REGULATION 2 : INACTIVATION DU MPF ET SORTIE EN MITOSE

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1 REGULATION 2 : INACTIVATION DU MPF ET SORTIE EN MITOSE 1. La voie iquitine-protéasome de dégradation des protéines a. Le protéasome b. L'iquitine et l'iquitinylation des protéines 2. Les complexes d'iquitinylation a. Enzymes nécessaires b. Complexes E2-E3 c. Complexe APC-cyclosome 3. Contrôle de la progression en mitose par l'apc 4. La transition métaphase-anaphase (TMA) a. Nécessité de la destruction du lien entre chromatides b. Cohésines et cohésion des chromatides c. Couplage entre cohésion et réplication d. Restriction de la localisation des cohésines au centromère e. Cohésines-séparase-sécurine : séparation des chromatides f. Cohésines et méiose 5. Le "check-point mitotique" : contrôle de la TMA a. Définition et principe du check-point mitotique b. Mise en évidence du check-point mitotique c. Critères de surveillance du fuseau mitotique d. Mise en évidence des effecteurs Mad et B e. Mécanisme du check-point mitotique f. Sortie de mitose après la TMA 6. Le "check-point de sortie de mitose" a. La phosphatase Cdc14 b. Le réseau de sortie de mitose (mitotic exit network) c. Activation du réseau chez la levure

2 SORTIE DE MITOSE fuseau mitotique fonctionnel chromosomes en attachement bipolaire APC/cyclosome (protéolyse ciblée) cohésines chromokinésines séparation des chromatides-sœurs contrôle coordonné de la fin de mitose cycline B sortie de mitose

3 STRUCTURE DU PROTEASOME Protéasomes 20S et 26S d'érythrocytes bovins (observation en micrographie électronique à contraste négatif) Schéma de la progression d'une protéine à travers le canal central d'un protéasome 26S

4 COMPLEXES D'UBIQUITINYLATION Complexes formés de 3 enzymes : E1 = Uba : enzyme d'activation E2 = Ubc : enzyme de conjugaison E3 : Ubr : enzyme de reconnaissance (iquitine ligase) associées à des sous-unités régulatrices et de spécificité de sstrats Complexes E2-E3 : Eléments-clefs pour la reconnaissance des sstrats à iquitinyler Deux modes de fonctionnement possibles selon les complexes E2-E3 : Complexe E2-E3 à domaine RING : E3 sstrat E1 E2-E3/S E2 Complexe E2-E3 à domaine HECT E3 sstrat E1 E2-E3/S E2

5 COMPLEXES D'UBIQUITINYLATION AU COURS DU CYCLE CELLULAIRE E1 (Uba) : - un seul type - aucune variation au cours du cycle cellulaire E2 (Ubc) : - plusieurs types (S. c. : 13 gènes; H. s. : 15 gènes) - faible variation au cours du cycle cellulaire - intervention dans des processus cellulaires distincts ( ex : Ubc2 : réparation de l'adn; Ubc10 : sortie de mitose) E3 (Ubr) : - plusieurs types - forte variation au cours du cycle cellulaire Au cours du cycle cellulaire, formation de différents complexes d'iquitinylation à activité fortement régulée. DEUX COMPLEXES IMPORTANTS POUR LE CYCLE CELLULAIRE COMPLEXE APC/C (anaphase-promoting complex/cyclosome) activité requise pour la transition métaphase-anaphase et la sortie de mitose COMPLEXE SPC (S-phase-promoting complex) (aussi appelé complexe SCF pour Skip1, Cullin, F-box) activité requise pour la transition G1/S Ces deux complexes ont une sous-unité E3 à domaine RING.

6 COMPLEXES D'UBIQUITINYLATION AU COURS DU CYCLE CELLULAIRE MPF SPC inactivé APC/C activable APC/C activé TMA M G2 G1 pas d'accumulation possible de cycline B S accumulation possible de cycline B POINT R APC/C inactivé SPC activé cycline-cdk G1 Le MPF pré-active l'apc/c en mitose, par phosphorylation de sous-unités renforçant leur affinité pour la sous-unité Cdc20. L'APC/C activable est gardé inactif par le point de contrôle jusqu'à la transition métaphase-anaphase TMA.

7 TRANSITION METAPHASE-ANAPHASE 2 évènements : séparation des chromatides-sœurs : dégradation du lien protéique sortie de mitose : dégradation de la cycline B Comment sont organisés ces deux évènements l'un par rapport à l'autre? cycline B N term C term domaine N term (D-box) cycline B 90 (non dégradable) + extrait cyclant d'œufs de Xénope compétition entre les D-boxes libres et les D-boxes des protéines à dégrader complexe E2-E3 d'iquitinylation piégé complexe APC non fonctionnel Résultat : pas de séparation des chromatides pas de dégradation de la cycline B pas de sortie de mitose + extrait cyclant d'œufs de Xénope pas de destruction de la cycline B 90 mais fuseau mitotique fonctionnel et chromosomes bien accrochés spindle assembly checkpoint pas alerté complexe APC fonctionnel Résultat : pas de dégradation de la cycline B MAIS, séparation des chromatides (blocage ultérieur de la sortie de mitose) A TMA, 2 événements distincts dépendant d'un même mécanisme APC activé séparation des chromatides désactivation du MPF

8 SCC1, SEPARASE, SECURINE Scc1 : sister chromatids cohesion 1 Séparase = Esp1 : extra spindle poles 1 Sécurine = Pds1 : precocious division of sister chromatids Scc1 est la cible de la séparase Esp1, séquestrée par la sécurine Pds1. Scc N term C term SLEVGRR SVEQGRR Scc1 mutée sur 1 site de coupure = séparation des chromatides Scc1 mutée sur 2 sites de coupure = pas de séparation des chromatides Le clivage de Scc1 est bien la cause de la séparation des chromatides.

9 ET SEPARATION DES CHROMATIDES PROTEASOME APC Cdc20 D-box cycline A Cdc20 APC APC activé D-box cycline A Cdk2 Y 15 T 14 T 160 P Esp1 D-box Pds1 (sécurine) Cdk2 Y 15 T 14 T 160 Esp 1 (séparase) séquestrée Pds1 PROTEASOME Esp 1 active Esp1 D-box Pds1 Pds1 iquitinylée dégradation de Scc1 cohésines désorganisées TMA cohésines séparation des chromatides-sœurs

10 CONTROLE DE L'ACTIVITE SEPARASE AU COURS DU CYCLE MPF cycline A dégradée + sécurine dégradée = séparase activée = Scc1 dégradée APC/C activable APC/C activé TMA M G2 G1 pas d'accumulation possible de Scc1 dans la cellule S POINT R accumulation possible de Scc1 mise en place des cohésines APC/C inactivé cycline A cycline-cdk G1 en plus, séparase inactivée par cyca/cdk2 = SECURITE Cdk2 Y 15 T 14 T 160 P accumulation de sécurine = séparase inactivée Mise en place des cohésines possible seulement en fin de G1 et en S : avant fin de G1, impossible car séparase activée, donc Scc1 dégradée après S, impossible car Eco1 dégradée et fourches de réplications déjà passées

11 MISE EN EVIDENCE DU CHECK POINT MITOTIQUE Cellules en culture + nocodazole ou taxol blocage du cycle cellulaire en mitose APC/C non activé : voie Ub-protéasome non fonctionnelle : sécurine non dégradée séparase inactive cohésines intactes pas de séparation des chromatides cycline B non dégradée activité MPF maintenue pas de sortie de mitose Un point de contrôle donne l'autorisation de poursuivre la mitose en surveillant l'état et l'organisation du fuseau mitotique NEB capture du dernier kinétochore TMA temps très variable constant (20 mn) Tout se passe comme si l'attachement du dernier kinétocohore était l'évènement ultime que le point de contrôle surveillait pour donner le feu vert à la transition métaphase-anaphase. ORGANISATION POSSIBLE DU POINT DE CONTROLE kinétochore "libre" : anomalie signal inhibiteur alerte du point de contrôle mitose bloquée kinétochore? : OUI, car si destruction au laser, la TMA est initiée

12 ORGANISATION DU CHECK POINT MITOTIQUE 1 (Nicklas R. B. et Rieder C. L., 1990) Cellules de grande taille en chambre d'observation sous microscope micro-manipulateur : analyse cytologique PERTURBATION DE L'ORGANISATION DU FUSEAU MITOTIQUE Témoin Observation : tous les chromosomes en attachement bipolaire : passage en anaphase 15 mn après Destruction de l'attachement bipolaire à l'aide d'une micro-aiguille Observation : passage en anaphase bloqué CHECKPOINT ALERTE Traction exercée à l'aide d'une micro-aiguille Observation : passage en anaphase rétabli 15 mn après CHECKPOINT DETIVE

13 ORGANISATION DU CHECK POINT MITOTIQUE 2 (Campbell M. S. et Gorbsky G. J., 1995) Cellules de grande taille en chambre d'observation sous microscope micro-manipulateur : analyse cytologique fixation et immunofluorescence : analyse biochimique RELATION ENTRE OBSERVATION ET EVENEMENT BIOCHIMIQUE Anticorps monoclonal 3F3/2 : épitope phosphorylée (plusieurs protéines) Témoin Observation : tous les chromosomes en attachement bipolaire : passage en anaphase 15 mn après Immunofluorescence : pas de marquage chromosomique Destruction de l'attachement bipolaire à l'aide d'une micro-aiguille Observation : passage en anaphase bloqué Immunofluorescence : marquage des kinétochores du chromosome mal attaché Traction exercée à l'aide d'une micro-aiguille Observation : passage en anaphase rétabli 15 mn après Immunofluorescence : plus de marquage des kinétochores du chromosome "tracté"

14 ORGANISATION DU CHECK POINT MITOTIQUE 3 (Campbell M. S. et Gorbsky G. J., 1995) Résultat d'une expérience d'immunofluorescence avec l'anticorps 3F3/2 (A et B : métaphase précoce; C et D : anaphase précoce) Expérience de micro-injection de l'anticorps 3F3/2 dans des cellules en prophase : fixation de l'anticorps sur ses épitopes ralentissement de leur déphosphorylation passage en TMA retardé d'autant MODELE POSSIBLE DE FONCTIONNEMENT DU CHECKPOINT : kinétochores phosporylés attachement bipolaire tension kinétochores déphosporylés 15 mn Transition métaphase-anaphase

15 ORGANISATION DU CHECK POINT MITOTIQUE 4 Analyse de mutants de Saccharomyces cerevisiae (budding yeast) traités au bénomyl (benzimidazole), drogue dépolymérisante des microtules. cellules sauvages témoins métaphase : fuseau fonctionnel cellules sauvages + bénomyl métaphase : fuseau altéré TMA TMA cellules mutantes + bénomyl métaphase : fuseau altéré TMA Mutants du check-point mitotique Gènes concernés identifiés par clonage fonctionnel : gènes Mad (pour Mitotic arrest deficient) : Mad1, Mad2, Mad3* gènes B (pour Budding uninhibited by benomyl) : B1, B3 gène Msp (pour Monopolar spindle) : Msp1 Toutes les protéines codées par ces gènes sont associées au domaine externe du kinétochore en prophase ou prométaphase. Elles le quittent dès que les chromosomes sont attachés au fuseau mitotique. (* : Mad3 = BR1 chez les Mammifères)

16 CHECK POINT MITOTIQUE : Mad2 versus 3F3/2 2 critères sont surveillés au niveau des kinétochores par le check point mitotique : attachement : capture par les microtules tension : treadmilling + moteurs des microtules. + taxol : microtules figés sans dynamique nouvelle situation : attachement sans tension Tension mesurable par la distance inter-kinétochorienne témoin + taxol 2,6 nm 1,2 nm Analyse de la présence de Mad2 et des épitopes phosphorylés Stade Attachement Tension Ab Mad2 Ab 3F3/2 prométaphase +/ métaphase témoin métaphase taxol Conclusions : Mad2 répond à l'absence d'occupation des kinétochores par les microtules présente si le kinétochore est libre (chromosome pas attaché) 3F3/2 répond à l'absence de tension au kinétochore phosphorylation(s) si le kinétochore est "mou" (chromosome pas sous tension)

17 CHECK POINT MITOTIQUE : Mad2, B1, BR1 et 3F3/2 Cellules + concentrations croissantes de sulfate de vinblastine : [nm] : microtules figés sans dynamique attachement sans tension aux kinétochores [µm] : microtules dépolymérisés pas d'attachement aux kinétochores Tension mesurable par la distance inter-kinétochorienne Analyse de la présence de Mad2, B1, BR1 et des épitopes phosphorylés Vinblastine Attachement Tension Ab Mad2 Ab B1/R1 Ab 3F3/2 [nm] [µm] Conclusions : Mad2 répond à l'absence d'occupation des kinétochores par les microtules présente si le kinétochore est libre (chromosome pas attaché) 3F3/2 répond à l'absence de tension au kinétochore phosphorylation(s) si le kinétochore est "mou" (chromosome pas sous tension) B1 et BR1 répondent à l'absence de tension au kinétochore présentes si le kinétochore est "mou" (chromosome pas sous tension) corrélation entre présence de B1 et BR1 et phosphorylations au kinétochore ces protéines sont effectivement des kinases ces kinases sont actives tant que le kinétochore n'est pas sous tension.

18 CHECK POINT MITOTIQUE : ROLE CENTRAL DE MAD2 Extrait d'œufs fécondés de xénope + nocodazole : checkpoint mitotique alerté blocage de l'extrait en mitose Extrait d'œufs fécondés de xénope immunodéplété en Mad2 + nocodazole : checkpoint mitotique inactif sortie de mitose de l'extrait Extrait d'œufs fécondés de xénope + nocodazole : checkpoint mitotique alerté + anticorps anti-mad2 checkpoint mitotique inactivé sortie de mitose de l'extrait Extrait d'œufs fécondés de xénope + nocodazole : checkpoint mitotique alerté co-immunoprécipitation de Mad2 avec Cdc20 Conclusions : Mad2 joue un rôle central dans le checkpoint mitotique en inhibant l'apc/c, tant qu'elle est présente et active dans la cellule.

19 SORTIE DE MITOSE APRES LA TMA Principe : levée coordonnée des verrous successifs par l'apc/cyclosome B1 BR1 Mad2 Cdc20 APC Pds1 Esp1 chromok. cohésines TMA voie FEAR* voie B2 Cdc14 Ase1 Anaphase Cdh1 Cdh1 APC PoloK CycB Cdc20 Fin mitose *voie FEAR : Cdc Fourteen Early Anaphase Release