LA SPECTROMETRIE DE MASSE TANDEM (OU MS/MS)

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1 24 CHAPITRE IV LA SPECTROMETRIE DE MASSE TANDEM (OU MS/MS) IV. 1 Principe général La première partie de ce cours concernait l'étude des ions formés dans la source (moléculaires, adduits ou fragments). Nous avons vu que, dans la source d'ionisation électronique, la répartition des énergies internes des ions moléculaires était large. On a ainsi pu classer les ions en trois catégories: - faible énergie interne: ions stables qui ne se décomposent pas et qui constituent le pic moléculaire des spectres de masse. - forte énergie interne: ions instables qui se décomposent rapidement dans la source en fournissant des ions fragments. - Énergie intermédiaire: ions métastables à durée de vie intermédiaire qui ne se décomposent pas dans la source mais durant le vol (= entre la source et le détecteur). La MS/MS est née de la volonté d'augmenter le phénomène de dissociation métastable sans être tributaire de la spontanéité de ces décompositions. Puisque les ions métastables sont des ions excités, avec un niveau d'énergie interne moyen, l'idée de Beynon et Cooks d'une part et de Mac Lafferty d'autre part a été de trouver le moyen d'exciter hors de la source des ions stables afin d'accroître leur énergie interne et ainsi de les faire fragmenter. Les appareillages construits pour réaliser ces expériences ont été appelés "tandem" car ils sont conçus de la manière suivante: une première étape consistant à sélectionner un ion stable particulier issu de la source d'ions (appelé "parent" ou "précurseur") et une seconde qui représente l'analyse des ions issus de sa décomposition (ions "fils" ou "produits"). Dans l'intermédiaire se situe la phase d'activation de l'ion précurseur qui conduit à son excitation (= augmentation de son énergie interne) et à sa fragmentation. L'analyse par MS/MS peut reposer sur des régions distinctes de l'appareil, auquel cas l'on parlera d'une MS/MS dans l'espace qui fait appel à deux analyseurs successifs, soit sur des séquences successives au sein de la même enceinte; il s'agit alors d'une MS/MS "dans le temps" (cas des trappes à ions et de la résonance cyclotronique ionique).

2 25 Intérêt de la MS/MS: 1. Étude des filiations ioniques: en ionisation électronique, les ions-fragments sont souvent nombreux et l'information structurale est très riche. Malheureusement, l'interprétation des spectres de masse reste fréquemment spéculative. En l'absence de pic métastable, aucune preuve de la relation de filiation de deux ions n'est apportée par le simple examen du spectre. En MS/MS, la sélection des ions les uns après les autres et l'étude de leur fragmentation permet ainsi d'établir la preuve des voies de fragmentation. 2. Un autre intérêt, évident, de la spectrométrie de masse tandem découle de la possibilité qu'elle offre de sélectionner un ion par le premier analyseur: la séparation de composés de masse moléculaire différente au sein d'un mélange. 3. D'autres intérêts analytiques se surajoutent à ceux-ci, qui dépendent des appareillages utilisés; on les citera plus loin. IV. 2 Activation par collision et énergie de collision CAD ou CID (Collisionally Activated ou Collision-Induced Dissociation) L'énergie est apportée à l'ion incident par collision inélastique contre un gaz rare (Ar, He). L'ion incident, parce que stable, possède initialement (avant collision) une énergie interne E int qui lui est conférée par le processus d'ionisation. Lors de la collision, au considère qu'il y a un transfert d'énergie au centre des masses, E CM, tel que: E CM = E lab [M c /(M c +M i )] (14) Avec: E lab : énergie "de collision" soit l'énergie cinétique de l'ion dans le référentiel du laboratoire M c : masse de la cible M i : masse de l'ion incident L'équation 14 montre que plus l'ion incident possède une masse élevée, moins efficace est la collision. On considère ainsi que pour un ion monochargé, le CID n'est plus guère efficace au delà de 3000 unités de masse. Après collision, un ion précurseur possède une énergie interne E int correspondant à la somme de son énergie interne initiale E int (liée au processus d'ionisation) et de l'énergie interne due à la collision elle-même E* int.. En réalité, la part d'énergie interne E* int récupérée par l'ion incident lors de la collision est une faible fraction de l'énergie dégagée au centre des masses E cm sauf pour de faibles valeurs d'énergie cinétique de l'ion précurseur E lab. Ainsi, si l'équation 14 laisse entendre qu'il suffit d'augmenter l'énergie cinétique des ions précurseurs pour augmenter leur énergie cinétique, en réalité, la conversion de l'énergie au centre des masses en énergie interne est très peu efficace dans le cas de fortes énergies cinétiques. A titre d'exemple, le fait d'augmenter E cm de 1 ev à 8 ev ne fait gagner que 0,7 ev d'énergie interne.

3 26 Le fait de travailler avec un instrument magnétique à 8 kev de E lab ou avec un appareil quadripolaire à 5 ou 30 ev ne change guère le gain moyen d'énergie interne obtenu lors de la collision. Cependant, quelques différences sont observables sur les courbes de répartition en énergie interne des ions précurseurs Fe(CO) 5 + selon qu'ils sont soumis à des collisions de haute (7 kev) ou faible (28 et 5 ev) énergie: Répartition de l'énergie interne en fonction de l'énergie de collision (E lab ) d'après R. G. Cooks En haute énergie de collision (7 kev): La répartition en énergie des ions activés possède une longue traînée jusqu'à la région des ev d'énergie interne. On peut donc s'attendre à ce que dans ces régions, les ions se fragmentent selon des processus de haute énergie tout à fait spécifiques. On attribue à ces ions, peu nombreux mais très excités, les mécanismes de fragmentation à charge piégée ("charge-remote fragmentation": CRF) qui ne sont à peu près observables qu'avec des instruments magnétiques. Dans la zone des 4-10 kev d'énergie de collision, l'énergie interne déposée par la collision sur l'ion précurseur sera toujours la même. Par conséquent, les spectres de collision de haute énergie obtenus sont très reproductibles et représentent de véritable empreintes digitales des composés étudiés. Dans ce contexte, il est généralement considéré que l'énergie interne initiale des ions ne joue qu'un rôle très modeste. En basse énergie de collision, au contraire (moins de ev), l'efficacité du transfert d'énergie en énergie interne est plus grande. Pour des raisons opposées à celles avancées pour les appareils magnétiques, les instruments quadripolaires seront extrêmement intéressants à utiliser en MS/MS. En effet, la modification de l'énergie cinétique de l'ion incident (E lab ) de quelques ev se traduit par une modification de l'énergie interne de plusieurs dixièmes d'ev. Or, souvent, seuls quelques dixièmes d'ev séparent les énergies d'activation de deux processus de fragmentation distincts. Donc, en faisant varier E lab entre 0 et 50 ev, par exemple, on pourra favoriser tel ou tel processus de décomposition, ce qui peut être très intéressant en chimie structurale. Pour mémoire: - SID (Surface-Induced Dissociation) Cette technique consiste à provoquer, dans une région hors-champ, une collision entre le faisceau d'ions incidents et une surface métallique. Cette surface ayant une masse infinie devant celle de l'ion, cela revient à égaliser, selon l'équation 14, E cm et E lab. L'intérêt de cette méthode d'activation est de bien définir l'énergie transférée aux ions, de la contrôler en faisant simplement varier E lab. De plus, l'absence de gaz dans l'appareil est toujours préférable pour un spectromètre de masse et enfin, tous les ions réfléchis ont subi une et une seule collision.

4 27 Le défaut: le pic de l'ion parent est souvent atténué (parfois totalement) en raison de phénomènes de neutralisation dus à la présence de charges sur la surface (qui peut céder des électrons). - Photodissociation. Les ions peuvent absorber de l'énergie par le biais de photons. L'interposition d'une source de rayonnement (laser, synchrotron) sur le trajet moléculaire ou ionique peut conduire à l'accroissement de l'énergie interne de l'ion sélectionné puis à sa fragmentation. IV. 3 Les spectromètres de masse tandems IV.3.A Triples-quadripôles et trappes à ion IV.3.B Tandems magnétiques IV.3.C Spectromètres hybrides IV.3.A Triples-quadripôles et trappes à ion (0-200 ev) Le triple-quadripôle est un spectromètre tandem très répandu. Il présente un quadripôle à chaque étage de l'analyse. C'est un quadripôle (Q2) qui sert de cellule de collision; on peut donc y appliquer une radio fréquence (RF) qui favorise le confinement des ions et, par voie de conséquence, augmente l'efficacité du CID. Si l'on ajoute à cela une résolution unitaire sur toute la gamme de masse, on possède avec le triple quadripôle un excellent spectromètre de masse tandem. Avantages: a. bonne efficacité du CID b. bonne transmission c. sensibilité à l'énergie interne initiale de l'espèce sélectionnée (car basse énergie de collision; cf + haut) d. possibilité de favoriser un processus de décomposition au dépend d'un autre. Expériences possibles: a. Spectre d'ions-produits (ou ions-fils, daughter ion spectrum): dans cette expérience, il s'agit de rechercher les ions-fragments, ou "fils" d'un ion précurseur particulier. Tous les ions formés dans la source d'ions sont extraits mais le premier quadripôle (Q1) est maintenu à une valeur fixe de tensions de telle sorte qu'un seul type d'ions (une seule valeur de m/z) traverse cet analyseur. Cet ion, soumis à la collision dans q2, fragmente. Le second analyseur (Q3) enregistre le spectre de façon conventionnelle. Le spectre obtenu montre, outre l'ion précurseur, tous les fragments qui en proviennent par CID. b. Spectre d'ions-précurseurs (ou ions-parents, parent ion spectrum): il s'agit, dans ce cas, de rechercher les ions précurseurs d'un fragment particulier formé par CID. Le balayage est effectué par Q1. Lorsqu'un ion, filtré par Q1, se dissocie dans la cellule de collision pour donner le fragment sélectionné, sa valeur de m/z est enregistrée. Par conséquent, même si c'est toujours le

5 28 même ion fragment qui atteint le détecteur (Q3 est fixé sur sa valeur de m/z), le spectre fournira tous les ions précurseurs dont il est issu. c. Spectre de "perte de neutre" (neutral loss spectrum): cette expérience consiste à rechercher les ions précurseurs qui fragmentent en perdant un même neutre particulier. Les deux analyseurs balayent simultanément le domaine de masse en maintenant constante une certaine différence de masse entre les ions filtrés par chacun d'entre eux. Cette différence de masse, si elle correspond à la masse de la molécule neutre n perdue lors du processus de décomposition d'un ion m 1 filtré par Q1, permettra à l'ion m 2 (= m 1 n) de traverser Q3. Par exemple, le spectre de "perte de 18" (H 2 O) fournit les valeurs de m/z de tous les ions-fragments qui ont été obtenus par perte d'une molécule d'eau à partir de précurseurs. Cette méthode est souvent utilisée pour mettre en évidence au sein de mélanges complexes des composés qui présentent une fragmentation particulière conduisant à la perte d'une molécule neutre caractéristique. La spécificité de cette technique est très grande puisque la sélection ne s'effectue pas sur une valeur de masse d'un ion parent ou fils (plusieurs ions de structures différentes peuvent avoir la même masse) mais sur la nature d'un processus de décomposition. IV.3.B Appareils tandems magnétiques (énergie de collision: ev) Rappel (principe de base): le champ magnétique B est un filtre de masse, le champ électrostatique E est un filtre d'énergie cinétique; il existe une haute tension d'accélération. - Géométrie BE (ou "géométrie inverse"): spectres MIKE et CID/MIKE (MIKE: Mass-analyzed Ion Kinetic Energy) Spectres MIKE de deux composés stéréoisomères (IE, 20 ev, ions métastables) Le secteur magnétique (B) est un filtre de masse. En lui donnant une valeur constante correcte, il est donc à même de sélectionner un ion particulier issu de la source, en fonction de son m/z. Le balayage de E permet ensuite de détecter les fragments issus des décompositions métastables ou sous CID de cet ion en deuxième région hors-champ (entre B et E). En effet, si l'on considère une réaction de fragmentation dans laquelle un ion de masse m 1 se dissocie pour former un ion fragment de masse m 2 et un neutre de masse m n, l'énergie cinétique de l'ion précurseur se répartit entre le fragment et le neutre: ½ m 1 v 2 1 = ½ m 2 v ½ m n v n (15) avec m 1 =m 2 +m n (16) on en déduit: v 1 =v 2 =v n (17) Une autre formulation de l'équation 7 (chapitre 2) donne pour le champ E 0 permettant de filtrer l'ion m 1 issu de la source la valeur suivante: E 0 = m 1 v 1 2 / z r (18) Et pour l'ion de masse m 2 issu de m 1 dans une région hors-champ: E* = m 2 v 2 2 / z r (19) soit selon (17) E* = m 2 v 1 2 / z r (20)

6 29 ou encore: E* = (m 2 /m 1 ).E 0 (21) En d'autres termes, les rapports des valeurs de E pour lesquels les fragments et le précurseur sont détectés sont égaux au rapport des masses [fragments/précurseur]. Un spectre réalisé par un balayage de E correspond donc à un balayage en énergie cinétique des ions à partir d'un précurseur isolé en masse d'où le terme Mass-analysed Ion Kinetic Energy (MIKE). On en déduit très facilement le rapport des masses donc, celle du précurseur étant connue, les valeurs de m/z des fragments. Cependant, au moment où le fragment se sépare de sa contrepartie neutre, une partie de l'énergie résiduelle (energy-release, voir plus haut) se transforme en énergie cinétique. Or, le filtre E est un filtre d'énergie cinétique. La part d'énergie interne transformée en E cin est en général de 0,12 ev mais peut parfois atteindre 2 à 3 ev. Donc, s'il n'y a pas de déplacement observé sur la valeur moyenne de la masse, la distribution de l'énergie cinétique dans n'importe quelle direction de l'espace se traduit par un élargissement des pics d'ions fragments. E*=m 2 /m 1 E 0 E 0 Le défaut de mauvaise résolution s'accompagne d'un avantage: la largeur du pic à mi-hauteur permet de revenir à la dispersion d'énergie cinétique lors de la fragmentation donc à la part d'énergie interne perdue sous forme d'énergie cinétique. Cette valeur que l'on appelle "constante T" est donc très informative sur la thermochimie et le mécanisme réactionnel. On pourra distinguer ainsi des pics fins (ruptures simples car peu d'énergie perdue) de réarrangements qui s'accompagnent d'énergies-retour importantes et que l'on identifie par des signaux larges. - Géométrie EB (ou "géométrie conventionnelle"): les balayages combinés (linked scans) Il est possible, avec des spectromètres de masse magnétiques conventionnels (EB), d'étudier un ion particulier parmi tous ceux qui apparaissent dans la source. On s'intéresse alors aux décompositions qui se produisent dans la première région hors-champ, c'est à dire entre la plaque d'accélération et le champ électrostatique E. Lorsque l'ion de masse m 1 se décompose à cet endroit de l'appareil pour donner un ion fragment de masse m 2 et un neutre de masse m n nous avons vu que la détection de l'ion fragment imposait au champ E de prendre la valeur E=(m 2 /m 1 )E 0 (voir plus haut équation 21). Cependant, dans le cas présent, l'ion fragment doit également traverser le champ magnétique. De façon analogue au cas du champ électrostatique, il est facile de montrer que le champ magnétique B doit épouser la valeur suivante: B* = m 2 /m 1 B 0 (22) où B 0 est la valeur de champ correspondant à l'ion précurseur m 1 issu de la source d'ions. L'équation (5) du chapitre II peut être réécrite de la manière suivante pour B 0 : B 0 = [(m 1 /z)2v 0 ] 1/2 /r (23) d'où B* = m 2 /m 1 [(m 1 /z)2v 0 ] 1/2 /r (24) soit B* = [(m 2 2 /m 1 z)2v 0 ] 1/2 /r (25) De l'équation 25, découle le fait que l'ion m 2 formé dans une région hors champ est détecté à la valeur de masse apparente m 2 2 /m 1 et non à la masse réelle m 2 qui lui est attribuée lorsqu'il est formé dans la source d'ions. Des pics aux valeurs de masse apparente m 2 2 /m 1 peuvent être observés sur des spectres de masse enregistrés de façon conventionnelle par un spectromètre de géométrie EB. Ils correspondent à des fragments formés entre le champ E et le champ B, soit en deuxième région hors-champ de ces appareils.

7 30 Si l'on calcule le rapport B*/E* à partir des équations 21 et 25, l'on obtient: B*/E* = (m 1 /m 2 E 0 )[(m 2 2 /m 1 z)2v 0 ] 1/2 /r (26) soit B*/E* = [(m 1 /z)2v 0 ] 1/2 /re 0 (26) En d'autres termes, ce rapport ne dépend que de V 0 (tension d'accélération, constante), r (le rayon de l'aimant, constant), E 0 (fonction de V 0, constant) et m 1 /z, valeur choisie par l'opérateur en fonction de l'ion qu'il désire étudier, donc constante. Par conséquent, si l'on effectue un balayage de B et, simultanément, un balayage de E qui maintient ce rapport constant, seuls sont détectés les ions fragments, formés avant B et E (donc en première région hors-champ) à partir du précurseur m 1. C'est ce que l'on appelle un balayage combiné à rapport B/E constant qui permet d'obtenir, en mode métastable ou sous collision, un spectre d'ions-fils. Les spectres de ce type sont généralement bien résolus, les fragments formés ayant subi l'effet de la double focalisation par E et en B. Il existe d'autres types de balayages combinés destinés à étudier les ions en première région hors champ. D'après les équations 21 et 25, on peut démontrer que le rapport B* 2 /E* ne dépend que de m 2. Le spectre obtenu ne montrera alors que les ions précurseurs du fragment m 2 : cela conduit à un spectre d'ions précurseurs (ou "parents"). De même, le rapport B* 2 (1-E')/E' 2 avec E'= E*/E 0 ne dépend que de m n. Le balayage combiné de B et de E qui maintient cette relation constante permet donc de détecter tous les ions fragments issus de la décomposition de précurseurs par perte d'un neutre de masse m n : cela fournit un spectre de perte de neutre. Les trois modes de balayages combinés précédemment décrits sont représentés classiquement par trois courbes dans le plan B-E: Remarque: les balayages combinés ne m 2 constituent pas à proprement parler des méthodes de MS/MS puisqu'il n'y a pas I m 1 m 2 d'isolement physique d'un ion précurseur 2 /m 1 particulier. Lorsque l'on réalise, par B exemple, une expérience de balayage combiné dans des conditions de CAD, il faut avoir présent à l'esprit que tous les B/E ions issus de la source, quels qu'ils soient, E vont subir la collision. La spécificité de B 2 (1-E')/E' 2 E* l'analyse ne provient que de la valeur de la constante correspondant à l'équation du balayage effectué. Pour cette raison, entre B 2 /E autres, ces techniques ne sont pas exemptes d'artefacts. 0 E 0 Spectre de balayage combiné à rapport B/E constant de deux composés stéréoisomères (IE, 20 ev, ions métastables)

8 31 - Appareils magnétiques tandems vrais (MS/MS vraie de haute énergie) Ces appareils ont des cellules de collision localisées dans l'espace intermédiaire situé entre chacun des deux analyseurs magnétiques. Ce sont des instruments qui correspondent en effet à deux spectromètres magnétiques disposés bout à bout avec une cellule de collision entre les deux. Ce sont des appareils que l'on peut considérer comme tandems "vrais" dans la mesure où, comme le triple quadripôle, ils offrent sur le (ou les) précurseur(s) comme sur le (ou les) fragment(s) une analyse ionique en masse. Dans ce cas les problèmes de résolution sur les ions parents et fils sont effacés, la résolution sur les uns et les autres étant celle offerte respectivement par le premier et le second analyseur. Puisqu'il existe plusieurs géométries possibles pour les instruments conventionnels (EB, BE, EBE), les tandems magnétiques peuvent revêtir plusieurs configurations (EB-EB, BE-BE, EBE-BE, etc ). Avantages: a. gamme de masse relativement étendue b. bonne résolution c. obtention d'empreintes digitales (collision de haute énergie) d. mécanismes de dissociation particuliers (haute énergie) e. parfois, possibilité de MS/MS/MS Inconvénients: a. coût d'achat et d'installation élevé b. faible transmission du faisceau ionique sur les appareils à géométrie étendue c. faible rendement des collisions à plusieurs kev d'énergie de collision. Le problème de sensibilité ainsi posé a été en grande partie résolu par l'apparition d'une nouvelle génération de détecteurs multicanaux. Méthode cinétique (R. Graham Cooks) Cette méthode permet d'évaluer de façon comparative la basicité, l'acidité ou l'affinité cationiques en phase gazeuse de composés organiques. Cette méthode est basée sur le rendement compétitif d'un ion complexe. Exemple de la basicité: Soient deux composés, A et B, dont il s'agit de comparer l'affinité protonique. AH + B k 1 AH + + B k 2 BH + + A Les rendements, exprimés comme l'abondance relative des monomères protonés AH + et BH +, peuvent être reliés à la différence d'affinité protonique entre les deux composés. T eff est la température effective du dimère protoné (AP: affinité protonique; R: constante des gaz parfaits): Ln (k 1 /k 2 ) = Ln ([AH] + /[BH + ]) = (AP)/RT eff Le dessin de Ln(k 1 /k 2 ) en fonction de l'affinité protonique de composés de référence fournit donc une droite sur laquelle il est aisé de retrouver l'affinité protonique d'un composé inconnu à partir de la valeur expérimentale de Ln (k 1 /k 2 ).