour constituer une infinité de glandes en tubes, serrées presque au contact les unes des autres, qui occupent presque toute l épaisseur de la muqueuse. A la surface de celleci et dans la partie adjacente des cryptes, il est formé de cellules prismatiques, hautes et claires. Ces dernières deviennent plus basses et peu à peu cubiques vers le fond des cryptes et sur les orifices glandulaires. Les glandes fundiques ou fondiques ou gastriques propres sont tubuleuses, simples ou parfois bifurquées, presque rectilignes et perpendiculaires à la surface. Elles deviennent sinueuses ou légèrement contournées dans la profondeur. On reconnaît à chacune d elles un isthme ou col ou collet assez étroit et cylindrique, qui débouche dans la crypte ; un corps ou partie

21 principale, un peu plus large, cylindrique et bosselé, à peine flexueux et enfin un fond contourné et terminé en cul-de-sac. La lumière glandulaire est extrêmement étroite et souvent difficile à discerner. L épithélium comporte quatre types de cellules : - des cellules muqueuses ou mucocytes, cubiques et régulières, au cytoplasme basophile, localisées à l isthme dont elles forment seules le revêtement et sécrétant un mucus composé de glycosaminoglycanes acides ; de nombreuses figures de mitose peuvent également être observées, - dans le corps et le fond, des cellules principales ou glandulocytes principaux, clairs, de petite taille, polyédriques à noyau central ou basal, au cytoplasme basophile dans lequel s accumulent en région apicale des grains de sécrétion acidophile. Les caractéristiques observées sont celles d une cellule séreuse, c est-à-dire d une cellule à sécrétion exocrine protéique. Leur sécrétion est en effet constituée principalement d enzymes digestives, notamment du pepsinogène ainsi que de rénine. - des cellules bordantes ou glandulocytes pariétaux beaucoup moins nombreuses que les précédentes et surtout visibles au niveau du corps de la glande, plus rares dans le fond. Ce sont de volumineuses cellules piriformes qui déforment le contour glandulaire. En microscopie photonique, elles sont caractérisées par un noyau sphérique central et un cytoplasme acidophile comportant de nombreuses petites granulations acidophiles réfringentes correspondant aux mitochondries. En microscopie électronique, on remarque un réseau cananiculaire constituant un très important dispositif d amplification des surfaces membranaires ouvertes sur la lumière. Ces cellules interviennent dans la libération de l acide chlorhydrique. - des cellules argento-chromaffines, peu nombreuses, surtout présentes dans le fond des glandes. Elles sont de forme pyramidale et leur pôle apical, effilé, n a pas de contact direct avec la lumière. En microscopie photonique, elles sont caractérisées par leurs granulations qui s accumulent à leur pôle basal et sont colorables par les sels d argent et de chrome. En microscopie électronique, on observe un réticulum endoplasmique granuleux apical et un appareil de Golgi infranucléaire d où se détachent les grains de sécrétion, limités par une membrane, au contenu osmiophile. La polarité morphologique de ces cellules est donc orientée vers le pôle basal, contrairement aux autres cellules de la glande, ce qui caractérise une potentialité sécrétrice endocrine. Embryologiquement et fonctionnellement, ces cellules appartiennent au système APUD, système endocrine diffus de l organisme

22 Figure 5 : coupe transversale schématique de la muqueuse fondique de cheval (d après Barone, 1984) Muqueuse cardiale Elle s interpose entre la muqueuse oesophagienne du proventricule et la muqueuse fondique et ce raccordement est refoulé dans la partie moyenne de l organe où il n occupe qu une bande étroite de quelques millimètres entre la margo plicatus et la muqueuse fondique et disparaît même au voisinage de la petite courbure, où il se raccorde progressivement à la muqueuse pylorique. Son organisation est similaire à celle de la muqueuse fundique mais les glandes cardiales sont plus richement ramifiées et contournées qu en région fondique et sécrètent du mucus

23 Muqueuse pylorique Elle occupe toute la partie pylorique ainsi qu une zone variable du corps. Elle est plus mince et plus claire que la muqueuse fundique, un peu moins plissée aussi sauf au voisinage immédiat du pylore. Elle présente encore la même organisation générale mais les relèvements majeurs et mineurs de sa musculaire muqueuse sont beaucoup plus puissants, le groupement lobulaire des glandes particulièrement net et les cryptes beaucoup plus profondes et étroites. Ces dernières se rétrécissent de plus en plus vers le pylore en même temps que des tubes glandulaires plus nombreux s ouvrent isolément à la surface des aires gastriques. Par ailleurs, les glandes pyloriques sont fortement ramifiées et contournées sur elles-mêmes de façon à former sur les coupes histologiques des amas montrant de multiples petites surfaces de section. Ce sont des glandes muqueuses constituées majoritairement de cellules mucipares à pôle muqueux fermé, au noyau aplati et basal Physiologie (Lefrançois et Tiret, 2000) Activité digestive microbienne intragastrique Dans certaines conditions alimentaires, la fermentation intra-gastrique d hydrates de carbone ingérés peut être envisagée chez le cheval. Certaines bactéries intervenant dans la fermentation comme Lactobacillus acidophilus sont capables de survivre dans un environnement relativement acide. La substance majoritaire produite par fermentation par Lactobacillus est l acide lactique dont une grande quantité peut être générée dans un estomac de cheval s il y a une grande proportion d hydrates de carbone solubles dans la ration. D autre part, les bactéries qui convertissent ces hydrates de carbone en acides gras volatils sont plus sensibles à l acidité mais sont aussi présentes dans l estomac des chevaux. Il a été formulé l hypothèse selon laquelle ces bactéries colonisent l intérieur des ingesta fibreux les plus grossiers qui se collectent vers le sommet du contenu gastrique où le ph est plus à leur convenance parce que cette zone n est pas complètement pénétré par l acide gastrique. Ce ph plus élevé est encore augmenté par la salive parotidienne qui a été avalée et qui est produite à raison de 10 à 12 litres par jour chez un cheval adulte et possède une concentration en bicarbonates environ deux fois plus grande que celle du plasma. Cependant les acides gras volatils produits par l estomac du cheval ne sont pas absorbés vers le flux sanguin et par ailleurs la muqueuse non glandulaire est particulièrement résistante à la pénétration de ces substances Sécrétion Les sécrétions gastriques comprennent principalement de l acide chlorhydrique (HCl), du pepsinogène, le facteur intrinsèque et du mucus. L HCl permet de diminuer le ph du contenu gastrique et d activer le pepsinogène en pepsine intervenant dans la digestion des protéines. Le facteur intrinsèque est le facteur permettant l absorption de la vitamine B12 dans l iléon. Le mucus intervient en particulier dans la protection et la lubrification de la muqueuse Cellules productrices Les zones cardiale et du fundus comprennent essentiellement des cellules à mucus. Dans la zone pariétale ou fondique, on trouve des cellules pariétales (sécrétion d HCl), des cellules muqueuses et des cellules principales (sécrétion de pepsinogène). Dans la zone pylorique, les glandes sont plus profondes et contiennent des cellules G et des cellules muqueuses. Ces dernières peuvent avoir un rôle complémentaire de sécrétion de pepsinogène

24 Enfin on trouve dans la muqueuse gastrique des cellules enterrochromaffines-like qui sécrètent l histamine Cellules pariétales Le rôle majeur des cellules pariétales est de sécréter l HCl et d acidifier le contenu gastrique. Ces cellules possèdent l anhydrase carbonique qui catalyse la combinaison de CO 2 provenant du métabolisme cellulaire et de l H 2 O pour former H 2 CO 3. A la membrane apicale, des canaux H + /K + ATPase dépendant assurent activement la sécrétion de H +. Les ions Cl - suivent H + par diffusion à travers les canaux Cl -. A la membrane basolatérale HCO 3 - passe dans le sang grâce à un échangeur Cl - /HCO 3 -. Ces bicarbonates sont responsables d une alcalinisation du sang après un repas. Ils peuvent être sécrétés dans le tractus digestif par les sécrétions pancréatiques. La cellule pariétale produit aussi le facteur intrinsèque : une mucoprotéine indispensable à l absorption de la vitamine B Cellules principales Il s agit d une cellule sécrétrice spécialisée qui produit le pepsinogène qui est une proenzyme inactive permettant de protéger la cellule productrice. Il existerait plusieurs isoformes de pepsinogène équin mais la signification fonctionnelle de ces molécules concernant la protéolyse intra-gastrique n est pas connue. Quand le ph du suc gastrique est bas c est-à-dire inférieur à 4 (grâce à la production d HCl), le pepsinogène est converti en pepsine par coupure de la protéine et le peptide libéré qui est inhibiteur de l action de la pepsine est détruit. La pepsine commence la digestion des protéines en scindant les acides aminés tyrosine et phénylalanine après un carbone terminal. La cellule principale sécrète d autres enzymes gastriques dont la lipase, l amylase et la gélatinase. Concernant la lipase gastrique, elle possède un pic d activité pour un ph de 4 et elle est produite en quantité non négligeable par le cheval sans pour autant que son rôle dans la digestion des ingesta soit déterminé. Par ailleurs, le pancréas du cheval engendre beaucoup plus de lipase que n importe quelle autre enzyme digestive élaborée par cet organe, de plus une étude récente montre que les chevaux peuvent assimiler une quantité non négligeable de lipides. Les autres enzymes citées sont également générées par le pancréas en quantités plus conséquentes que l estomac et leur rôle n a pas été étudié Autres cellules Les cellules G, présentent dans la muqueuse pylorique, sont endocrines et élaborent la gastrine soluble grâce au motif répété d acide glutamique. La pentagastrine synthétique reproduit l activité de la gastrine. Les cellules D situées à la fois dans les muqueuses fondique et pylorique sécrètent de la somatostatine et ont une action plus paracrine qu endocrine. Ces cellules sont en effet très proches des cellules effectrices qui sont variées ce qui permet d avoir une action directe évitant ainsi le recours à la circulation sanguine pour la distribution. Cependant la somatostatine peut être relarguée dans le sang mais la majeure partie de ces actions concernant l estomac se fait par voie paracrine Régulation de la sécrétion gastrique Régulation de la production d HCl L acétylcholine, l histamine et la gastrine stimulent la sécrétion d HCl par la cellule pariétale. L acétylcholine se fixe sur les récepteurs muscariniques de cette cellule et induit par le second messager IP3 une augmentation de calcium intra-cellulaire conduisant à l activation des protéines kinases et à la sécrétion d H +. La gastrine agit de façon endocrine, se fixe sur son récepteur et induit une stimulation de cette sécrétion. Le syndrome de Zollinger-Ellison correspond à l apparition d une tumeur pancréatique associée à une surproduction de gastrine

25 qui induit une augmentation de la production d HCl par la cellule pariétale et qui a un effet trophique sur cette cellule. L histamine produite par les cellules enterrochromaffines-like agit de façon paracrine en se fixant sur son récepteur H2. Le second messager est l AMP C responsable de l activation des protéines kinases. Il existe un phénomène de potentialisation entre ces trois molécules. Chez le cheval, la sécrétion d HCl est moins marquée que pour les monogastriques carnivores et omnivores. Il en résulte une stérilisation moins poussée des ingesta ce qui est à l origine d une résistance partielle de la flore bactérienne responsable de l ensemencement des réservoirs postérieurs Phases de sécrétion gastrique La phase céphalique est une phase d anticipation. Les stimuli sont l odeur, le goût, les réflexes conditionnés, la mastication et la déglutition. Ces stimuli induisent une stimulation du nerf vague et la sécrétion d une part d acétylcholine provoquant la production d HCl, et d autre part de GRP favorisant la sécrétion de gastrine et par conséquent d HCl par les cellules G. La phase gastrique apporte environ 60% des sécrétions. La distension de l estomac, les produits de dégradation des protéines (acides aminés et peptides) sont les stimuli majoritaires. La distension induit une stimulation vagale et un réflexe local qui stimule principalement la production de gastrine. Les produits de dégradation des protéines ont un effet direct de stimulation de la production de gastrine. La stimulation vagale est également responsable d une augmentation de sécrétion de pepsinogène. Les ions H+ induisent un réflexe local stimulant la sécrétion de pepsinogène assurant une production quand le ph est suffisamment bas pour permettre l activation du pepsinogène. La phase intestinale est mise en œuvre par la présence de produits protéiques dans le duodénum et assure 10% des sécrétions gastriques. Pendant les périodes interdigestives, les sécrétions correspondent principalement à du mucus. Figure 6 : Différents intervenants de la stimulation de la sécrétion gastrique et leurs relations (d après Lefrançois et Tiret, 2000)