Le Transport Nucléo-cytoplasmique

Transcription

1 Biologie Cellulaire et Moléculaire des Eucaryotes UE LV 326 Le Transport Nucléo-cytoplasmique Cours 1 Isabelle Guillet-Deniau Institut Cochin

2 Le transport nucléo-cytoplasmique 1. Le noyau Structure Fonctions 2. Nécessité d un transport nucléaire Protéines ARN 3. Le transport nucléaire Import, export Diffusion passive, transport actif 4. Structure du complexe du pore nucléaire Nucléoporines 5. Les signaux d adressage NLS, NES

3 6. Les récepteurs d import nucléaire Karyophérines! Adaptateurs (importine " /Karyophérine ") 7. Le système Ran Gradient RanGTP/RanGDP RanGEF, RanGAP 8. Les mécanismes d import/export Transport des Protéines Transport des ARN 9. L import nucléaire des facteurs de transcription SREBP-1c!-caténine

4 Structure de la cellule animale

5 1. La structure du noyau Enveloppe nucléaire Membrane Nucléaire interne Membrane Nucléaire externe Membrane du RE Lumière du RE L enveloppe nucléaire est constituée d une bi-couche lipidique. L espace périnucléaire est en continuité avec la lumière du RE. Espace périnucléaire Complexe du pore nucléaire Lamina nucléair e Les pores nucléaires assurent un transport bi-directionnel.

6 L enveloppe nucléaire et la lamina Protéine intégrale Cytoplasme Membrane externe Membrane interne Complexe du Pore nucléaire Ribosome Espace Intermembranaire Noyau Hétérochromatine Lamina Les lamines participent à la rigidité du noyau

7 Structure de la lamina

8 Structure de la membrane nucléaire NPC Nucleus Inner membrane Outer membrane Cytoplasm OR : outer ring IR : inner ring 100 nm

9 Les différentes fonctions du noyau Stockage de l information génétique (ADN chromosomique) Réplication de l information génétique Transcription de l information génétique (ARNm) Export de l information génétique

10 Le noyau contient les chromosomes Le génome humain comporte 23 paires de chromosomes.

11 Architecture fonctionnelle du noyau Gène activé Territoire chromosomique Boucle géante Euchromatine Domaine centromérique nu Gènes transcrits Gènes inactivés Gènes transcrits Hétérochromatine Lamina Nucléaire Chromatine «riche en gènes» Chromatine «pauvre en gènes»

12 Structure du nucléole Site d assemblage des ribosomes

13 2. Nécessité d un transport nucléaire Les protéines impliquées dans les fonctions du noyau sont synthétisées dans le cytosol (histones, ADN et ARN polymérases, facteurs de transcription ). Au cours de la division cellulaire, l enveloppe nucléaire est détruite: les composés nucléaires et cytoplasmiques sont mélangés. Ces composés doivent être redistribués après la division cellulaire et la reconstitution de l enveloppe nucléaire. Les ARNt et ARNm sont synthétisés dans le noyau, puis exportés dans le cytosol. Les protéines ribosomales sont synthétisées dans le cytosol, importées dans le noyau, assemblées avec des ARNr, puis ré-exportées vers le cytosol.

14 3. Le transport nucléaire Protéines Régulatrices Polymérases (ADN, ARN) Histones Cytosol 9 nm Entrée Cytosol EXPORT Sortie Noyau Activation de la transcription IMPORT Noyau ARNm, ARNt Protéines Régulatrices

15 La diffusion à travers les pores nucléaires 5000 Daltons Daltons > Daltons Diffusion Passive Diffusion Passive lente Pas de diffusion Le pore nucléaire est un canal aqueux qui permet la diffusion des molécules inférieures à 50kDa. Les molécules de taille supérieure à 50kDa sont transportées activement.

16 4. Le complexe des pores nucléaires Structure des pores nucléaires Filament cytoplasmique Anneau cytoplasmique Mb externe Domaine Luminal Mb interne Anneau nucléaire Panier nucléaire Anneau distal D après Nakielny et Dreyfuss, Cell, 1999

17 Les protéines du pore nucléaire (NPC) Nup : nucléoprotéines (30 à 50) Répétition séquences FG (Phe-Gly) POM : protéines membranaires

18 L ouverture des pores nucléaires L ouverture des pores nucléaires dépend de la concentration en Ca ++

19 Pore nucléaire Enveloppe nucléaire Euchromatine Nucléole Hétérochromatine Pars granulosa Pars fibrosa Centre d organisation nucléolaire Reticumum Endoplasmique rugueux Les particules s alignent avant d être importées.

20 5. Les signaux d adressage Le signal est une séquence cible non clivable (protéine importée plusieurs fois dans le noyau). Nuclear Localization Signal: NLS (Séquence de Localisation Nucléaire) Signal d import : - Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val- (AA basiques chargés positivement) Nuclear Export Signal: NES (Séquence d Export Nucléaire) Signal d export : - Leu-X-Leu-X-Leu (hydrophobe) Le signal doit-être accessible : les protéines maintiennent leurs structures III et IV pendant l import. L import nucléaire est un transport actif GTP-dépendant.

21 Rôle des signaux d adressage Fluorescence nucléaire Fluorescence cytoplasmique A) Localisation de l antigène-t de SV40 contenant un NLS La protéine contenant un NLS normal va dans le noyau. La protéine contenant un NLS muté reste dans le cytoplasme. L intégrité des NLS est indispendable au ciblage nucléaire.

22 6. Les récepteurs d import nucléaire Récepteurs solubles qui accompagnent les protéines à travers les pores nucléaires. Les acteurs du transport:! Récepteurs de la famille des Karyophérines! - Importines - Transportines - Exportines! Ran : petite protéine G (Ras-related GTPase) Les karyophérines assurent le transport actif de la protéine cargo dans le noyau en présence de Ran. L énergie est apportée par l hydrolyse du GTP lié à Ran.

23 6.1 Les karyophérines! (14 membres chez la levure, 20 membres chez les mammifères Importines (90 à 130 kda) Site de liaison en C-terminal. Domaine(s) de liaison aux nucléoporines. Importine! 1 (karyophérine! 1 ) - Importe directement les protéines contenant un NLS ou via un adaptateur (importine "). - Importe directement les protéines ribosomales par interaction avec leur domaine BIB (Beta-like Import receptor Binding) Transportine 1 (karyophérine! 2 ) - Importe directement les hnrpn, protéines contenant un NLS qui sont associées aux ARNm.

24 Exportines Reconnaissent et lient les NES des protéines Stabilisation par liaison directe avec RanGTP Exportine 1 ou Crm 1 (Chromosome region maintenance) - Co-facteurs (RanBP1, Nxt1, RanBP3) : potentialisent la liaison aux NES, facilitent le relargage cytoplasmique CAS (cellular apoptosis susceptibility protein) - Récepteur d export des karyophérines " - Lie les karyophérines " et RanGTP - Complexe trimérique exporté dans le cytoplasme, puis dissocié après hydrolyse de RanGTP Exportine-t - Récepteur de transport saturable des ARNt modifiés - Interagit avec le NPC après association avec RanGTP - Libère l ARNt après dissociation du RanGTP

25 6.2 Les adaptateurs Importine! (karyophérine!) - Protéine (50kDa) qui interagit avec les NLS par son domaine C-terminal - Possède en N-terminal un domaine IBB de liaison aux karyophérines! (Importin! Binding domain) - Forme un complexe de transport trimérique avec la protéine cargo et la karyophérine! - Possède un site de liaison aux récepteurs d export CAS

26

27 6.3 Structure des karyophérines Karyophérine " Protéine N IBB ARMADILLOS AIS 40aa NLS NLS 25aa Régions variables!1,!2,!3,!4,!5 C IBB : domaine de liaison à la karyophérine " AIS : NLS interne ou signal d autoinhibition NLS : signal de localisation nucléaire ARM : 10 domaines répétés Armadillo Cristallisation de la karyophérine " sans son domaine IBB (Conti et al, Cell, 1998)

28 Karyophérine! B La karyophérine " comporte 19 HEAT (répétition d AA hydrophobes). Chaque HEAT est représenté par deux cercles correspondant aux Hélices-A et aux Hélices-B. Les sites de liaison de RanGTP, de la karyophérine! et des nucléoporines sont indiqués. (Bednenko et al, Traffic, 2003) Cristallisation de la karyophérine " avec le domaine IBB de la karyophérine!. Les domaines HEAT de la karyophérine " s enroulent autour de l IBB, formant une structure très compacte. (Cingolani et al, nature, 1999)

29 7. Le système Ran Ran: petite protéine G de la famille de Ras, qui peut être nucléaire ou cytoplasmique.! Ran cytoplasmique est complexé au GDP! Ran nucléaire est complexé au GTP Ran n interagit pas avec les mêmes partenaires en fonction de sa liaison au GTP ou au GDP. Dans le cytoplasme:! RanGAP (GTPase activating protein ) catalyse l hydrolyse du GTP lié à Ran (conversion RanGTP/RanGDP). Dans le noyau:! RanGEF (guanin exchange factor) induit le relargage du GDP lié à Ran et lie un nouveau GTP. (RanGDP RanGTP)! RanGTP induit la dissociation du NLS d avec le récepteur d import nucléaire.

30 Le cycle RanGTP/RanGDP NOYAU CYTOPLASME ELEVÉ RanGTP RanGTP FAIBLE NPC GDP GTP RanGEF RanGAP RanBP1 (BP2) Pi FAIBLE RanGDP RanGDP ELEVÉ Enveloppe nucléaire Le gradient de RanGTP confère la direction du transport

31 Cycle de Ran et Transport nucléaire NTF2: Nuclear Transport Factor 2 RanGTP RanGTP RanGEF (RCC1): Facteur d échange de Ran RanGAP: GTPase Activating Protein

32 Les importines s associent avec le NLS de la protéine cargo et la transporte au niveau du pore nucléaire. 2. Le complexe importines/cargo traverse le pore (mécanisme mal connu). 3. Dans le noyau, RanGTP déplace la protéine cargo des importines. 4. Le complexe exportines/rangtp/cargo sort du noyau à travers le pore. 5. Dans le cytosol, RanGAP hydrolyse le RanGTP en RanGDP. 6. Ran-GDP se dissocie des exportines.

33 8.1 Le transport des protéines Passage à travers le pore nucléaire sans transporteur.! import de la!-caténine sans NLS ni système Ran grâce aux répétitions ARM de son domaine central Structure Armadillo de la "-caténine

34 La voie canonique Wnt-!-caténine Off Wnt On LRP Cytoplasme "-TrCP Ubiquitination G! Frizzled Dish GBP CK1/2 APC "-caténine P Axine P P GSK-3 CK1 Proteasome PP2A LRP "-caténine active Translocation Wnt Frizzled G! P Dish GBP CK1/2 GSK-3 "-caténine active Tcf/Lef Noyau "-caténine active!-caténine Myf5, MyoD E-cadhérine Membrane plasmique Dégradation!-caténine Survie Prolifération Différenciation

35 Transport par les karyophérines "! Protéine-NLS importée après association avec une karyophérine! en présence de RanGTP.! Voie utilisée par des facteurs de transcription (CREB, Jun, Fos, SREBP-2)! Voie utilisée par les protéines rétrovirales Rev et Tat de HIV1.! Les karyophérines! ( sous forme de mono- ou d hétérodimères) transportent les histones: Importine 5 Importine 7 Importine 9 Transportine Karyophérine! 1

36 Import par les karyophérines! Hydrolyse du GTP Relargage importine " 5 Le complexe RanGTP/ importine " retourne dans le cytoplasme 4 3 RanGTP se lie à l importine " et relâche la protéine dans le noyau GDP 2 Transport du complexe protéique dans le noyau Importine " Protéine ciblée vers le noyau 1 Liaison de la protéine cargo à l importine " Direction vers un pore

37 Transport par les complexes karyophérines!/"! La karyophérine " reconnait le NLS de la protéine et s associe à la karyophérine!.! Le complexe induit le changement de conformation de la karyophérine ".! La karyophérine! facilite l entrée du complexe dans le noyau par interaction avec les nucléoporines.! Dans le noyau, RanGTP lie la karyophérine! et entraîne la dissociation du complexe.! La protéine NLS est relâchée dans le nucléoplasme.! La karyophérine " est recyclée dans la cytoplasme par la protéine d export CAS associée au RanGTP.! La karyophérine! associée au RanGTP est exportée du noyau.

38 Import par RanGTP-karyophérines "/! + Protéine cargo NLS + GDP Ran RanGAP RanBP1 Karyophérine! Karyophérine " GTP Ran " NTF2!! " Cytosol "! GDP Ran RanGEF + GTP Ran Cargo NPC GTP Ran + CAS GTP Ran Enveloppe nucléaire Nucléoplasme

39 8.2 Le transport des ARNm 1. Les ARNm sont transcrits par l ARN polymérase II 2. Ils sont rapidement assemblés en particules contenant plusieurs ribonucléoprotéines RNP (A), (C) et des facteurs d épissage (S) 3. Après épissage, les ARNm sont pris en charge par la protéine Aly (reconnaissant la jonction exon-exon) associée à une hélicase (UAP56) et aux facteurs d export nucléaire Tap/Nxt. 4. L export de l ARNm mature est facilité par la protéine K"#2A (Transportine 1 ). 5. Au cours de l export, les RNP (C) sont dissociées par l hélicase présente au niveau du pore nucléaire (H). 6. Dans le cytoplasme, l ARNm va être traduit et les protéines (A), Tap/Nxt seront recyclées dans le noyau par K"#2B (Transportine 2).

40 Export nucléaire des ARNm ADN Noyau Cytoplasme Pol-II A A C S S AAA C UAP56 A K"#2B A Aly S T A P K"#2A A C Aly AAA C UAP56 T A P Nxt Nxt C C ARNm mature H H A T A P Nxt Traduction AAA A C Ribonucléoprotéines S Aly Facteurs d épissage Jonction Exon-Exon T A P Nxt UAP56 H Facteurs d export Hélicases K"#2A Transportine 1 K"#2B Transportine 2

41 Voies d export des ARN nucléaires D après Cullen, B. R. J Cell Sci 2003;116: