TP 10: Bio analyses et contrôles d une production enzymatique

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1 TP 10: Bio analyses et contrôles d une production enzymatique Cette séance poursuit le travail précédent et garde l esprit des séances en cours. Mais nous travaillons cette fois-ci sur une enzyme produite au lycée. On souhaite déterminer ces paramètres enzymatiques et les comparer aux résultats officiels de cette enzyme. Les objectifs de cette séance : - Réaliser une étude enzymatique en fonction du temps et faire le lien avec la vitesse initiale. - Faire une cinétique enzymatique en fonctions des concentrations en substrat pour déterminer des paramètres - Etude de l influence du ph sur l activité de l enzyme. - Travailler dans un temps donné et rendre des résultats. Dans cette première partie, les étudiants doivent déterminer les paramètres chimiques et des paramètres cinétiques de la phosphatase alcaline. Pour ces exercices, les étudiants doivent faire une dilution au 1/10 de l enzyme. A vérifier avec les enseignants Ph.A Biotechnologies.education page 1

2 I Un peu de bibliographie simple sur l enzyme étudiée. Les phosphatases sont des enzymes à très large spécificité, hydrolysant le radical phosphoryle porté par une liaison ester ou anhydride... On les divise en plusieurs classes en fonction de leur ph optimum d'action : phosphatases acides, phosphatases alcalines. Certaines phosphatases ont une spécificité de substrat plus étroite : 5' nucléotidase. La réaction catalysée par les phosphatases est irréversible, mais certaines sont capables d'échanger le radical phosphate à partir de molécules plus riches en énergie comme le pyrophosphate. La phosphatase alcaline du commerce est celle extraite de l'intestin de veau. Une unité d'enzyme catalyse l'hydrolyse d'une micromole de paranitrophénylphosphate par minute à 37 C. La phosphatase alcaline est utilisée au laboratoire pour déphosphoryler les extrémités 5' des acides nucléiques, soit pour préparer un marquage en 5' par une polynucléotide kinase, soit pour empêcher la réannéalisation d'un ADN circulaire linéarisé (vecteurs de clonage Ph.A Biotechnologies.education page 2

3 L origine de l enzyme : Cette enzyme provient de la production du lycée et de plusieurs séquences de biotechnologie : Choix de l enzyme : Production de l enzyme Extraction de l enzyme par quatre méthodes Contrôle des essais Ph.A Biotechnologies.education page 3

4 II Etude expérimentale de la phosphatase alcaline. I.1 Détermination des conditions de vitesse initiale. Rappel : Faire une dilution de 1/10 de l enzyme. Pour cette manipulation introduire dans un tube à essai: Solution de PNPP à 5 mmol L-1 Eau distillée Tampon glycine NaOH 4 ml 0.6 ml 4 ml Préincuber le tube à 37 C Ajouter 400 microlitres de la solution d enzyme fournie Homogénéiser et lancer le chronomètre Faire un prélèvement de 1 ml de cette solution à 0, 30 sec, 1 min, 1 min 30, 2 min, 3 min, 4 min et 5 mn en plaçant le prélèvement dans 2 ml de soude à 2 mol.l-1. Lire l absorbance à 405 nm contre un blanc. Tout sauf l enzyme / Consigner les résultats obtenus dans la fiche résultats fournie. Questions 1 Donner une définition de la vitesse initiale et le but de cette manipulation. 2 Déduire de ces résultats les conditions de vitesse initiale. I.2 Détermination du ph optimal. Lire et discuter avec son binôme sur la marche à suivre! Introduire dans une série de tube à hémolyse Solution de PNPP à 5 mmol L-1 Eau distillée Tampon glycine NaOH à différents ph. ph : ml 0.8 ml 1 ml Préincuber les tubes à 37 C Ajouter 50 microlitres de la solution enzymatique préalablement diluée fournie dans chaque tube et arrêter la réaction après 2 minutes avec 1 ml de soude à 2 mol.l-1.chaque tube doit avoir 2 minutes de réaction. Lire l absorbance à 405 nm contre un blanc : l air, de l eau Comment faire!! Consigner les résultats obtenus dans la fiche résultats fournie. Questions 3 Déduire de ces résultats le ph optimal de l enzyme 4 Expliquer en détaillant votre réponse l importance du ph sur la réaction enzymatique. Préciser comment le ph peut agir su l enzyme 5 Avons-nous un lien entre le ph de l enzyme et son nom? Ph.A Biotechnologies.education page 4

5 I.3 Détermination des paramètres cinétiques de l enzyme. Introduire dans une série de tubes : Volume en ml Tube Solution de PNPP à 5 mmol L-1 Eau distillée Tampon glycine NaOH ph optimal Préincuber les tubes à 37 C Ajouter 50 microlitres de la solution d enzyme fournie (en décalant toutes les minutes) dans les tubes 1,3,5,7 et 9 Homogénéiser et lancer le chronomètre au 1 er tube. Stopper la réaction après 2 minutes avec 1 ml de soude à 2 mol.l-1 Lire l absorbance à 405 nm contre le blanc. A déterminer. Vérifier que les absorbances augmentent. Consigner les résultats obtenus dans la fiche résultats fournie. Faire une représentation graphique de vos résultats pour répondre à la question suivante. Questions : 6 Après avoir tracé la droite, donner les paramètres expérimentaux étudiés dans cette partie. 7 Donner une définition de ces paramètres De l aide!: Les paramètres étudiés dans cette partie sont le KM et le VM. Pour déterminer ces valeurs vous devez réaliser le graphe de Lineweaver er Buck. : Si vous ne savez pas, regardez votre cours. Bon courage. Ph.A Biotechnologies.education page 5

6 Fiche résultats : 2pages A rendre à la fin de la séance avec les courbes. 1 Détermination des conditions de vitesse initiale Temps Absorbance à 405 nm Faire la courbe. Absorbance en fonction du temps. Questions 1 Donner une définition de la vitesse initiale et le but de cette manipulation. 2 Déduire de ces résultats les conditions de vitesse initiale. 2 Détermination du ph optimal ph Absorbance à 405 nm Faire la courbe : Absorbance en fonction du ph. 3 Déduire de ces résultats le ph optimal de l enzyme 4 Expliquer en détaillant votre réponse l importance du ph sur la réaction enzymatique. Préciser comment le ph peut agir su l enzyme 5 Avons nous un lien entre le ph de l enzyme et son nom? Ph.A Biotechnologies.education page 6

7 3 Détermination des paramètres cinétiques de l enzyme Volume de PNPP 5 mmol L-1 Absorbance à 405 nm 6 Après avoir tracé la droite, donner les paramètres expérimentaux étudiés dans cette partie. 7 Donner une définition de ces paramètres Ph.A Biotechnologies.education page 7

8 Fiche de préparation pour le TP. Matériel / Poste de travail. - Un bain thermostaté à 37 C - Une série de micro pipette - Tubes à essai - Tubes à hémolyses - Chronomètre - Cristallisoir avec de la glace pilée - Thermomètre - Cônes P200, P1000 Réactifs / poste de travail. - PAL diluée dans du tampon Glycine NaOH ph=9.8. Prendre 1µL dans 5 ml de tampon. - Tampon glycine NaOH ph 10.5 à 0.1 mol.l-1 : Pour un litre : 542 ml à 0.2 mol L ml de NaOH à 0.2 mol L-1 + MgCl2 1 mmol L-1 +ZnCl2 à 0.1 mmol L-1 avec une vérification du ph - Solution de Glycine /NaOH à différents ph : Solution de PNPP à 5 mmol. L-1. Substrat / - Coef d extinction molaire du PNP, produit de la réaction = M -1 cm -1 - Eau distillée - NaOH 2M Ph.A Biotechnologies.education page 8