STANDARDISATION DE L ANTIBIOGRAMME A L ECHELLE NATIONALE

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2 République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de la Santé, de la Population et de la Réforme Hospitalière Ministère de l Agriculture et du Développement Rural Réseau Algérien de la Surveillance de la Résistance des Bactéries aux Antibiotiques STANDARDISATION DE L ANTIBIOGRAMME A L ECHELLE NATIONALE (MEDECINE HUMAINE ET VETERINAIRE) Document édité avec la collaboration de l OMS 6 ème Edition

3 Editions précédentes : Fascicules de Standardisation de l Antibiogramme à l échelon national: En Médecine Humaine En Médecine Vétérinaire 1 ère édition 2 ème édition ère édition ème édition ème édition ème édition ème édition ème édition ème édition 2008 Fascicules de Surveillance de la Résistance des Bactéries aux Antibiotiques: 1 ère édition 2 ème édition 3 ème édition ème édition 08 ème édition 09 ème édition 4 ème édition ème édition 5 ème édition 6 ème édition ème édition CD ROM : «Standardisation de l antibiogramme à l échelle nationale selon les recommandations de l OMS»

4 Comité d organisation : K. Rahal (Institut Pasteur d Algérie - Alger) A. Benslimani (EHS Dr Maouche - Alger) H. Tali-Maamar (Institut Pasteur d Algérie - Alger) M. F. K. Missoum (Institut National de Santé publique - Alger) S. Kechih- Bounar (LVR Draa Ben Khedda- Tizi Ouzou) H. Ammari (CHU Béni Messous - Alger) Comité des experts médicaux: W. Amhis (EPH Bologhine- Alger) H. Ammari (CHU Béni Messous - Alger) R. Belouni (CHU Blida - Blida) N. Benamrouche (Institut Pasteur d Algérie - Alger) A. Benslimani (EHS Dr Maouche - Alger) M. N.Ouar - Korichi (EHS El Hadi Flici - Alger) R.Laliam- Zenati (Institut Pasteur d Algérie - Alger) A. S. Merad (Institut Pasteur d Algérie - Alger) M. Naim (Hôpital Central de l Armée - Alger) M. F. K. Missoum (Institut National de Santé Publique - Alger) K. Rahal (Institut Pasteur d Algérie - Alger) F. Smati (CHU Constantine - Constantine) H. Tali-Maamar (Institut Pasteur d Algérie - Alger) Comité des experts vétérinaires: A. Aboun (Institut Pasteur d Algérie Alger- Annexe de Kouba) S. Bait (LVR Laghouat- Laghouat) N. Belguendouz (LVR El Tarf- El Tarf) S. Benbernou (LVR Mostaghanem- Mostaghanem) S. Benelkadi (LCV El Harrach- Alger) S. Kechih-Bounar (LVR Draa Ben Khedda- Tizi Ouzou) H. Koutchoukali (LVR Constantine- Constantine) S. Ouali Chaouche (LVR Tlemcen- Tlemcen) Collaboration technique : M. Bouheraoua (Institut Pasteur d Algérie - Alger) R. Laliam - Zenati (Institut Pasteur d Algérie - Alger) C. Mahieddine (Institut Pasteur d Algérie - Alger) Corrigé par : H. Ammari (CHU Beni Messous- Alger) A. Benslimani (EHS Dr Maouche - Alger) K. Rahal (Institut Pasteur d Algérie - Alger) H. Tali-Maamar (Institut Pasteur d Algérie - Alger) S. Kechih- Bounar (LVR Draa Ben Khedda- Tizi Ouzou) 3

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6 Sommaire Préambule 11 I. Médecine humaine 13 Liste des antibiotiques à tester 15 Techniques Antibiogramme par diffusion des disques Détermination de la CMI Technique de dilution en gélose Technique de dilution en milieu liquide Technique du E-test Tests complémentaires Recherches particulières Autres bactéries 79 Automatisation des tests de sensibilité aux antibiotiques 95 Contrôle de qualité de l antibiogramme 107 Recommandations et suggestions 117 Whonet II. Médecine vétérinaire 129 Liste des antibiotiques à tester 131 III. Références bibliographiques 137 IV. Annexes 141 V. Tables de lecture en médecine humaine 157 VI. Tables de lecture en médecine vétérinaire

7 β-lactamines Pénicilline Oxacilline Cloxacilline Ampicilline Amoxicilline Amoxicilline+Ac.clavulanique Ticarcilline Ticarcilline +Ac.clavulanique Pipéracilline Céfalexine Céfazoline Céfalotine Céfpirome Céfoxitine Céfotaxime Céfotétan Céfotétan+400µg Ac boronique Céftiofur Céftriaxone Céftazidime Cloxacilline Aztréonam Imipénème Céfuroxime Pipéracilline+ tazobactam Céftazidime+ac clavulanique Acide clavulanique Imipénème+EDTA Méropénème Ertapénème PEN OXA CLOX AMP AMX AMC TIC TCC PIP LEX CZO CEF CPO FOX CTX CTT CTT+bor TIO CRO CAZ CLOXA ATM IPM CXM TAZ CAZ CLAV AC IM+ED MER ERT PHENICOLES Chloramphénicol POLYPEPTIDES Colistine GLYCOPEPTIDES Vancomycine Teicoplanine SULFAMIDES ET ASSOCIES Triméthoprime Triméthoprime+ sulfaméthoxazole QUINOLONES Acide nalidixique Ofloxacine Ciprofloxacine Lévofloxacine NITROFURANTOINES Furanes CHL COL VAN TEC TMP SXT NAL OFX CIP LVX NIT AMINOSIDES Gentamicine Gentamicine Haut niveau Streptomycine Streptomycine Haut niveau Kanamycine Amikacine Tobramycine Nétilmicine Spectinomycine Néomycine CYCLINES Tétracycline Doxycycline MACROLIDES Erythromycine Azithromycine Clindamycine Pristinamycine Spiramycine Tilmicosine GEN GEH STR STH KAN AMK TOB NET SPT NEO TCY DOX ERY AZM CLI PRI SPI TIL AUTRES Acide fusidique Rifampicine Fosfomycine Autres abréviations Céphalosporines de 1 ère génération Quinolones Ethylène- diamino-tétra-acétique Acide dipicolinique Acide boronique Mueller- Hinton Mueller- Hinton liquide ajusté en cations Mueller- Hinton base ajusté en cations Mac Farland Inhibiteur de β-lactamase Hautement chargé Pneumocoque de sensibilité diminuée à la pénicilline FUS RIF FOS C1G QUI EDTA DPA BOR MH MHLAC MHBAC MF IBL HC PSDP 6

8 Liste destableaux Tableau 1 Liste des antibiotiques à tester pour les bactéries non exigeantes 17 Tableau 2 Liste des antibiotiques à tester pour les bactéries exigeantes 18 Tableau 3 Résistances naturelles chez les entérobactéries 19 Tableau 4 Résistances naturelles chez les bacilles à Gram négatif non fermentaires 20 Tableau 5 Technique d antibiogramme (diffusion de disques antibiotiques) 27 Tableau 6 Souches de contrôle de qualité de l antibiogramme 28 Tableau 7 Tableau 8 Techniques de détermination de la CMI pour certaines bactéries selon les recommandations du CLSI 29 Techniques de détermination de la CMI des antibiotiques pour les bactéries à croissance difficile ou rarement incriminées (CLSI M100-S21 et M45) 30 Tableau 9 Schéma pour la préparation des dilutions d antibiotiques 33 Tableau 10 Schéma du mode opératoire (CMI par technique de dilution en milieu liquide) 35 Tableau 11 Tableau récapitulatif des différentes recherches complémentaires 41 Tableau 12 Recherche de la résistance à l oxacilline et interprétation des tests (méthode de diffusion des disques) 41 Tableau 13 Techniques utilisées pour la recherche de la résistance à l oxacilline 42 Tableau 14 Interprétation des tests de recherche de la résistance à l oxacilline 43 Tableau 15 Recherche de S.pneumoniae de sensibilité diminuée aux β-lactamines 47 Tableau 16 Valeurs critiques pour les CMI de S.pneumoniae 49 Tableau 17 Préparation des boîtes de cloxacilline (ou oxacilline) 55 Tableau 18 Phénotypes de résistance en fonction des différentes BLSE 57 Tableau 19 Phénotypes de résistance des souches synthétisant des céphalosporinases 67 Tableau 20 Classification des carbapénèmases 74 Tableau 21 Phénotypes de résistance en fonction des différentes carbapénèmases 74 Tableau 22 Liste des antibiotiques à tester pour les autres bactéries 81 Tableau 23 Tableau 24 CMI des macrolides, ofloxacine et triméthoprime+sulfaméthoxazole pour B. pertussis et B. parapertussis 85 Valeurs limites des CMI de la souche de référence utilisée pour le contrôle de qualité des CMI de Brucella spp. 88 Tableau 25 Pourcentage de résistance des Bacteroïdes du groupe fragilis isolés en Tableau 26 Automates permettant l identification des germes et leur antibiogramme 98 Tableau 27 Liste des antibiotiques testés par Microscan Walkaway SI par groupe de germes 99 Tableau 28 Liste des antibiotiques testés par Vitek 2 Compact par groupe de germes 100 Tableau 29 Liste des antibiotiques testés par Phoenix par groupe de germes 101 Tableau 30 Liste des antibiotiques testés par Vitek 2 compact (en médecine vétérinaire) 102 Tableau 31 Liste des groupes de germes identifiés en fonction des automates 103 Tableau 32 Souches de référence pour le contrôle de qualité interne (suivant les recommandations du fabricant) en fonction des automates 104 Tableau 33 Liste des tests utilisés en fonction des automates 105 Tableau 34 Liste des extensions des fichiers Whonet pour les laboratoires membres du réseau 127 Tableau 35 Liste des antibiotiques utilisés sur le terrain 133 Tableau 36 Liste des antibiotiques à tester pour les bactéries non exigeantes 136 Tableau 37 Liste des antibiotiques à tester pour les bactéries exigeantes 136 Tableau 38 Liste des solvants pour la préparation des solutions antibiotiques 144 Tableau 39 Molécules utilisées en médecine humaine et vétérinaire 145 Tableau 40 Prélèvements effectués et principaux germes recherchés 148 Tableau 41 Prélèvements à réaliser et pathologies suspectées 151 Tableau 42 Prélèvements à réaliser et pathologies suspectées 152 Tableau 43 Nature du prélèvement en fonction de la maladie suspectée

9 Liste des Figures Figure 1 Production de β- lactamase chez Haemophilus spp. par technique microbiologique (test du trêfle) Figure 2 CMI de la pénicilline G d une souche de S.pneumoniae (technique du E-test) 48 Figure 3 Souche de Klebsiella pneumoniae productrice de β- lactamase à spectre élargi 51 Figure 4 Souche de Pseudomonas aeruginosa productrice de β- lactamase à spectre élargi 53 Figure 5 Klebsiella pneumoniae productrice de BLSE 54 Figure 6 Test à la cloxacilline sur une souche de Klebsiella pneumoniae 55 Figure 7 Souche de P.stuartii codant pour une bla VEB-1 56 Figure 8 Algorithme décisionnel pour l étude de la sensibilité des staphylocoques aux glycopeptides 60 Figure 9 Figure 10 Figure 11 Schéma expliquant la disposition des disques d antibiotiques et les distances entre chacun d eux pour la détection des céphalosporinases 68 Recherche des céphalosporinases par la méthode des 2 disques de céfoxitine et céfotétan avec inhibiteur 69 Comparaison entre le test de confirmation pour les BLSE et le test à l acide boronique pour la détection des AmpC 71 Figure 12 Recherche des β- lactamases (BLSE et AmpC) 72 Figure 13 Recherche de céphalosporinases à partir de l extrait enzymatique 73 Figure 14 P.aeruginosa producteur de carbapénèmase de type B 76 Figure 15 Test de Hodge modifié 77 Figure 16 Schéma proposé par Rosco pour la détection des carbapénèmases KPC, métallo-βlactamases et oxacillinases 77 Figure 17 Protocole de surveillance des tests de contrôle de qualité 113 Figure 18 Utilisation du logiciel WHONET dans le monde en mai

10 Liste des Tables de Lecture Table 1 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Entérobactéries 159 Table 2 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour P.aeruginosa 160 Table 3 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Acinetobacter spp. 161 Table 4 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Staphylococcus spp. 162 Table 5 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Enterococcus spp. 164 Table 6 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Vibrio cholerae 165 Table 7 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Haemophilus spp. 166 Table 8 Table 9 Table 10 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour les Streptococcus spp. Groupe viridans (autres que S.pneumoniae) 167 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Streptococcus spp. Groupe β- hémolytiques 168 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Streptococcus pneumoniae 169 Table 11 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Neisseria gonorrhoeae 170 Table 12 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Neisseria meningitidis 171 Table 13 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition pour les souches de référence utilisées pour le contrôle de qualité 172 Table 14 Valeurs critiques des CMI pour Yersinia pestis 174 Table 15 Valeurs critiques des CMI pour Campylobacter spp. 175 Table 16 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition pour Helicobacter pylori. 176 Table 17 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition pour Anaérobies strictes. 176 Table 18 Valeurs critiques des CMI pour Brucella spp. 177 Table 19 Valeurs critiques des CMI pour Corynebacterium spp. 177 Table 20 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition pour Pasteurella spp. 178 Table 21 Table 22 Table 23 Table 24 Table 25 Table 26 Table 27 Table 28 Table 29 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Entérobactéries (Médecine vétérinaire) 181 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour P.aeruginosa (Médecine vétérinaire) 183 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Staphylococcus spp. (Médecine vétérinaire) 184 Valeurs critiques de la céfoxitine pour la detéction de souches de Staphylococcus spp. et aureus méticillino résistantes. (Médecine vétérinaire) 185 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Enterococcus spp. (Médecine vétérinaire) 186 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Streptococcus spp. Groupe viridans. (Médecine vétérinaire) 187 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Haemophilus spp. (Médecine vétérinaire) 188 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Pasteurellaceae (Médecine vétérinaire) 189 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Campylobacter jejuni et Campylobacter coli (Médecine vétérinaire) 190 Table 30 Valeurs critiques des CMI pour Listeria spp. (Médecine vétérinaire) 190 Table 31 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition pour les souches de référence utilisées pour le contrôle de qualité (En médecine vétérinaire)

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12 Préambule L un des rôles dévolu à la pratique bactériologique quotidienne est de guider le clinicien ou le vétérinaire dans le choix d un antibiotique pour traiter une infection bactérienne. Ce choix est rendu possible grâce aux données fournies par le test de sensibilité aux antibiotiques selon les techniques de diffusion en milieu gélosé ou par des automates. Ces données peuvent également être exploitées pour la surveillance des résistances bactériennes aux antibiotiques. Après avoir participé à l OMS (Genève) en 1994 à l élaboration des règles de standardisation de l antibiogramme : «Lignes directrices pour le contrôle de la sensibilité aux antimicrobiens à l intention des laboratoires de niveau intermédiaire situés dans des pays aux ressources limitées», nous avons appliqué les techniques préconisées par le CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute) recommandées par l OMS et agréees par de nombreux pays. La standardisation de la technique permet d échanger des données grâce à un logiciel de saisie et d exploitation fourni par l OMS : le WHONET, actuellement version 5.6. En dehors du CLSI, il existe actuellement un Comité Européen dénommé EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) qui diffuse via internet des directives concernant les tests de sensibilité aux antibiotiques. Depuis 2010, les normes CLSI et EUCAST ont évolué en tenant compte de la pharmacodynamie (PD) et de la pharmacocinétique (PK) des antibiotiques prescrits. En effet, les antibiotiques de classes différentes se caractérisent par des propriétés pharmacocinétiques et pharmacodynamiques distinctes qui doivent être prises en considération pour une optimisation du traitement et une interprétation correcte des réponses in vitro. Le CLSI et l EUCAST sont en concertation pour tenter d unifier les techniques, les milieux, les charges des disques et les valeurs critiques. Dans les années à venir, il y aura uniformisation des règles applicables par tous les pays. Il existe en Algérie un réseau de laboratoires chargé de la surveillance de la résistance des bactéries aux antibiotiques, il est dénommé : Algerian Antimicrobial Resistance Network (AARN). Son adresse Web est :

13 En ce qui concerne les vétérinaires, nous avons remarqué que la majorité des données concernaient les salmonelles isolées chez le poulet. Il a par conséquent été demandé aux vétérinaires de rédiger des fiches techniques de prélèvements sur différents animaux. Ces fiches techniques d information sont jointes en annexe et seront destinées à tous les vétérinaires. Pour être efficaces les microbiologistes devraient saisir les données quotidiennement afin de fournir chaque mois un état des lieux aux cliniciens et vétérinaires. Dans ce fascicule seront traités les tests de sensibilité aux antibiotiques selon la méthode classique et selon la technique automatisée en tenant compte des nouveaux concepts d interprétation des antibiogrammes (CLSI 2011). La partie vétérinaire sera traitée à part. Pr K. RAHAL 12

14 MEDECINE HUMAINE 13

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16 LISTE DES ANTIBIOTIQUES A TESTER Dr H. Tali-Maamar 15

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18 Tableau 1: Liste des antibiotiques à tester pour les bactéries non exigeantes Entérobactéries Pseudomonas spp. Acinetobacter spp. Staphylococcus spp. Enterococcus spp. Vibrio cholerae Ampicilline* (10µg) Ticarcilline (75µg) Ticarcilline (75µg) Pénicilline (10UI) Ampicilline* (10µg) Ampicilline* (10µg) Amoxicilline + Acide clavulanique (20/10µg) Ticarcilline + acide clavulanique (75/10µg) Ticarcilline + acide clavulanique (75/10µg) Oxacilline (1µg) Gentamicine (120µg) Amoxicilline + acide clavulanique (20/10µg) Céfalotine**** (30µg) Pipéracilline (100µg) Pipéracilline (100µg) Céfoxitine (30µg) Streptomycine (300µg) Céfotaxime ** (30µg) Céfazoline (30µg) Céftazidime (30µg) Céftazidime (30µg) Amikacine (30µg) Erythromycine (15µg) Tétracycline*** (30µg) Céfoxitine (30µg) Aztréonam (30µg) Imipénème (10µg) Gentamicine (10µg) Furanes (300µg) Furanes (300µg) Céfotaxime** (30µg) Imipénème (10µg) Amikacine (30µg) Kanamycine (30µg) Tétracycline *** (30µg) Colistine (10µg) Imipénème (10µg)/ Méropénème Amikacine (30µg) Gentamicine (10µg) Erythromycine (15µg) Vancomycine (30µg) Triméthoprime + sulfaméthoxazole (10µg) (1.25/23.75µg) Ertapénème (10µg) Gentamicine (10µg) Tobramycine (10µg) Clindamycine (2µg) Teicoplanine (30µg) Acide nalidixique (30µg) Amikacine (30µg) Tobramycine (10µg) Nétilmicine (CMI seulement) Pristinamycine (15µg) Lévofloxacine (5µg) Composé vibriostatique O/129***** Gentamicine (10µg) Nétilmicine (30µg) Ciprofloxacine (5µg) Ofloxacine (5µg) Rifampicine (5µg) Chloramphénicol (30µg) Acide nalidixique (30µg) Ciprofloxacine (5µg) Lévofloxacine (5µg) Chloramphénicol (30µg) Fosfomycine (200µg) Ciprofloxacine (5µg) Lévofloxacine (5µg) Doxycycline*** (30µg) Vancomycine (CMI seulement) Quinupristine -dalfopristine (15µg) Colistine (10µg) ***** Fosfomycine (50µg) +50µg G6P Triméthoprime + sulfaméthoxazole (1.25/23.75µg) Chloramphénicol (30µg) Rifampicine (30µg) Colistine (CMI seulement) Rifampicine (5µg) Teicoplanine (30µg) Chloramphénicol (30µg) Furanes (300µg) Colistine (10µg) Rifampicine (30µg) Triméthoprime + sulfaméthoxazole (1.25/23.75µg) Triméthoprime + sulfaméthoxazole Tétracycline*** (30µg) (1.25/23.75µg) Fosfomycine (200µg) Acide fusidique (10µg) Fosfomycine (50µg) Composé vibriostatique O/129***** * : réponse d interprétation valable pour l amoxicilline ** : réponse d interprétation valable pour céftriaxone, céfixime, céfoperazone, céfdinir et céfpodoxime *** : réponse d interprétation valable pour tétracycline et doxycycline **** : réponse d interprétation valable pour céfalexine, céfaclor ***** : antibiotique testé à visée diagnostic. 17

19 Tableau 2 : Liste des antibiotiques à tester pour les bactéries exigeantes spp. N.gonorrhoeae N.meningitidis N.meningitidis S.pneumoniae Streptococcus spp. s Streptococcus β- Haemophilus spp.. Groupe G viridans s hémolytique Ampicilline* (10µg) Pénicilline (10UI) Pénicilline (CMI) Pénicilline (CMI) Pénicilline (CMI) Pénicilline (10UI) Ampicilline (2µg) Céftriaxone** (30µg) Ampicilline* (CMI) Oxacilline**** (1 µg) Ampicilline (CMI) Ampicilline* (10UI) Amoxicilline + Ac clavulanique (20/10µg) Tétracycline*** (30µg) Spiramycine (100µg) Amoxicilline pour autre que LCR (CMI) Céfotaxime (30µg) Erythromycine (15µg) Céfalotine (30µg) Spectinomycine (100µg) Rifampicine (5µg) Céfotaxime (CMI) Pristinamycine (15µg) Clindamycine (2µg) Céfotaxime**(30µg) Ciprofloxacine (5µg) Chloramphénicol (30µg) Imipénème (CMI) Tétracycline (30µg) Pristinamycine (15µg) Tétracycline (30µg) Acide nalidixique (30µg) Erythromycine (15µg) Gentamicine (CMI pour infections graves) Tétracycline (30µg) Azithromycine (15µg) Clindamycine (2µg) Vancomycine (30µg) Lévofloxacine (5µg) Acide nalidixique (30µg) Pristinamycine (15µg) Chloramphénicol (30µg) Vancomycine (30µg) Ofloxacine (5µg) Chloramphénicol (30µg) Rifampicine (30µg) Chloramphénicol (30µg) Chloramphénicol (30µg) Rifampicine (5µg) Erythromycine (15µg) Gentamicine (500µg) Triméthoprime + sulfaméthoxazole (1.25/23.75µg) Triméthoprime + sulfaméthoxazole(1.25/23.75µg) Lévofloxacine (5µg) Rifampicine (30µg) Vancomycine (30µg) Clindamycine (2µg) Lévofloxacine (5µg) Tétracycline (30µg) Fosfomycine (50µg) * : réponse d interprétation valable pour l amoxicilline ** : réponse d interprétation valable pour céftriaxone, céfixime, céfopérazone, céfdinir et céfpodoxime *** : réponse d interprétation valable pour tétracycline et doxycycline **** : réponse d interprétation pour la pénicilline, (voir chapitre «recherches complémentaires») 18

20 RESISTANCES NATURELLES AUX ANTIBIOTIQUES DES PRINCIPALES ESPECES BACTERIENNES 1- BACILLES A GRAM NEGATIF NON EXIGEANTS : Pénicilline G, oxacilline, macrolides (érythromycine), lincosamides (lincomycine), streptogramines (pristinamycine), acide fusidique, glycopeptides (vancomycine) Entérobactéries : Tableau 3 : Résistances naturelles chez les entérobactéries Bactérie AMP/AMX AMC TIC/PIP C1G FOX GEN TCY COL NIT Klebsiella spp. R R C.koseri R R C.freundii R R R R E.cloacae R R R R E.aerogenes R R R R S.marcescens R R R R P.mirabilis R R R P.vulgaris R R R R R M.morganii R R R R R R P.stuartii R R R R R R R Y.enterocolitica R R R R R R : résistance naturelle 19

21 1.2- Autres Bacilles à Gram négatif non exigeants : Pseudomonas aeruginosa : aminopénicillines, céphalosporines 1 ère et 2 ème génération, céfotaxime, céftriaxone, kanamycine, tétracyclines, chloramphénicol, triméthoprime, quinolones. Acinetobacter baumannii, Acinetobacter calcoaceticus : aminopénicillines, céphalosporines 1 ère et 2 ème génération, fosfomycine, triméthoprime, furanes. Autres BGN non fermentaires : aminopénicillines, céphalosporines 1ère et 2ème générations et ertapénème. Tableau 4 : Résistances naturelles chez les bacilles à Gram négatif non fermentaires Bactéries TIC TCC PIP CTX CAZ IPM QUI CHL TMP FOS COL S.maltophilia R R R R R R B.cepacia R R R R R R R R A.denitrificans R C.meningosepticum R R R R R R R R O.anthropi R R R R R R : résistance naturelle Aeromonas Aminopénicillines (sauf Aeromonas trota), céphalosporines de 1 ère et de 2 ème génération (sauf Aeromonas veronii), ertapénème. 2- BACILLES A GRAM NEGATIF EXIGEANTS Haemophilus : macrolides (cycle à 16 atomes : spiramycine, josamycine, midécamycine), lincosamides. 3- COQUES A GRAM POSITIF Mécillinam, aztréonam, quinolones, colistine. Staphylococcus saprophyticus : fosfomycine, novobiocine. Staphylococcus cohnii et Staphylococcus xylosus : novobiocine, lincomycine. Micrococcus : furanes. Streptococcus (dont Streptococcus pneumoniae) : aminoglycosides (bas niveau), péfloxacine. Enterococcus : oxacilline, céphalosporines, ertapénème, aminoglycosides (bas niveau), péfloxacine, fosfomycine (bas niveau), sulfamides. Enterococcus faecalis : lincosamides, streptogramines A. Enterococcus faecium : Imipénème. 20

22 Enterococcus gallinarum - Enterococcus casseliflavus / flavescens : vancomycine. Pediococcus Leuconostoc : glycopeptides. 4- BACILLES A GRAM POSITIF Mécillinam, aztréonam, colistine, quinolones. Listeria monocytogenes : oxacilline, céphalosporines, lincosamides, fosfomycine, fluoroquinolones (bas niveau). Bacillus cereus : pénicilline G, amino et carboxy- pénicillines, céphalosporines. 5- COQUES A GRAM NEGATIF Neisseria : triméthoprime, glycopeptides; Neisseria meningitidis - Neisseria gonorrhoeae : lincosamides, colistine, Branhamella catarrhalis : lincosamides, triméthoprime. Moraxella : triméthoprime. 6- BACTERIES ANAEROBIES STRICTES Aminosides, aztréonam (sauf Fusobacterium), triméthoprime, quinolones. Bacteroides du groupe fragilis : aminopénicillines, céphalosporines 1 ère génération, colistine, polymyxine B, glycopeptides, fosfomycine. Prevotella : glycopeptides, fosfomycine. Porphyromonas : fosfomycine, colistine, polymyxine B. Clostridium difficile : céphalosporines, clindamycine. Clostridium innocuum : vancomycine (bas niveau). Actinomyces Propionibacterium : céphalosporines 1 ère génération, nitro-imidazolés. 21

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24 TECHNIQUES Pr A. Benslimani 23

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26 1. ANTIBIOGRAMME PAR DIFFUSION DES DISQUES 1.1- Milieu pour antibiogramme : Il doit être coulé en boîtes de Petri sur une épaisseur de 4 mm Les géloses doivent être séchées avant l emploi 1.2- Préparation de l inoculum : A partir d une culture pure de 18 à 24 h sur milieu d isolement approprié, racler à l aide d une anse de platine quelques colonies bien isolées et parfaitement identiques. Dans le cas de Streptococcus spp. et d Haemophilus spp. utiliser un écouvillon pour prélever plus facilement les colonies bactériennes. Bien décharger l anse ou l écouvillon dans 5 à 10 ml d eau physiologique stérile à 0,9%. Dans le cas de Neisseria gonorrhoeae, décharger l anse dans 1 à 2 ml de tampon phosphate stérile à ph 7,2. Bien homogénéiser la suspension bactérienne, son opacité doit être équivalente à 0,5 MF ou à une D.O. de 0,08 à 0,10 lue à 625 nm. L utilisation d un densitomètre est fortement souhaitable. La suspension bactérienne à 0,5 MF doit être diluée au 1/10 ème dans le cas où l on teste des molécules à charge SFM (c'est-à-dire des antibiotiques pour lesquels il n existe pas encore de critères d interprétation dans la technique CLSI) Ensemencement : Tremper un écouvillon stérile dans l inoculum. L essorer en le pressant fermement (et en le tournant) contre la paroi interne du tube, afin de décharger au maximum. Frotter l écouvillon sur la totalité de la surface gélosée, sèche, de haut en bas, en stries serrées. Répéter l opération 2 fois, en tournant la boîte de 60 à chaque fois, sans oublier de faire pivoter l écouvillon sur lui-même. Finir l ensemencement en passant l écouvillon sur la périphérie de la gélose. Dans le cas où l on ensemence plusieurs boîtes de Petri, il faut recharger l écouvillon à chaque fois Application des disques d antibiotiques : Il est préférable de ne pas mettre plus de 6 disques d antibiotique sur une boîte de 90 mm. Pour les bactéries exigeantes (Streptococcus spp., Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Haemophilus spp..), ne pas mettre plus de 4 disques par boîte de 90 mm. Presser chaque disque d antibiotique à l aide de pinces bactériologiques stériles et ne pas déplacer les disques après application. La liste des antibiotiques à tester selon la bactérie isolée, figure dans les tableaux n 1 et Conditions d incubation : Respecter la température, l atmosphère et la durée d incubation recommandées pour chaque bactérie (voir tableau n 5). 25

27 1.6- Lecture : Mesurer avec précision les diamètres des zones d inhibition à l aide d un pied à coulisse. Pour les bactéries testées sur Mueller-Hinton simple, les mesures seront prises en procédant par transparence à travers le fond de la boîte de Petri fermée. Pour les bactéries testées sur Mueller-Hinton au sang, les mesures de diamètres de zones d inhibition seront prises, boîte de Petri ouverte et bien éclairée. Comparer les résultats obtenus, aux valeurs critiques figurant dans les tables de lecture correspondantes. Classer la bactérie dans l une des catégories S, R ou I. 26

28 Tableau 5 : Technique d antibiogramme (diffusion de disques antibiotiques). Microorganismes Milieu pour antibiogramme Inoculum microbien Conditions d incubation Entérobactéries Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter spp. Staphylococcus spp. Enterococcus spp. Vibrio cholerae - Vibrio spp. Aeromonas spp.- Plesiomonas spp. Autres bactéries non exigeantes Gélose Mueller-Hinton 0,5 MF en eau physiologique ème (diluer au 1/10 è m pour les charges CA-SFM) ) 18 heures (à prolonger pour OXA et VAN/TEC) 35 C Atmosphère ordinaire Streptococcus spp. 0,5 MF en eau physiologique heures 35 C 5%C02 Pasteurella spp. Campylobacter jejuni/coli (selon SFM) Gélose Mueller-Hinton + 5% sang de mouton heures 35 C Atmosphère ordinaire 0,5 MF en eau physiologique à diluer au 1/10 ème 18 à 24 heures 35 C-37 C Microaérophilie Neisseria gonorrhoeae Gélose GC + 1% supplément* 0,5 MF en tampon Phosphate ph 7, heures 35 C 5% C02 Neisseria meningitidis Gélose Mueller-Hinton + 5% sang de mouton 0,5 MF en tampon PBS ou eau physiologique heures 35 C 5% C02 Atmosphère humidifiée Haemophilus spp. Gélose Haemophilus Test Medium* 0,5 MF en eau physiologique ème (diluer ( au a 1/10 1 è m pour les charges CA-SFM) ) heures 35 C 5% C02 * : voir composition en annexe 27

29 1.7- Contrôle de qualité : Pour chaque espèce bactérienne testée, un contrôle de qualité est réalisé dans les mêmes conditions de test et d incubation (voir tableau n 6). Tableau 6: Souches de contrôle de qualité de l antibiogramme Microorganismes Souche de référence ATCC Entérobactéries Escherichia coli ATCC Staphylococcus spp. Staphylococcus aureus ATCC Staphylococcus aureus ATCC Staphylococcus aureus ATCC Pseudomonas spp. Acinetobacter spp. Pseudomonas aeruginosa ATCC Enterococcus spp. Staphylococcus aureus ATCC Enterococcus faecalis ATCC Vibrio cholerae et Vibrio spp. Escherichia coli ATCC Haemophilus spp. Haemophilus influenzae ATCC Streptococcus spp. Groupe viridans Pasteurella spp. Streptococcus spp. Groupe β-hémolytique Streptococcus pneumoniae ATCC Neisseria gonorrhoeae Neisseria gonorrhoeae ATCC Neisseria meningitidis Streptococcus pneumoniae ATCC Campylobacter spp. Staphylococcus aureus ATCC C 16-18h atmosphère ordinaire 2. DETERMINATION DE LA CMI : Dans le cas de Neisseria meningitidis, Streptococcus spp. Groupe viridans, Streptococcus pneumoniae et Listeria monocytogenes, la technique de l antibiogramme n est pas validée pour certaines molécules antibiotiques. Pour ces molécules, la sensibilité de ces germes est appréciée uniquement par la détermination de la CMI, soit par la technique de référence, soit par une technique autre, recommandée par des travaux publiés. Ces techniques sont résumées dans le tableau n 7. Certaines bactéries à croissance difficile et/ou rarement incriminées dans les infections ont fait l objet d une standardisation de la technique d étude de la sensibilité aux antibiotiques selon les recommandations du CLSI (M100 - S21 et M45-A). La technique de diffusion des disques n est pas validée pour ces germes. La technique recommandée est la détermination de la CMI par dilution en milieu Mueller-Hinton liquide ajusté en cations. Ce milieu est supplémenté de 2,5 à 5% v/v de sang de cheval lysé et parfois de facteurs de croissance selon les espèces bactériennes testées. La technique de CMI pour les bactéries particulières est résumée dans le tableau n

30 Tableau 7 : Techniques de détermination de la CMI pour certaines bactéries selon les recommandations du CLSI* Microorganismes Antibiotiques Technique T recommandée Milieu M Inoculum Conditions d incubation Neisseria meningitidis Streptococcus spp. Groupe viridans Pénicilline G Amoxicilline Pénicilline G Ampicilline Dilution en gélose Dilution en milieu liquide Dilution en gélose MHBAC + 5% sang de mouton frais défibriné MHLAC+ 2-5% sang de cheval hémolysé MH + 5% sang de mouton frais 1 MF Eau physiologique ou PBS Spots de 1µl 1 MF Eau physiologique ou PBS 0,5 MF Eau physiologique H 35 C ± 2 C Sous 5%C02 + humidité 35 C± 2 C H 5% C02 Streptococcus pneumoniae Pénicilline G Amoxicilline (sauf LCR) Céfotaxime Imipénème Dilution en milieu liquide MHLAC %(V/V) sang de cheval hémolysé et défibriné 0,5 MF Eau physiologique H 35 C ± 2 C Air ambiant Listeria monocytogenes Pénicilline G Ampicilline Dilution en milieu liquide MHLAC % sang de cheval hémolysé 0,5 MF Eau physiologique 35 C H Bordetella pertussis Erythromycine Josamycine Azithromycine clarithromycine Dilution en gélose Gélose MH + 10% sang de cheval frais 0,5 MF en MHLAC dilué au 1/10 ème Spots de10 4 UFC/ml (1 à 2 µl) H 35 C Campylobacter jejuni/coli Erythromycine Ciprofloxacine Tetracycline Doxycycline Dilution en milieu liquide MHLAC+ 2-5% sang de cheval hémolysé 0,5 MF Eau physiologique C 48h Ou 42 C 24h microaérophilie MHLAC : Mueller-Hinton liquide ajusté en cations MHBAC : Mueller-Hinton base ajusté en cations * consulter le chapitre : tests complémentaires pour S.aureus, Enterococcus spp. et Acinetobacter spp Souches de référence S.pneumoniae ATCC S.pneumoniae ATCC S.pneumoniae ATCC S.pneumoniae ATCC L.monocytogenes ATCC B.pertussis ATCC 9797 S.aureus ATCC Campylobacter jejuni ATCC Autre technique validée E-Test (inoculum à 0,5 MF) Dilution en milieu liquide MHLAC % V/V sang de cheval E-Test E-Test ou dilution en gélose E-Test excepté pour Erythromycine E-Test (concordance moyenne de 61,9%) 29

31 Tableau 8: Techniques de détermination de la CMI des antibiotiques pour les bactéries à croissance difficile ou rarement incriminées (CLSI M100 IS21 et M45) Microorganismes Milieux Conditions d incubation Souches de référence Autres techniques validées (réf bibliographique) Abiotrophia spp. Granulicatella spp. MHLAC + 2.5I5% sang de cheval lysé % PyridoxalIHCL 20I24H 35 C atm ordinaire S.pneumoniae ATCC 4V61V Aucune Bacillus spp. Autre que B.anthracis MHLAC 16I20H 35 C atm ordinaire S.aureus ATCC 2V213 CMI par dilution en gélose MH (CAISFM) Corynebacterium spp. Erisypelothrix rhusiopathiae MHLAC + 2.5I5% de sang de cheval lysé MHLAC + sang de cheval lysé (2.5I5% v/v) 24I48H 35 C atm ordinaire 20I24 H 35 C atm ordinaire S.pneumoniae ATCC 4V61V E.coli ATCC 25V22 pour Gentamicine S.pneumoniae ATCC 4V61V I Antibiogramme(CAISFM) I EITest Aucune HACCEK* Lactobacillus spp. Leuconostoc spp. MHLAC + sang de cheval lysé (2.5I5% v/v) MHLAC + sang de cheval lysé (2.5I5% v/v) MHLAC + sang de cheval lysé (2.5I5% v/v) 24I48H 35 C Sous C02 20I24 H 35 C atm ordinaire 20I24 H 35 C atm ordinaire S.pneumoniae ATCC 4V61V S.pneumoniae ATCC 4V61V E.coli ATCC 25V22 pour Gentamicine S.pneumoniae ATCC 4V61V E.coli ATCC 25V22 pour Gentamicine IH : antibiogrammei EItest IA : EItest IC : antibiogrammei EItest ICapnocytophaga : EITest IE : antibiogrammei EItest IK : antibiogrammei EItest EITest sauf aminosides (5) I Antibiogramme IEITest (sauf aminosides) (5) Moraxella catarrhalis MHLAC 20I24 H 35 C atm ordinaire S.aureus ATCC2V213 Antibiogramme (5) Pediococcus spp. Brucella spp. Yersinia pestis MHLAC + sang de cheval lysé (2.5I5% v/v) MHLAC + sang de cheval lysé (2.5I 5% v/v) MHLAC 20I24 H 35 C atm ordinaire 48 H 35 C±2 Sous C02 24 I 48 H 35 ±2 S.pneumoniae ATCC 4V61V E.coli ATCC 25V22 pour Gentamicine Brucella melitensis ATCC E.coli ATCC 25V22 I CMI par dilution en gélose IEITest (sauf aminosides) Iantibiogramme (5) I EI Test (milieu MH + Sang de cheval, inoculum à 0,5MF) I CMI par dilution en gélose Aucune Bacillus anthracis MHLAC 16I 20 H 35 ±2 E.coli ATCC 25V22 S.aureus ATCC 2V213 Aucune Lignes grisées : manipulations en laboratoire de niveau de sécurité 2 ou 3 HACCEK* : Haemophilus, Actinobacillus, Capnocytophaga, Cardiobacterium, Eikenella et Kingella 30

32 2.1- Technique de dilution en gélose : a- Milieu de culture : - Milieu Mueller-Hinton en gélose - Il est liquéfié par ébullition puis maintenu à la température de surfusion (45 C) jusqu au moment de l emploi. - Il peut être supplémenté en sang frais ou autres en fonction des microorganismes testés : voir tableaux 7 et 8. b- Préparation des boîtes de dilutions d antibiotique (voir tableau n 9) : Peser 51,20 mg de poudre titrée d antibiotique. Diluer dans le volume de solvant approprié pour obtenir une concentration stock de 5120 µg/ml (solution-mère). Procéder aux dilutions semi-logarithmiques de raison 2 (de demi en demi), dans le solvant aproprié, jusqu à la concentration finale de 1,25 µg/ml. Répartir 2 ml de chaque dilution d antibiotique, dans la boîte correspondante en procédant de la plus faible concentration à la concentration la plus élevée. Ne pas changer de pipette. Compléter chaque boîte avec 18 ml de milieu Mueller-Hinton liquéfié et homogénéiser délicatement, sans faire de bulle, le contenu des boîtes par des mouvements circulaires. La dilution obtenue (1/10 ème ) dans chaque boîte aboutit à une concentration finale allant de 512 µg/ml à 0,125 µg/ml. La gamme de dilution peut être etendue selon les valeurs souhaitées. Préparer une boîte témoin sans antibiotique en remplaçant le volume d antibiotique par le même volume d eau physiologique stérile. Après solidification, sécher les boîtes, couvercle en place, pendant 30 mn. c- Préparation de l inoculum bactérien : Préparer un inoculum standard à une turbidité de 0,5 MF, ce qui correspond à CFU/ml en moyenne. Utiliser l eau physiologique (eau ø) à 0,9% pour la préparation de la suspension directe à partir d une culture jeune de la bactérie à tester. Déposer sous forme de spots à la surface de la gélose, 10 4 CFU/ml par spots de 5 à 8 mm. Si on utilise un applicateur de 2µl par spot, diluer l inoculum au 1/10 ème en eau physiologique. Si on utilise un applicateur de 0,1 à 0,2µl par spot, ne pas diluer l inoculum de départ (0,5 MF). d- Dépôt des spots bactériens : Déposer les spots dans les 15 mn suivant la préparation de l inoculum. Marquer la boîte de dilution d antibiotique pour localiser et identifier chaque spot. Appliquer chaque spot sur la gélose, en utilisant un appareil de Steers, une anse calibrée ou une pipette automatique à cône stérile. 31

33 Commencer par la boîte témoin, puis déposer les spots sur les différentes boîtes en allant de la plus faible concentration à la concentration la plus élevée. Terminer en appliquant les spots sur une 2 ème boîte témoin. Etaler une goutte de chaque souche testée, sur une gélose non sélective et incuber une nuit (détection des cultures mixtes, obtention d une culture jeune). e- Incubation : Laisser les boîtes à température ambiante, couvercle vers le haut, jusqu à absorption de l humidité (séchage des spots, pas plus de 30 mn). Renverser les boîtes et incuber à 35 C±2 pendant heures. Ne pas incuber en atmosphère à forte concentration de C02 si cela n est pas recommandé (le C02 perturbe le ph du milieu). Incuber Neisseria meningitidis et Streptococcus spp. dans une atmosphère contenant 5% de C02. f- Lecture des CMI : Placer les boîtes sur une surface sombre, non réflective Noter la CMI (la plus faible concentration d antibiotique inhibant toute croissance bactérienne visible). Ne pas prendre en considération 2 colonies ou un léger film Si on note plus de 2 colonies persistantes ou si l on constate une réapparition de la culture au-delà de la CMI, vérifier la pureté de l inoculum et refaire le test. Comparer les résultats obtenus, aux valeurs critiques figurant dans les tables de lecture correspondantes. Classer la bactérie dans l une des catégories S, R ou I. 32

34 Tableau 9 : Schéma pour la préparation des dilutions d antibiotique Etape Concentration (µg/ml) ATB (ml) Diluant (ml) Concentration intermédiaire Concentration finale dans la gélose (µg/ml) Solution mère ,5 1, ,5 0,25 0, Technique de dilution en milieu liquide : a- Milieu de culture : C est le Mueller-Hinton liquide, recommandé pour tester les microorganismes couramment isolés, à croissance rapide, aérobies ou aérobie-anaérobies facultatifs. Le milieu MH liquide est ajusté en cations (MHLAC) Le MHLAC est supplémenté avec 2.5 à 5% (v/v) de sang hémolysé de cheval (voir mode de préparation en annexe) pour la croissance des bactéries difficiles ou d isolement peu courant. b- Gamme des dilutions d antibiotique : Dissoudre 10,24 mg de poudre titrée d antibiotique dans le volume adéquat du solvant correspondant, pour obtenir une solution mère à 1024 µg/ml. Répartir dans des tubes stériles le milieu MHLAC supplémenté ou non, à raison de 0,25 ml par tube ou bien à raison de 25 µl par cupule en microplaque à fond rond. Réaliser à partir de la solution mère, les dilutions semi-logarithmiques de raison 2 ; on obtient des concentrations intermédiaires allant de 512 µg/ml à 0,063 µg/ml (voir tableau n 10). c- Préparation de l inoculum bactérien : Préparer a partir d une culture pure de 48 heures, une suspension de la souche à étudier, dans 5 à 10 ml d eau physiologique stérile (ou de bouillon MHLAC), d une densité équivalente à 0,5 MF (10 8 CFU/ml) Diluer la suspension d opacité 0,5 MF au 1/10 ème pour distribuer un inoculum de CFU/ml de germe dans chaque tube ou cupule. 33

35 Vérifier par ailleurs, la pureté de chaque souche en en effectuant l isolement sur gélose non sélective. d- Distribution de l inoculum bactérien : Elle doit se faire dans les 15 mn suivant la préparation de l inoculum Inoculer les tubes d antibiotiques (ou les cupules de la microplaque) avec 50 µl de suspension bactérienne par tube (ou 5 µl par cupule). Pour chaque série, réaliser un témoin sans antibiotique (tube ou cupule). e- Distribution du milieu MHLAC : Répartir dans les tubes 0.70ml de MHLAC (ou 70µl / cupule) ; la concentration d antibiotique obtenue va ainsi de 128 µg/ml à µg/ml. f- Incubation : Recouvrir la plaque d un couvercle en plastique (ou boucher les tubes) Les conditions d incubation seront appliquées en fonction des germes testés (voir tableaux n 7 et 8). g- Lecture : La CMI de chaque antibiotique correspond au 1 er tube ou à la 1 ère cupule CLAIRE (pas de culture par rapport au témoin sans antibiotique). Comparer la CMI lue, aux CMI critiques correspondantes à chaque antibiotique testé (tables de lecture). Classer les bactéries dans la catégorie R, I ou S selon le résultat. 34

36 Tableau 10: Schéma du mode opératoire (CMI par technique de dilution en milieu liquide) N tube ou cupule Volume de la solution d antibiotique à rajouter Concentration intermédiaire (μg /ml) Volume MH suplémenté en sang ou non Inoculum Concentration finale/ tube ou cupule (vol final:1ml/tube ou 100µl /cupule) 1 0,25ml (ou 25 µl /cupule) de la solution à 1024μg/ml 512 0,70 ml (ou 70µl) 50µl /tube (ou 5µl /cupule) 128 μg/ml 2 0,25ml (ou 25 µl /cupule) de la solution à 512μg/ml 256 0,70 ml (ou 70µl) 50µl /tube (ou 5µl /cupule) 64 μg/ml 3 0,25ml (ou 25 µl /cupule) de la solution à 256μg/ml 128 0,70 ml (ou 70µl) 50µl /tube (ou 5µl /cupule) 32 μg/ml 4 0,25ml (ou 25 µl /cupule) de la solution à 128μg/ml 64 0,70 ml (ou 70µl) 50µl /tube (ou 5µl /cupule) 16 μg/ml 5 0,25ml (ou 25 µl /cupule) de la solution à 64μg/ml 32 0,70 ml (ou 70µl) 50µl /tube (ou 5µl /cupule) 8 μg/ml 6 0,25ml (ou 25 µl /cupule) de la solution à 32μg/ml 16 0,70 ml (ou 70µl) 50µl /tube (ou 5µl /cupule) 4 μg/ml 7 0,25ml (ou 25 µl /cupule) de la solution à 16μg/ml 8 0,70 ml (ou 70µl) 50µl /tube (ou 5µl /cupule) 2 μg/ml 8 0,25ml (ou 25 µl /cupule) de la solution à 8μg/ml 4 0,70 ml (ou 70µl) 50µl /tube (ou 5µl /cupule) 1 μg/ml 9 0,25ml (ou 25µl /cupule) de la solution à 4μg/ml 10 0,25ml (ou 25µl /cupule) de la solution à 2μg/ml 2 0,70 ml (ou 70µl) 1 0,70 ml (ou 70µl) 50µl /tube (ou 5µl /cupule) 50µl /tube (ou 5µl /cupule) 0,5 μg/ml 0,25 μg/ml 11 0,25ml (ou 25 µl /cupule) de la solution à 1μg/ml 0,5 0,70 ml (ou 70µl) 50µl /tube (ou 5µl /cupule) 0,125 μg/ml 12 0,25ml (ou 25 µl /cupule) de la solution à 0.5μg/ml 0,25 0,70 ml (ou 70µl) 50µl /tube (ou 5µl /cupule) 0,063 μg/ml 13 0,25ml (ou 25 µl /cupule) de la solution à 0,25μg/ml 0,125 0,70 ml (ou 70µl) 50µl /tube (ou 5µl /cupule) 0,032 μg/ml 14 0,25ml (ou 25 µl /cupule) de la solution à 0,125μg/ml 0,063 0,70 ml (ou 70µl) 50µl /tube (ou 5µl /cupule) 0,016 μg/ml T 0,70 ml (ou 70µl) 50µl /tube (ou 5µl /cupule) 35

37 2.3- Technique du E-Test : C est une technique de détermination de la CMI, validée pour les bactéries non exigeantes et pour un certain nombre de bactéries exigeantes (voir tableaux n 7 et n 8). a- Milieu : Il doit être coulé en boîtes de Petri sur une épaisseur de 4 mm Les géloses doivent être séchées avant l emploi. b- Préparation de l inoculum : A partir d une culture pure de 18 à 24 h sur milieu d isolement approprié, racler à l aide d une anse de platine quelques colonies bien isolées et parfaitement identiques. Dans le cas de Streptococcus spp. et d Haemophilus spp. utiliser un écouvillon pour prélever plus facilement les colonies bactériennes. Bien décharger l anse ou l écouvillon dans 5 à 10 ml d eau physiologique stérile à 0,9%. Dans le cas de Neisseria gonorrhoeae, décharger l anse dans 1 à 2 ml de tampon phosphate stérile à ph 7,2. Bien homogénéiser la suspension bactérienne, son opacité doit être équivalente à 0,5 MF ou à une D.O. de 0,08 à 0,10 lue à 625 nm. Ajuster le plus précisément possible. L utilisation d un densitomètre est fortement souhaitable. L inoculum à 0,5 MF est dilué pour certaines bactéries (S.pneumoniae). Se référer aux recommandations du fournisseur. c- Ensemencement : Tremper un écouvillon stérile dans l inoculum. L essorer en le pressant fermement (et en le tournant) contre la paroi interne du tube, afin de décharger au maximum. Frotter l écouvillon sur la totalité de la surface gélosée, sèche, de haut en bas, en stries serrées. Répéter l opération 2 fois, en tournant la boîte de 60 à chaque fois, sans oublier de faire pivoter l écouvillon sur lui-même. Finir l ensemencement en passant l écouvillon sur la périphérie de la gélose. Dans le cas où l on ensemence plusieurs boîtes de Petri, il faut recharger l écouvillon à chaque fois. Ensemencer dans les mêmes conditions la (ou les) souches de référence (voir tableaux n 6, n 7 et n 8). d- Dépôt de la bandelette E-test : Prélever la bandelette à l aide de pinces bactériologiques préalablement flambées au bec Bunsen ; le contact avec les pinces doit se faire au niveau de l extrémité marquée E ; à noter que l utilisation d un applicateur (à commander auprès du fournisseur de bandelettes E- test) est recommandée. 36

38 Déposer la bandelette délicatement sur la surface gélosée, en commençant par l extrémité correspondant aux concentrations les plus faibles de l antibiotique testé puis en progressant jusqu aux concentrations les plus élevées. Eviter la formation de bulles d air entre la gélose et la bandelette, une fois appliquée la bandelette ne peut être déplacée. A noter que l on ne peut déposer qu une ou deux bandelettes E-test au maximum par boîte de 90 mm de ø (risque de chevauchement des ellipses avec plus d une bandelette). Laisser la boîte couvercle en haut pendant 15 mn au plus. Incuber la boîte dans les conditions requises selon la nature de la bactérie testée (voir tableaux n 5, n 7 et n 8). e- Lecture et interprétation : La CMI de l antibiotique testé est lue à l œil nu, boîte ouverte et bien éclairée. Elle correspond à la graduation, située à la jonction entre l ellipse (dessinée par l inhibition de la culture bactérienne) et la bandelette E-test. Contrôler la qualité du test par la CMI de la souche de référence. Se référer au tableau de lecture fourni au niveau du prospectus E-Test. Lire ensuite la CMI de la souche bactérienne testée. Se référer aux recommandations du fournisseur pour l interprétation de cas ambigus (double zone). Comparer les résultats obtenus, aux valeurs critiques figurant dans les tables de lecture correspondantes. Classer la bactérie dans l une des catégories S, R ou I. 37

39 38

40 TESTS COMPLEMENTAIRES Dr H. Ammari 39

41 3-1 Recherche de la résistance de Staphylococcus spp. à l oxacilline 3-2 Recherche de la β-lactamase 3-3 Détection des souches de S.pneumoniae de sensibilité diminuée aux β-actamines a. Antibiogramme b. CMI par bandelettes E-test c. Détermination de la CMI par la technique de dilution en milieu liquide 3-4 Recherche de la β-lactamase à spectre élargi (BLSE) chez les entérobactéries, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp. a. Définition d une BLSE b. Quand rechercher une BLSE c. Méthodes de détection de la BLSE c.1. c.2. c.3. Test de synergie Test de confirmation ou technique du double disque Test à la cloxacilline 3-5 Recherche de Staphylococcus spp. de sensibilité diminuée aux glycopeptides a. Etape de screening ou criblage b. Test de confirmation 3-6 Recherche d Enterococcus spp. de sensibilité diminuée aux glycopeptides a. Critères de présomption ou d alerte b. Test de screening c. Test de confirmation d. Phénotypes de résistance 3-7 Détection d Haemophilus spp. de sensibilité diminuée aux β- lactamines 40

42 Pour certains antibiotiques ou familles d antibiotiques, l antibiogramme standard n est pas suffisant et des tests complémentaires doivent être pratiqués avant une interprétation définitive. Ces tests complémentaires sont résumés dans le tableau suivant : Tableau 11 : Tableau récapitulatif des différentes recherches complémentaires β-lactamase Résistance Oxacilline Résistance Vancomycine BLSE/Case/ IMPase Haemophilus spp. x x CMI BLNAR Neisseria gonorrhoeae Branhamella Staphylococcus spp. S.pneumoniae x x x x x Oxacilline* Vancomycine* β-lactamines Enterococcus spp. x x Vancomycine* Entérobactéries x P. aeruginosa x Acinetobacter spp. * : En présence de signes d alerte. x Nétilmicine colistine 3.1- Recherche de la résistance de Staphylococcus spp. à l oxacilline Pour S. aureus, le disque de céfoxitine est comparable à celui de l oxacilline pour détecter la résistance à l oxacilline par production de PLP2a (gène meca) ; cependant, le disque de céfoxitine est plus facile à lire et donc c est la méthode préférée. Pour S. lugdunensis et les autres staphylocoques à coagulase négative (SCN), le test à la céfoxitine doit être utilisé pour prédire la résistance à l oxacilline. En pratique, pour une meilleure détection de la résistance, les disques d oxacilline (1µg) et de céfoxitine (30µg) doivent être testés simultanément au niveau de l antibiogramme standard de S. aureus. Tableau 12 : Recherche de la résistance à l oxacilline et interprétation des tests (méthode de diffusion des disques) S. aureus Oxacilline (1µg) Céfoxitine (30µg) Interprétation 13mm 12mm 22mm 21mm Souche OXA S Souche OXA R S. lugdunensis --- Autres SCN mm 21mm 25mm 24mm Souche OXA S Souche OXA R Souche OXA S Souche OXA R 41

43 En cas de discordance entre le disque d oxacilline et de céfoxitine pour S. aureus, en présence d une infection sévère à SCN, effectuer une des recherches suivantes : Recherche de la PLP2a Ou screening test à l oxacilline Ou détermination de la CMI de l oxacilline Ou recherche du gène meca. NB : Les souches de staphylocoques méthicillino-résistantes sont généralement résistantes à d autres familles d antibiotiques. Remarque : BORSA (Borderline Oxacillin Resistant S. aureus) : ces souches montrent une activité diminuée de l oxacilline (ou une résistance de bas niveau) non due à la présence du gène meca. Elles ont une CMI de l oxacilline égale à 2mg/L (sensible mais limite). Cette diminution est liée à l hyperproduction de pénicillinase touchant l oxacilline. MODSA (MODified S. aureus) ou résistance par modification des PLP: la modification des PLP normalement présentes chez S. aureus (surtout la PLP4) entraîne des CMI «borderline» ou limites de l oxacilline. Les recherches de la PLP2a ou du gène meca sont négatives. Pour confirmer une souche MODSA, réaliser un antibiogramme avec un disque d imipénème (PLP1), de céfotaxime (PLP2), d oxacilline (PLP3) et de céfoxitine (PLP4). Des discordances entre les différents disques sont observées : la souche étant résistante aux uns et pas aux autres. Tableau 13 : Techniques utilisées pour la recherche de la résistance à l oxacilline Technique Inoculum Milieu T incubation* Durée incubation Céfoxitine (30µg) Oxacilline (1µg) Screening test Oxa Diffusion du disque en milieu gélosé Dilution en milieu gélosé : 6mg/L 0.5 McFarland MH C 16-18h 0.5 McFarland MH+4%NaCl C 24 h CMI Oxa Dilution en milieu gélosé ou MH liquide ou E-Test 0.5 McFarland dilué au 1/10 ème MH+2%NaCl 35 C 24 h PLP2a Selon les recommandations du fabricant Recherche du gène meca PCR * : L incubation des milieux à des températures >35 C pourrait ne pas permettre la détection des souches méthicillino-résistantes. 42

44 Tableau 14 : Interprétation des tests de recherche de la résistance à l oxacilline S. aureus S.lugdunensis SCN Souches témoins Céfoxitine (30µg) Oxacilline (1µg) 21 mm 12mm Résistant 21 mm ---- Résistant 24 mm ---- Résistant ATCC S. aureus Sensible Screening test Oxa > 1 colonie = Résistant > 1 colonie = Résistant > 1 colonie = Résistant ATCC S. aureus Sensible ATCC S. aureus Résistant CMI Oxa 2-4 0,25-0,5 ATCC S.aureus Sensible 1 4µg/mL. ATCC S. aureus Résistant >4µg/mL PLP2a Agglutination : PLP2a (+) Absence agglutination : PLP2a (-) Agglutination : PLP2a (+) Absence agglutination : PLP2a (-) Recherche du gène meca PCR PCR Détermination de la CMI de Staphylococcus spp. vis à vis de l oxacilline en milieu solide: Matériel Série de 11 tubes à essai, numérotés de 160μg/ml à 0,16μg/ml. Série de boîtes de Petri rondes, numérotées de 16 μg/ml à 0,016μg/ml. Culture de 18h de la souche à tester, ainsi que la souche témoin S. aureus ATCC Poudre d antibiotique (oxacilline) titrée ou a défaut celle à usage injectable. Pipette graduée stérile (jetable ou en verre). Gélose Mueller Hinton + 2% de NaCl. Eau distillée stérile. Préparation de la solution mère Peser 16 mg de poudre et diluer dans 10ml d eau distillée. On obtient une solution mère à 1600 μg/ml. S il s agit d une poudre d antibiotique titrée, le volume de solvant à rajouter est calculé comme suit : V = 16mg x titre = ml H 2O distillée 1600µg/ml 43

45 Conditions de manipulation La technique se fera sur gélose MH + 2% NaCl. Inoculum : 0,5 Mc Farland préparé à partir d une culture pure. Incubation : 24 h à 35 ± 2 C en atmosphère normale. La souche de référence S.aureus ATCC doit être testée dans les mêmes conditions. Méthode Préparation de la gamme de concentrations d antibiotiques (selon la tableau cidessous): Commencer par la distribution d eau distillée dans chaque tube. A partir de la solution mère, procéder à la distribution de l antibiotique en changeant de pipette chaque fois que c est nécessaire. Prendre 2ml de chaque concentration d oxacilline (160 μg/ml à 0,16μg/ml) et la mettre dans les boîtes de Petri correspondantes (16 μg/ml à 0,016μg/m). Pour éviter de gaspiller des pipettes, il est conseillé d utiliser une seule pipette, en allant de la plus faible concentration d antibiotique à la plus élevée. Une boîte témoin est obligatoire pour chaque série de CMI, avec 2ml d eau distillée sans antibiotique afin de contrôler l inoculum. Ajouter dans chaque boîte 18ml de Mueller-Hinton + 2% de NaCl (milieu MH fondu et ramené à 45 C). Homogénéiser par mouvements rotatoires et laisser solidifier. Sécher les boîtes. Appliquer 3μl des différentes suspensions sur la gélose à l aide d une anse de platine calibrée (Φ interne de la boucle égale à 3mm), ou à l aide d une micropipette. Incuber 24 h à 35 ± 2 C. 44

46 3.2- Recherche de la β-lactamase : La recherche de la sécrétion de la β-lactamase est obligatoire pour toute souche de N. gonorrhoeae, Haemophilus spp., Branhamella catarrhalis, Enteroccocus spp et Staphylococcus spp. Ces tests doivent être effectués précocement, en raison des implications thérapeutiques évidentes. Plusieurs techniques existent : chromogéniques, microbiologiques et iodométriques. La technique chromogénique permet de donner les résultats le jour même, mais à défaut de pouvoir la pratiquer, les techniques microbiologiques doivent être utilisées. Ci-dessous le protocole technique du test de trèfle : Matériel : Souches de référence : S. aureus ATCC sensible à la pénicilline S. aureus ATCC résistant à la pénicilline Souches à tester : Gélose Mueller-Hinton (MH) Disque de pénicilline G ou ampicilline 45

47 Technique : Ensemencer une souche de S. aureus ATCC sur une gélose MH pour Branhamella catarrhalis ou MH au sang cuit pour N.gonorrhoeae et Haemophilus spp. Appliquer un disque de pénicilline G au centre de la boîte dans le cas d un Staphylococcus spp. ou Neisseria gonorrhoeae ou un disque d ampicilline dans le cas d Haemophilus spp., Enterococcus spp. ou Branhamella catarrahlis. Ensemencer en stries radiales (du centre de la boîte à la périphérie) la souche à tester, une souche témoin négatif (S. aureus ATCC 25923), une souche témoin positif (S. aureus ATCC 43300). Incuber la boîte 18h à 35 C en atmosphère normale ou 24h en atmosphère enrichie en CO2 pour Haemophilus spp. et N. gonorrhoeae. Lecture et interprétation : La production de ß-lactamase (pénicillinase) par la souche à étudier et la souche témoin positif induit la culture de la souche témoin négatif (sensible à la pénicilline) jusqu au contact du disque d ampicilline ou de pénicilline. Souche d Haemophilus à tester : productrice de ß-lactamase Figure 1 (test du trèfle) S. aureus ATCC Disque d'ampicilline S. aureus ATCC Figure 1 : Production de ß-lactamase chez Haemophilus spp. par la technique microbiologique 46

48 3.3- Détection des souches de S. pneumoniae de sensibilité diminuée aux β-lactamines : Actuellement, des souches de S.pneumoniae de sensibilité diminuée aux β-lactamines sont de plus en plus isolées aussi bien à partir de LCR qu à partir des autres prélèvements. Pour cela, la recherche de ces niveaux de résistance doit être systématique car le choix de l antibiotique est alors basé sur la valeur de la CMI et non pas sur les résultats de l antibiogramme. La détection de ces souches est effectuée en plusieurs étapes : 1. Antibiogramme 2. CMI par bandelettes E-Test 3. Test de confirmation, par CMI en milieu liquide. Pour l ensemble de ces tests, la souche de référence S.pneumoniae ATCC (CMI pénicilline : intermédiaire) doit être testée dans les mêmes conditions. a. Antibiogramme : Le CLSI recommande de tester un disque d oxacilline chargé à 1µg pour la détection de la résistance à la pénicilline. Cependant, le disque chargé à 1µg est instable et se décharge rapidement même si la date de péremption n est pas encore atteinte. Par conséquent, il est préférable de tester les deux disques chargés à 1 et 5 µg d oxacilline. Tableau 15 : Recherche de S.pneumoniae de sensibilité diminuée aux β-lactamines Inoculum Diamètre d inhibition Interprétation Tests complémentaires ---- Oxacilline 1µg (CLSI) Oxacilline 5µg (CA-SFM) 0,5 Mc Farland 0,5 Mc Farland 20 mm 19 mm 26 mm 25 mm Sensible à toutes les β- lactamines Sensibilité diminuée à la pénicilline Détermination de la CMI à la pénicilline, amoxicilline, céfotaxime et imipénème Sensible à toutes les β-lactamines ---- Sensibilité diminuée à la pénicilline Détermination de la CMI à la pénicilline, amoxicilline, céfotaxime et imipénème b. CMI par bandelettes E-test : Cette technique, utilisant des bandes imprégnées d un gradient de concentration d antibiotiques, permet d obtenir simplement et rapidement une détermination de la CMI, dans les mêmes conditions que l antibiogramme standard. En routine, elle constitue une alternative acceptable à la méthode de référence. 47

49 Technique : Inoculum : 0,5 Mc Farland ensemencé selon la technique décrite pour l antibiogramme standard Application des bandelettes : sur la surface de la gélose, à l aide de pinces bactériologiques stériles. Utiliser une bandelette par boîte (90 mm de diamètre) Incubation : 18 à 20 heures, sous CO2 (5%) Lecture : L interprétation ne pourra se faire que si les résultats de la souche de référence S.pneumoniae ATCC rentrent dans l intervalle des valeurs critiques données par le CLSI. Lire la valeur de la CMI correspondant à l intersection entre l ellipse de non culture et la bandelette. Comparer ces résultats aux valeurs critiques figurant dans le tableau récapitulatif des valeurs critiques pour les CMI de S.pneumoniae.Classer la bactérie dans l une des catégories : Sensible, Intermédiaire ou Résistant Figure 2 : CMI de la pénicilline G d une souche de S.pneumoniae (technique du E-test) 48

50 Tableau 16 : Valeurs critiques pour les CMI de S.pneumoniae β-lactamine Interprétation Sensible Intermédiaire Résistant Contrôle de qualité S.pneumoniae ATCC Pénicilline parentérale (µg/ml) - Méningite 0, ,12 0, Autre que méningite Pénicilline orale (Pénicilline V) (µg/ml) 0,06 0, ,25-1 Amoxicilline (µg/ml) - Autre que méningite ,03-0,12 Céfotaxime (µg/ml) - Méningite 0, ,03-0,12 - Autre que méningite Imipénème (µg/ml) 0,12 0,25-0,5 1 0,03-0,12 c. Détermination de la CMI par technique de dilution en milieu liquide (recommandée par le CLSI). Elle a été rapportée dans le paragraphe 2.2 du chapitre techniques, elle est reprise dans ce paragraphe pour le cas de S.pneumoniae. Milieu : Répartir du Mueller Hinton (MH) liquide additionné de 2 à 5% de sang de cheval lysé et défibriné dans des tubes stériles à raison de 0,25ml par tube (ou en microplaque à fond rond ou conique à raison de 25µl par cupule). Contrôle de qualité : La souche S. pneumoniae ATCC sera testée dans les mêmes conditions que les souches à tester. Gamme de dilutions : Dissoudre 10,24mg de poudre titrée d antibiotique (exemple pénicilline G) dans 10ml d eau distillée stérile, pour obtenir une solution à 1024 µg/ml. Procéder à la préparation de la gamme de dilutions selon le tableau n 10 en MH + sang défibriné et hémolysé (voir protocole de préparation en annexe). Inoculum : A partir d une culture pure de 18 à 24 heures, sur gélose au sang frais, préparer une suspension de la souche à étudier dans de l eau physiologique, d une densité équivalente à 0,5 Mc Farland. Répartir 0,05ml (50µl) par tube ou 0,005ml (5µl) par cupule de la suspension bactérienne. Au total, dans chaque tube (ou cupule) il y a : 0,25ml (ou 25 µl) de la gamme de dilution de l antibiotique, 50µl (ou 5µl) de l inoculum bactérien et 0,70ml (ou 70µl) de milieu MH liquide+ sang hémolysé. Le tube (ou cupule) témoin comportera : 0,25ml (ou 25µl) d eau distillée, 50 µl (ou 5µl) de l inoculum bactérien et 0,70ml (ou 70µl) de milieu MH liquide + sang hémolysé. 49

51 Incubation : Incuber les tubes ou les microplaques à 35 C pendant 18 à 20 heures en atmosphère ordinaire. Les micro plaques doivent être recouvertes à l aide de couvercles. Lecture : Le tube (ou cupule) témoin doit être trouble, indiquant une culture bactérienne. La CMI correspond à la plus faible concentration d antibiotique ne donnant pas de croissance visible (absence de trouble et/ou absence de changement de couleur). Interprétation : L interprétation ne pourra se faire que si les résultats de la souche de référence S.pneumoniae ATCC sont conformes aux valeurs critiques données par le CLSI M100, S21. En cas de résultats non interprétables, répéter le test Recherche de la β-lactamase à spectre élargi (BLSE) chez les entérobactéries, Pseudomonas aeruginosa et Acinetobacter spp. : a. Définition d une BLSE : Les BLSE désignent des enzymes «β-lactamases» produites par les entérobactéries, Pseudomonas aeruginosa et Acinetobacter spp. entraînant une diminution de l activité des céphalosporines de 3 ème génération (C3G) (céfotaxime, ceftriaxone, ceftazidime) et des monobactames (aztréonam), mais n ayant aucune activité vis-à-vis des céphamycines (céfoxitine, moxalactam) ni des carbapénèmes (imipénème). b. Quand rechercher une BLSE : Selon les recommandations du CLSI (M100-S21), la recherche de la BLSE pour l interprétation de la sensibilité des entérobactéries, Pseudomonas spp. et Acinetobacter spp. aux céphalosporines n est plus obligatoire. La détection phénotypique de la BLSE épidémiologiques et en hygiène hospitalière. garde tout son intérêt dans les études On recherchera une BLSE devant un diamètre inférieur aux valeurs suivantes : céfotaxime (CTX 27mm), ceftazidime (CAZ 22mm), ceftriaxone (CRO 25mm), aztréonam (ATM 27mm). c. Méthodes de détection de la BLSE : c.1. Test de synergie : Les BLSE dérivées des enzymes de classe A (Ambler) sont inhibées par les inhibiteurs de β-lactamases (acide clavulanique, sulbactam et tazobactam). 50

52 c.1.1. Entérobactérie : (fig 3) Technique : La recherche de la BLSE se fait dans les conditions standards de l antibiogramme en déposant un disque d amoxicilline+acide clavulanique (AMC 20/10μg) à 30mm centre à centre d un disque de C3G (Céfotaxime : CTX 30μg ou Ceftriaxone : CRO 30μg). Incuber 18H à 35 C. Remarque : Cette technique permet la mise en évidence des TEM et SHV. Pour les autres BLSE de classe A (CTX-M, CMT, ) : Le test de synergie doit être fait dans les mêmes conditions standards de l antibiogramme en déposant un disque d AMC à 30mm centre à centre d un disque de : CAZ, CTX ou CRO et ATM en raison de l existence de phénotypes de résistance différents (céfotaximase ou ceftazidimase ). Lecture : La production d enzyme peut se traduire par l apparition d une image de synergie ou bouchon de champagne entre les disques : - AMC et CTX - AMC et CAZ - AMC et ATM. CTX CAZ AMC ATM CRO Figure 3: Souche de Klebsiella pneumoniae productrice de ß-lactamase à spectre élargi (Bouchon de champagne) Recommandation : Chez P.mirabilis, P.penneri, P.vulgaris, Morganella morganii, Providencia stuartii, les BLSE s expriment à bas niveau ; dans ce cas, le test de synergie est optimisé en disposant les disques à une distance de 40 à 45mm au lieu de 30mm. Absence de synergie : En l absence d une image de synergie, la production de BLSE sera suspectée devant toute diminution du diamètre autour des disques de C3G. 51

53 Elle peut être due à : 1) La synthèse d une BLSE de type CMT (Complexe Mutants TEM) 2) L association de plusieurs mécanismes : BLSE + Case hyperproduite (entérobactérie). 3) La recherche de CMT : se fera en rapprochant les disques CTX- AMC de 20mm et 25mm au lieu de 30mm. 4) La détection des BLSE chez les souches hyper productrices de Case est facilitée par : Ou La recherche d une synergie entre AMC et céfépime (CFP 30μg) ou cefpirome (CPO 30μg SFM), car ce sont des molécules stables à l action de la Case hyperproduite (recommandations du CA-SFM-2011). L inactivation de la Case en incluant de la cloxacilline (0,25mg/ml - 0,30mg/ml) dans la gélose pour les entérobactéries du groupe 3 (Voir test à la cloxacilline). 5) L usage de disque ou de bandelette E-test combinant une C3G et un inhibiteur enzymatique. Risque d erreur d interprétation : Chez Klebsiella oxytoca, P.vulgaris, P.penneri, Citrobacter koseri, le test de synergie est positif avec aztréonam et / ou ceftriaxone, mais reste négatif avec ceftazidime dont l activité est conservée, signe d hyperproduction de ß-lactamase naturelle chromosomique ou aztréonamase. c.1.2- Pseudomonas aeruginosa et Acinetobacter spp. : La détection est plus difficile en raison d association avec d autres mécanismes de résistance tels : hyperproduction de céphalosporinase. Technique : La recherche de la BLSE se fait dans les conditions standard de l antibiogramme en déposant un disque de ticarcilline+acide clavulanique (TCC 75/10μg) à 30mm (centre à centre) d un disque de C3G : ceftazidime (CAZ 30μg), aztréonam (ATM 30 μg), céfépime (FEP 30 µg). Incubation : Incuber 18 H à 35 C Lecture : Le test est positif s il y a apparition d une image de synergie ou «bouchon de champagne» entre les disques : - TCC et CAZ - TCC et ATM - TCC et FEP S il y a absence de synergie, on peut rechercher la BLSE par : 1- Le rapprochement des disques TCC et CAZ (15mm et 20mm centre à centre) au lieu de 30mm. 52

54 2- La neutralisation de la Case : Si la souche est productrice d une Case hyper produite, faire le test de synergie sur Mueller-Hinton additionné (de 250mg/l à 500 mg/l) de cloxaciline. Figure 4: Souche de Pseudomonas aeruginosa productrice de ß-lactamase à spectre élargi. c.2- Test de confirmation ou technique du double disque (fig 5): Ce test devra être fait systématiquement devant : L absence de synergie avec diminution des diamètres des C3G La présence d une résistance aux molécules suivantes : ampicilline, ticarcilline, céfazoline avec un diamètre <6mm, par contre l AMC présente un diamètre d inhibition. Technique : Ce test se fait dans les conditions standard de l antibiogramme. Appliquer les disques d antibiotiques : Pour les entérobactéries : Déposer un disque d AMC et un disque de C3G (CTX ou CRO) à une distance de 30mm (centre à centre). Pour P.aeruginosa et Acinetobacter spp. : Déposer un disque de TCC avec un disque de C3G (CAZ) ou monobactame (ATM) à une distance de 25mm. Certains auteurs signalent une meilleure détection des BLSE en testant un disque de céfopérazone (75μg) avec un disque de TCC (75/10 μg). Laisser diffuser les antibiotiques pendant une heure, à la température ambiante (sur la paillasse), la boîte sera déposée couvercle vers le haut. Après 1H d incubation, ôter le disque d AMC (ou de TCC) et le remplacer par un disque de CTX ou CRO (ou CAZ). Incuber la boîte 18 H à 35 C. 53

55 Lecture et interprétation : Le test du double disque est positif quand le diamètre d inhibition autour du C3G, appliqué après diffusion du disque AMC ou TCC est 5mm par rapport au diamètre d inhibition autour du disque de C3G. Exemple : diamètre de CTX = 16mm ; diamètre de CTX+AMC = 21mm donc souche BLSE(+). L interprétation (R, I ou S) se fait selon les diamètres mesurés (voir table de lecture 1). L interprétation du test consiste à répondre : Suite à la révision des breakpoints des céphalosporines, la lecture interprétative anciennement basée sur la détection ou non d une BLSE, n est plus nécessaire. La réponse R, I ou S se fait en se référant aux seuls diamètres mesurés. A souligner cependant que la détection phénotypique de la BLSE garde tout son intérêt dans les études épidémiologiques et en hygiène hospitalière. Figure5 : K. pneumoniae productrice de BLSE : Test du double disque positif. Contrôle de qualité : Les mêmes techniques seront réalisées en parallèle pour les souches : E. coli ATCC non productrice de BLSE. K. pneumoniae ATCC productrice de BLSE. c.3- Test à la Cloxacilline : Principe : Pour certaines souches de bacilles à Gram négatif, il est parfois difficile de distinguer sur l antibiogramme habituel les hypersécrétions de Case (CHN) des BLSE. La cloxacilline, ajoutée au milieu pour l antibiogramme (MH), inhibe in vitro les Cases et reste inefficace sur les pénicillinases des bacilles à Gram négatif. 54

56 Tableau 17 : Préparation des boîtes de cloxacilline (ou oxacilline) Entérobactéries du Groupe 1 et 2 Entérobactérie groupe 3 Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter spp. Concentration encloxacilline 0,25mg/ml 0,3mg/ml 0,5mg/ml 0,25mg/ml Préparation de la solution cloxa 25mg de Cloxa + 10ml d eau distillée 30mg de Cloxa + 10ml d eau distillée 50mg de Cloxa + 10ml d eau distillée 25mg de Cloxa + 10ml d eau distillée Pour une boîte ronde (90mm) 2ml de la solution +18ml de MH 2ml de la solution + 18ml de MH 2ml de la solution + 18ml de MH 2ml de la solution + 18ml de MH Technique : L antibiogramme sera réalisé sur MH additionné de cloxacilline (selon le tableau ci-dessus). On dépose sur la surface gélosée ensemencée les disques antibiotiques (ß-lactamines) figurant dans le tableau 1 (entérobactérie, P.aeruginosa et Acinetobacter spp.). Incuber 18 Heures à 35 C - NB : Un contrôle de qualité sera réalisé avec les souches E. coli ATCC et P.aeruginosa ATCC Lecture : Le test à la cloxacilline est interprété en comparant l antibiogramme réalisé sur MH additionné de cloxacilline à celui réalisé sur MH sans cloxacilline. A B A : Antibiogramme sur MH B : Antibiogramme sur MH+ 0.25mg/ml de cloxacilline Noter la différence de diamètre d inhibition autour des céphalosporines de 3 ème génération entre les deux tests. Absence de synergie entre l AMC et les C3G Figure 6 : Test à la cloxacilline sur une souche de K.pneumoniae : BLSE- et CASE+ 55

57 Interprétation : L inhibition de la Case entraîne : Ou 1) L apparition des phénotypes sauvages de l entérobactérie, de P.aeruginosa ou d Acinetobacter spp. 2) L apparition d autres mécanismes de résistances acquises tels que : - Synthèse de BLSE - Pénicillinase - Imperméabilité Recommandations : 1) Il existe des souches d entérobactéries du groupe 3, ainsi que des souches de P. aeruginosa qui sécrètent des Cases à très haut niveau.il est possible d utiliser des milieux contenant 0,5 mg/ml de cloxacilline pour les entérobactéries et 1 mg/ml de cloxacilline pour P.aeruginosa. - En cas d absence de culture, réaliser une CMI à la cloxacilline de la souche à tester. La concentration pour le test à la cloxacilline sera inférieure de deux dilutions par rapport à la CMI. 2) Chez Enterobacter spp., un disque de céfépime peut être testé à l antibiogramme (pratiquement toujours actif sur les Cases). L obtention d un diamètre réduit avec déformation de la zone d inhibition, évoque la présence d une BLSE 3) Les BLSE chez le P.aeruginosa (PER, VEB ) : pour mettre en évidence la synergie, il faut rapprocher les disques AMC et TCC du disque de CAZ à 1,5 mm. 4) Cas particulier de la VEB -1 : La BLSE de type VEB-1 est suspectée devant une synergie entre CAZ-TCC/AMC (1,5 mm de distance), FEP-TCC et ATM-TCC et aussi une synergie IMP-ATM, FOX-ATM, FEP-FOX et FEP-IMP. Ces disques doivent être testés sur MH simple et MH additionné de cloxacilline (2). 56

58 Figure 7 : P.stuartii codant pour une bla VEB-1. Image A : L inhibiteur de la BLSE est l acide clavulanique ; il y a une synergie entre l acide clavulanique et le céfépime et entre l acide clavulanique et l aztréonam. Image B : Les inhibiteurs de la BLSE sont imipénème et céfoxitine qui donnent une image de synergie avec le céfépime et l aztréonam. Les disques testés contiennent la ticarcilline+ acide clavulanique (TCC), l imipénème (IMP), la céfoxitine (FOX), le céfépime (FEP), et l aztréonam (AZT). (2) Tableau 18 : Phénotypes de résistance en fonction des différentes BLSE (33) β-lactamines Synergie Enzymes / Classe A AMX AMC TIC TCC PIP TAZ FOX CTX CAZ FEP ATM IMP AC EDTA CTX-M R S R S R S S R S I/R R S + - CTX-M mutée R S R S R S S R R I/R R S + - Autre BLSE(Klebsiella) Autre BLSE(P.aeruginosa) BLSE chromosomique R S R S R S S R S/I/R S/I/R S/I/R S + - R R R I/R R I/R R R R I/R R S + - R S R S R S S S S S S S + (CXM) - Remarque : Le typage des BLSE se fait uniquement par les techniques de biologie moléculaire (PCR avec des amorces spécifiques) suivies d un séquençage. 57

59 3.5- Recherche de Staphylococcus spp. de sensibilité diminuée aux glycopeptides : Acronymes : VRSA : Vancomycine Resistant S.aureus VISA : Vancomycine Intermediate S.aureus GISA : Glycopeptide Intermediate S.aureus Hétero-VISA : Souches sensibles à la vancomycine avec une sous-population vancomycine I et en général I (ou R) à la teicoplanine. 1. Pour déterminer la sensibilité des staphylocoques à la vancomycine, la détermination de la CMI doit être effectuée pour toutes les souches. La méthode de diffusion des disques ne permet pas de différencier les souches de : S. aureus sensibles à la vancomycine des souches de sensibilité diminuée (intermédiaire). SCN sensibles, intermédiaires ou résistantes (diamètres d inhibition similaires) Le disque de vancomycine (30µg) permet la détection des souches de S.aureus de phénotype vana (VRSA); ces souches ne présenteront aucun diamètre d inhibition autour du disque de vancomycine (< 6mm). L identification de telles souches devra être confirmée. Toute souche de S. aureus dont la CMI de la vancomycine 8µg/ml doit être envoyée à un laboratoire de référence. Toute souche de SCN dont la CMI de la vancomycine 32µg/ml doit être envoyée à un laboratoire de référence. 2. Pour déterminer la sensibilité des staphylocoques à la teicoplanine, utiliser la méthode de diffusion des disques et/ ou la détermination de la CMI en présence des signes d alerte suivants : Diamètre <15mm pour vancomycine et <14mm pour la teicoplanine. Une différence de 3mm (au moins) entre les diamètres d inhibition de la vancomycine et la teicoplanine. Présence de colonies dans les zones d inhibition de la vancomycine et/ou teicoplanine. Interactions (synergie ou antagonisme) entre les disques de glycopeptides et Oxacilline 5µg. Résistance de la souche à la méthicilline, gentamicine ou rifampicine. Lors d infections sévères. La mise en évidence des résistances aux glycopeptides se fait en deux étapes : 1. Etape de screening ou criblage. 2. Test de confirmation. 58

60 a. Etape de screening ou criblage : Une, au moins, des 3 techniques suivantes doit être utilisée : Milieu Technique Interprétation (+) Témoin (-) Témoin (+) BHI agar + 6µg/ml vancomycine Spot de 10μl d une suspension 0.5McF/ 24h à 35 C± 2 C 2 colonies S.aureus ATCC Sensible E.faecalis ATCC Résistant MH agar + 5µg/ml teicoplanine Spot de 10μl d une suspension 2McF / 24h à 35 C± 2 C 4 colonies S.aureus ATCC Sensible E.faecalis ATCC Résistant BHI agar E-test modifié Ecouvillonnage avec 200μl d une suspension à 2McF/ 24 à 48 h 35 C± 2 C VAN et TEC 8µg/ml Ou TEC seule 12µg/ml S.aureus ATCC Sensible E.faecalis ATCC Résistant b. Test de confirmation : Se base sur la détermination des CMI. Ce test de confirmation est obligatoire devant tout test de criblage positif. CMI par dilution en milieu gélosé, avec un inoculum de 0,5 Mc Farland dilué au 1/10 ème puis ensemencer 1 à 2μl par spot, sur MH agar et incuber 24h. E-test sur gélose MH avec un inoculum de 0,5 Mc Farland et incuber 24h. Remarque : La détermination de la CMI ne permet pas d identifier les souches hétéro- VISA. Pour ce faire, il faut une analyse de population (pratiquée au niveau d un laboratoire de référence). A défaut, voici les critères qui font suspecter une souche hétéro- VISA : CMI de la vancomycine = 4mg/l en E-test Sensibilité à la vancomycine (CMI = 2 ou 4mg/l) et réponse limite à la teicoplanine (CMI = 8mg/l) en E-test. Antibiotiques Concentrations critiques (μg/ml) Sensible Intermédiaire Résistant Souches témoins S.aureus Vancomycine Teicoplanine S.aureus ATCC (sensible) E.faecalis ATCC (résistante) SCN Vancomycine Teicoplanine S.aureus ATCC (sensible) E.faecalis ATCC (résistante) 59

61 Figure 8 : Algorithme décisionnel pour l étude de la sensibilité des staphylocoques aux glycopeptides 3.6. Recherche d Enterococcus spp. de sensibilité diminuée aux glycopeptides : Acronymes : VRE ou ERV : Vancomycine Resistant Enterococcus ERG : Entérocoque Résistant aux Glycopeptides L isolement d une souche d E.faecium résistante à la vancomycine est une alerte car il y a un risque d épidémie qui nécessite une enquête de dépistage. La mise en évidence de ces résistances se fait en trois étapes : 1. Critères de présomption ou d alerte. 2. Etape de screening ou criblage. 3. Test de confirmation. 60

62 a. Critères de présomption ou d alerte : Diamètre <17mm pour vancomycine et <14mm pour la teicoplanine. Une différence de 3mm (au moins) entre les diamètres d inhibition de la vancomycine et la teicoplanine. Présence de colonies dans les zones d inhibition de la vancomycine et/ou teicoplanine. En cas d échec thérapeutique. En présence de l un de ces critères, il est recommandé de faire un screening test et une CMI. b. Test de screening : BHI agar + 6µg/ml de vancomycine Ensemencer 1 à 10μl d une suspension de 0,5 Mc Farland (par spot) Incuber à 35 C± 2 pendant 24 h Si > 1 colonie : faire une CMI c. Test de confirmation : Ce test de confirmation est obligatoire devant tout test de présomption et /ou de criblage positif. Il se base sur la détermination des CMI et l identification de l espèce afin de distinguer les espèces ayant acquis une résistance (Van A et Van C) de celles ayant une résistance naturelle (E.gallinarum, E.casseliflavus). CMI par dilution en milieu gélosé, avec un inoculum de 0,5 Mc Farland dilué au 1/10 ème puis ensemencer 1 à 2μl par spot, sur MH agar et incuber 24h. E-test sur gélose MH avec un inoculum de 0,5 Mc Farland et incuber 24h. Antibiotiques Concentrations critiques (μg/ml) Sensible Intermédiaire Résistant Souches témoins Vancomycine Teicoplanine S.aureus ATCC (sensible) E.faecalis ATCC (résistante) S.aureus ATCC (sensible) E.faecalis ATCC (résistante) 61

63 d. Phénotypes de résistance (6) Phénotype de résistance Van A : Haut niveau de résistance (CMI VAN: µg/ml) (CMI TEC: µg/ml) Van B : Niveau de résistance variable (CMI VAN : µg/ml) (CMI TEC: 0,5-1µg/ml) Van C/ Van E : Bas niveau de résistance (CMI VAN: 2-32µg/ml) (CMI TEC: 0,5-1µg/ml) Van D : Niveau de résistance modéré (CMI VAN: µg/ml) (CMI TEC: 4-64µg/ml) Conséquences thérapeutiques - Vancomycine et Teicoplanine seules, inefficaces - Perte de la synergie avec la gentamicine - Activité de la Vanco diminuée, perte de la synergie avec gentamicine et streptomycine - Teico seule activité conservée avec risque élevé de sélection de mutants résistants - Synergie en association conservée Aux doses optimales, pas de conséquences Activité in vitro conservée, mais pas d activité in vivo Van F - Non connues 3.7- Détection d'haemophilus spp. de sensibilité diminuée aux β-lactamines: Chez Haemophilus influenzae, le mécanisme essentiel de la résistance aux β-lactamines est enzymatique par sécrétion de β-lactamase. Il est observé chez 18 % (28/156) des souches étudiées par le réseau national de surveillance de la résistance aux antibiotiques en Il existe un autre mécanisme de résistance vis-à-vis des β-lactamines. Il s agit d un mécanisme non enzymatique reposant sur une modification de la cible des β-lactamines, les PLP ou protéines de liaison à la pénicilline. Ces souches sont appelées BLNAR (Beta-Lactamase Negative Ampicillin Resistant). Ce dernier mécanisme est surtout observé chez les souches non typables et confère une résistance de bas niveau aux β-lactamines (CMI de l ampicilline 1mg/l) souvent non décelable à l antibiogramme standard. Technique : Certaines de ces souches poussant faiblement sur milieu HTM, une gélose chocolat + polyvitex est utilisée pour tester les β-lactamines. Inoculum : 0,5 Mc Farland dilué au 1/10. Les antibiotiques à tester: ampicilline (2µg), céfalotine (30μg), amoxicilline (25μg) et amoxicilline+acide clavulanique (20/10µg). La souche de référence : H.influenzae ATCC (sensible) (ou à défaut une souche connue comme étant sensible aux β-lactamines) doit être testée dans les mêmes conditions. 62

64 Lecture : Elle se fera de manière interprétative en comparant les résultats de la souche à tester avec ceux de la souche de référence. Les souches BLNAR présenteront un diamètre diminué autour des disques d ampicilline (2µg) et céfalotine (30µg) même si elles restent sensibles à l amoxicilline et dans ce cas répondre : souche de sensibilité diminuée aux β-lactamines et déterminer la CMI par methode E-test sur milieu HTM. NB : Les deux mécanismes (production de β-lactamase et BLNAR) peuvent être associés, il faut donc systématiquement rechercher la production de β-lactamase. 63

65 64

66 RECHERCHES PARTICULIERES Dr M. N. Ouar- Korichi 65

67 4.1 Recherche et approche phénotypique des céphalosporinases (Cases) transférables (AmpC) Tests de détection a. Méthode des 2 disques de céfoxitine et de céfotétan avec inhibiteur b. Test à la cloxacilline c. Test d inhibition par l acide boronique d. Recherche à partir de l extrait enzymatique e. Autres techniques 4.2 Recherche et approche phénotypique des carbapénèmases Classification Signes d appel Détection des carbapénèmases a. Carbapénèmase de la classe A d Ambler b. Carbapénèmase de la classe B d Ambler : métallo-carbapénèmase c. Carbapénèmase de la classe D 66

68 Dans ce chapitre sont répertoriées quelques techniques phénotypiques pour la caractérisation des β-lactamases. Ces tests ne sont pas obligatoires pour l interprétation de l antibiogramme mais aident le microbiologiste à mieux comprendre les mécanismes de résistance des bactéries aux β-lactamines Recherche et approche phénotypique des céphalosporinases (Cases) transférables (AmpC) Ce type de résistance a été identifié dès les années 90, il est suspecté lorsqu il existe une résistance acquise aux C3G avec un test de synergie négatif en particulier chez les espèces non productrices de Case telles que : K.pneumoniae, K.oxytoca, Salmonella spp., P.mirabilis. Les Cases transférables (AmpC) inactivent les aminopénicillines, l amoxicilline+acide clavulanique, les uréidopénicillines, la ticarcilline, les C1G, C2G, C3G et même les céphamycines, latamoxef et l aztréonam mais elles n ont aucune activité vis-à-vis du céfépime, du cefpirome et des carbapénèmes. Nous notons l absence de synergie avec l acide clavulanique et avec l EDTA. Exemples : CMY/LAT, MIR-1, DHA-1, ACC-1 Les Cases de type AmpC sont inhibées par divers inhibiteurs tels que la cloxacilline (activité inhibitrice étroite) ou «BRL 42715» et «Ro » qui ont une activité inhibitrice plus large. BRL : N-1 méthyl-1,2,3-triazolyl méthylène(skb) inibiteur des enzymes : - synthétisés par les plasmides : TEM, SHV, OXA, enzymes staphylococciques - synthétisés par les chromosomes de Bacteroides spp., Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Morganella spp., Escherichia spp., Klebsiella spp. et Proteus spp. Ro : 2 β alkenyl penicillamic acid sulfone (Hoffmann- Laroche Ltd.) inihibiteur des β- lactamases des groupes 1, 2b et 2be. Tableau 19 : Phénotypes de résistance des souches synthétisant des céphalosporinases(33) Enzymes CMY, DHA FOX, MOX β - Lactamines Synergie AMX AMC TIC TCC PIP TAZ FOX CTX CAZ FEP ATM IMP AC EDTA R R R I R S/I/R R I/R R S I/R S - - ACC-1 R R R I R S/I/R S I/R R S I/R S Tests de détection (18): a. Méthode des 2 disques de céfoxitine et céfotétan avec inhibiteur : Réaliser un antibiogramme, dans une boîte carrée de 16 cm, avec deux disques de céfoxitine (FOX) et deux disques de céfotétan (CTT). Placer 2 disques vierges imprégnés d une solution d inhibiteur de Case (INH) (cloxacilline : 100 et 200 µg ; Ro : 10 et 20 µg ; BRL : 10 et 20 µg), et un disque de céfoxitine et un disque de céfotétan auxquels on ajoute une solution d inhibiteur à la concentration de 20 µg (Ro ou BRL 42715) selon le schéma suivant : 67

69 FOX 25 mm INH 25 mm 25 mm FOX 25 mm IN INH (inhibiteur de Case) : cloxa 100µg et 200µg ou Ro (10 et 20 µg) ou BRL (10 et 20 µg). Les disques utilisés sont : FOX (céfoxitine) et CTT (céfotétan). En bas : Fox+INH/CTT+INH (20µg de Ro /20µg BRL42715) 25 mm 25 mm CTT 25 mm CTT FOX+ INH CTT+ INH Figure 9 : Schéma expliquant la disposition des disques d antibiotiques et les distances entre chacun d eux pour la détection des céphalosporinases (Case). 68

70 Standardisation de l antibiogramme à l échelle nationale (médecine humaine et vétérinaire) A : Cloxa (100 et 200 µg) 6ème édition 2011 B : Ro (10 et 20 µg) A : La cloxacilline est un faible inhibiteur de Case. B : Apparition d une image de synergie entre l inhibiteur Ro et les disques de céfoxitine et céfotétan, synergie plus importante avec 20µg de Ro C : Apparition d une image de synergie entre l inhibiteur BRL et les disques de céfoxitine et céfotétan, synergie plus importante avec 20µg de Ro C : BRL (10 et 20 µg) Figure 10: Recherche des Cases par la méthode des 2 disques de céfoxitine et céfotétan avec inhibiteur (18) - Le céfotétan (CTT) est un antibiotique de référence pour mettre en évidence l enzyme ACC-1 en le plaçant face à des disques imprégnés par les inhibiteurs Ro (10 ou 20 µg) ou BRL (10 ou 20 µg).. - Apparition d une image de synergie entre les disques FOX et /ou CTT et le disque d inhibiteurs : l enzyme mise en évidence est ACC-1 - La cloxacilline est un faible inhibiteur par rapport aux autres inhibiteurs testés, cependant ces derniers ne sont pas actuellement commercialisés. 69

71 b- Test à la cloxacilline (1) Principe : Ce test utilise la cloxacilline qui agit comme inhibiteur de Case tout en restant inefficace sur les pénicillinases des bacilles à Gram négatif. Il est utilisé pour distinguer sur l antibiogramme habituel, les hypersécrétions de Cases (CHN) des BLSE. Technique : L antibiogramme sera réalisé sur MH additionné de cloxacilline (selon le tableau cité ci-après) Entérobactéries groupe1 et 2 Entérobactéries groupe3 P. aeruginosa -Acinetobacter spp. Concentration en cloxacilline 0,5 mg/ml 1 mg/ml Préparation de la solution de la cloxa 50mg de Cloxa+ 10ml d eau distillée 100 mg de Cloxa +10 ml d eau distillée Pour une boîte ronde (90mm) 2 ml de solution +18 ml de MH 2 ml de solution+ 18 ml de MH NB : L oxacilline peut être utilisée à la place de la cloxacilline. On dépose, sur la surface gélosée et ensemencée, les disques d antibiotiques (β- lactamines figurant dans le tableau N (entérobactérie, P.aeruginosa et Acinetobacter spp.) Incuber 18 heures à 35 C Contrôle de qualité : E.coli ATCC et P.aeruginosa ATCC Lecture : Le test à la cloxacilline est interprété en comparant l antibiogramme réalisé sur MH additionné de cloxacilline à celui réalisé sur MH sans cloxacilline (gardé la veille au frais). Interprétation : L inhibition de la Case entraîne : - L apparition des phénotypes sauvages de l entérobactérie, de P. aeruginosa ou d Acinetobacter spp. - L apparition d autres mécanismes de résistances acquises tels que : synthèse de BLSE, pénicillinase, imperméabilité. Remarque : Parfois, il faudra augmenter la concentration de la cloxacilline. c- Test d inhibition par l acide boronique (5) Préparation des disques contenant une solution d acide boronique : - Prendre 120 mg d acide phénylboronique (benzene boronic acid), le dissoudre dans 3 ml de diméthyl sulfoxide, ajouter 3 ml d eau distillée stérile. - Déposer 20 µl (400µg) de cette solution dans des disques vierges et des disques contenant du céfotétan (30µg). - Les disques sont séchés pendant 30 mn à température ambiante - Ces disques peuvent être utilisés immédiatement ou stockés à +4 ou -70 C (dans un étui sec) 70

72 - Ensemencer une boîte de MH avec un inoculum de 0.5 Mc Farland, déposer un disque de céfotétan (30µg) et un disque de céfotétan (30 µg) + 400µg d acide boronique. Incuber la boîte 18 H à 35 C. Lecture : Toute augmentation du diamètre d inhibition de 5 mm, voire plus, autour du disque de céfotétan associé à l acide boronique par rapport au disque de céfotétan seul révèle la présence d AmpC. Figure 11 : Comparaison entre le test de confirmation pour les BLSE et le test à l acide boronique pour la détection des AmpC. (5) Recherche de β-lactamase avec deux K.pneumoniae de référence ATCC produisant une BLSE sans AmpC et R154 qui produit une Amp C sans BLSE. A gauche : A droite : K. pneumoniae ATCC BLSE (+) AmpC (-). En haut : L acide clavulanique restaure l activité de ceftazidime ; en bas : il n ya pas de différence significative entre les diamètres d inhibition autour de céfotétan seul et céfotétan+acide boronique. K. pneumoniae ATCC R154 BLSE (-) AmpC(+).En haut : L acide clavulanique ne restaure pas l activité de ceftazidime ; en bas : l acide boronique restaure l activité de céfotétan avec présence d une image de synergie entre les deux zones d inhibition. 71

73 Les associations ceftazidime+acide clavulanique et ceftazidime +acide boronique donnent une faible restauration de l activité de ceftazidime ; l association ceftazidime+acide clavulanique +acide boronique entraîne une restauration de l activité de ceftazidime. Figure 12 : Recherche des β-lactamases (BLSE et AmpC) en utilisant ceftazidime et ceftazidime+acide clavulanique (en haut) et les mêmes deux disques après ajout de 20 µl (400 µg) d acide boronique (en bas). K. pneumoniae synthétise une BLSE et une Amp C (5). d- Recherche à partir de l extrait enzymatique (7) - Travailler à partir d une culture fraîche de 18 H sur gélose Mueller-Hinton ; récupérer la culture dans un tube de centrifugation (10-15 mg) et resuspendre cette culture en eau peptonée, centrifugé à 3000 tr/mn pendant 15 mn. - Extraction enzymatique : Le culot de centrifugation va subir 7 étapes de congélation et décongélation entraînant la lyse bactérienne et libérant ainsi les enzymes. - Ensemencer E. coli ATCC sur une boîte de MH, placer 4 disques de céfoxitine (30µg) au niveau des 4 extrémités d une boîte ronde. - Au centre de la gélose, à l aide d une pipette Pasteur, faire 4 petits puits distants de 5mm entre eux. A partir de ces puits, découper à l aide d un scalpel stérile 4 petites lignes de gélose de 3 cm de long vers les 4 disques de céfoxitine. S arrêter à 3 mm du disque. - Déposer 30 à 40 µl d extrait enzymatique dans les 4 puits. - Laisser reposer 5 à 10 mn la boîte, incuber 1 nuit à 35 C. Ce test doit être refait sur une autre boîte après addition dans l extrait enzymatique d un disque de 5 µg de cloxacilline incubé à 35 C pendant 30 mn. Puis on dépose cet extrait dans la boîte. 72

74 Lecture : Boîte 1 (extrait enzymatique sans cloxacilline): - Si la zone d inhibition autour du disque de la céfoxitine ne change pas : pas de Case. - S il y a invagination du diamètre d inhibition autour du disque de céfoxitine : c est une Case. Boîte 2 (extrait enzymatique + cloxacilline): - Pour le même extrait enzymatique l image va disparaître car la Case sera détruite par la cloxacilline. La souche A (souche testée) : nette déformation de la zone d inhibition. Souche B : souche de référence AmpC (+) ; Souche C (souche testée) : faible déformation du diamètre d inhibition, elle est considérée comme indéterminé ou négatif ; Souche D: souche de référence négative AmpC (-). Figure 13 : Recherche de céphalosporinase à partir de l extrait enzymatique e- Autres techniques : - Transfert par conjugaison de la résistance aux C3G sans synergie avec l acide clavulanique. - PCR Le typage des céphalosporinase se fait uniquement par les techniques de biologie moléculaire (PCR avec des amorces spécifiques) suivies d un séquençage Recherche et approche phénotypique des carbapénèmases Commercialisés depuis plus de 15 ans, les carbapénèmes (imipénème et méropénème) restent toujours actives et apparaissent souvent comme le dernier recours thérapeutique. Cependant, de nombreuses enzymes différentes sont décrites de part le monde, elles sont majoritairement transférables. Ces enzymes sont dénommées : IMP, VIM, SPM, GIM, KPC, GES, OXA et retrouvées chez des bactéries opportunistes comme P. aeruginosa et Acinetobacter baumannii. Actuellement, elles sont décrites chez les entérobactéries. 73

75 Classification: Tableau 20 : Classification des carbapénèmases (16) Classification d AMBLER Type d enzyme Spectre d activité Germes A type sérine KPC Toutes les β-lactamines Entérobactéries Ps. aeruginosa A type sérine SME Carbapénèmes et aztréonam mais S. marcescens pas C3G A type sérine NMC-A, IMI Carbapénèmes et aztréonam mais Enterobacter spp. pas C3G A type sérine GES Imipénème et C3G Ps. aeruginosa Entérobactéries B métallo-β- lactamase IMP, VIM Toutes les β-lactamines sauf aztréonam Entérobactéries Pseudomonas spp. Acinetobacter spp. D type sérine OXA Carbapénèmes (faible activité) Acinetobacter spp. (Entérobactéries) Signes d appel (8) Diamètre d inhibition pour méropénème et imipénème < 22 mm Diamètre d inhibition pour ertapénème< 21 mm Présence de colonies discrètes dans la zone d inhibition des carbapénèmes (surtout ertapénème) CMI (E-test) pour les carbapénèmes 2 μg/ml CMI (E-test) pour ertapénème > 0.5 μg/ml Et habituellement Résistance aux C3G (ceftazidime, céfotaxime, ceftriaxone) Tableau 21 : Phénotypes de résistance en fonction des différentes carbapénèmases (33) Enzymes β-lactamine Synergie AMX AMC TIC TCC PIP TAZ FOX CTX CAZ FEP ATM IMP AC EDTA IMP, VIM, SPM, GIM R R R R R R R R R R R R - + NMC-1, IMP -1, SME-1 R R R R R R R R R R R R - - KPC R R R R R R I/R R R I/R R R + - GES-2/4 (K.pneumoniae) R R R R R R R R R I/R R R Détection des carbapénèmases a- Carbapénèmase de la classe A d Ambler (16) : elles sont rares. Phénotypiquement, on distingue deux groupes : 74

76 - Groupe 1: Présente un haut niveau de résistance à l ATM et une sensibilité presque normale aux C3G. Exemple : NMC-A (Non metallo-carbapénèmase), Sme-1 et Sme-2 (Serratia marcescens), IMI-1 (Imipénème), elles sont d origine chromosomique. Les KPC-1, KPC-2 et KPC-3 (K.pneumoniae carbapénèmase), contrairement aux autres, confèrent un haut niveau de résistance aux C3G avec une résistance croisée entre carbapénèmes (imipénème, méropénème, ertapénème, doripénème). Les gènes KPC sont associés à un transposon porté par un plasmide et se transmettent facilement par conjugaison (20). Ces enzymes sont inhibées par l acide clavulanique et par l acide boronique, il n y a pas de synergie entre carbapénèmes et cloxacilline. Elles ne sont pas inhibées par l EDTA ou l acide dipicolinique et l ATM est hydrolysé par ces enzymes. - Groupe 2 : GES-2 présente une résistance de haut niveau à l imipénème et aux C3G. Méthodes de détection : On peut les détecter par une synergie entre AMC et IMP (8) Cependant les souches productrices de ce type d enzymes sont souvent multirésistantes avec la participation de plusieurs mécanismes de résistance enzymatique ou non. Pour cela, la détermination de la CMI d une carbapénème en présence ou non d acide clavulanique par une méthode de dilution avec des variations de l inoculum sera préférée (1). Test de Hodge modifié (8) 100% de sensibilité et de spécificité pour la mise en évidence des KPC Méthode de référence : PCR et séquençage. b- Carbapénèmase de classe B d Ambler : Métallo-carbapénèmase (1,32) Il s agit d enzymes dépendantes du Zn++ et inhibées par l EDTA, d origine plasmidique (les gènes sont dans des cassettes au sein d intégrons de type 1 sauf pour les gènes de l enzyme SPM-1).Elles ne sont pas inhibées par l acide clavulanique, tazobactam, sulbactam ou par l acide boronique. Les enzymes confèrent la résistance aux pénicillines (la sensibilité à la pipéracilline est variables selon le type d enzyme), aux carbapénèmes, aux C3G et aux céphamycines ; seul l aztréonam n est pas inactivé. Il existe 3 groupes phylogéniquement différents : Le groupe IMP Le groupe VIM 75

77 Méthodes de détection : Inhibition par l EDTA : Déposer 750 µg d EDTA (soit 4 µl d une solution d EDTA 0.5 M ph : 8) sur un disque d imipénème et comparer le diamètre obtenu avec celui d un disque d imipénème seul (33). L EDTA inhibe l enzyme entraînant une augmentation du diamètre d inhibition du disque IPM +EDTA par rapport au disque IPM seul (18). Figure 14 : P. aeruginosa producteur de carbapénèmase de type B. Test de Hodge modifié (8) 100% de sensibilité et de spécificité pour détecter les métallo-carbapénèmases (même technique que pour l enzyme KPC). PCR+ Séquençage Test de Hodge modifié pour détecter les KPC et les métallo carbapénèmases Technique : Souche révélatrice: E.coli ATCC Préparer une suspension bactérienne d E. coli ATCC à 0.5 MF dans 5 ml d eau physiologique. Diluer cet inoculum au physiologique. 1/10 ème (0,5 ml de la suspension de 0,5 MF + 4,5 ml d eau Ensemencer une gélose MH par écouvillonnage, laisser sécher 3 à 5 mn. Déposer au centre un disque d ertapénème 10µg (ou de méropénème) A partir du disque, faire une inoculation en trait avec la souche à tester et avec deux souches de référence (K.pneumoniae ATCC BAA-1705 : carbapénèmase positive) et K.pneumoniae ATCC BAA-1706 : carbapénèmase négative). Incuber à 35 C ±2 C pendant 16 à 24 heures. Interprétation : Après H d incubation, les souches productrices de carbapénèmase de type B vont pousser jusqu au contact du disque d ertapénème ou méropénème - Un test de Hodge modifié est positif quand Escherichia coli ATCC au contact d une souche productrice de carbapénèmase de type B, va pénétrer et croître dans le diamètre d inhibition en donnant un aspect d invagination de la culture. - Un test de Hodge modifié est négatif quand il n y a aucune modification du diamètre d inhibition d Escherichia coli ATCC au contact des souches à étudier (CLSI 2011 M100-S21) 76

78 1 Figure 15 : Test de Hodge modifié (CLSI 2011 M100-S21) 3 2 Un disque d ertapénème ou de méropénème est appliqué au centre d une gélose MH ensemencée par une souche d E.coli ATCC Trois souches sont ensemencées par stries ; 1: K. pneumoniae ATCC BAA-1705 (témoin positif) ; 2: K.pneumoniae ATCC BAA-1706 (témoin négatif) ; 3: Souche testée. La déformation du diamètre à l intersection entre une strie et la culture de E. coli ATCC signe la présence d une hydrolyse des carbapénèmes par la souche testée. La souche testée (n 3) produit une carbapénèmase. Les disques utilisés sont : ertapénème (ERT) ou méropénème (MER). c- Carbapénèmase de classe D (1) Les oxacillinases ayant une activité de carbapénèmase ont été décrites presque uniquement chez Acinetobacter baumannii, plus rarement chez Klebsiella pneumoniae, Enterobacter spp. et Pseudomonas aeruginosa. Les gènes ne sont pas portés par des intégrons. Méthode de Détection : PCR + séquençage : c est la technique de référence. Test de ROSCO. Test de ROSCO Ce schéma illustre la disposition des disques et les distances entre eux pour la détection des carbapénèmases KPC, métallo-β-lactamases et oxacillinases. Abréviations : IM+ED : imipénème+edta ; MER : méropénème ; ERT : ertapénème ; DPA : ac.dipicolinique ; AMC : amoxicilline+clav. : CLOXA : cloxacilline ; BOR : ac. Boronique. Les chiffres représentent la distance entre deux disques (en mm). Figure 16 : Schéma proposé par Rosco pour la détection des carbapénèmases KPC, métallo-β-lactamases et oxacillinases (8) 77

79 Interprétation des tests proposés par Rosco Métallo-β-lactamases : Action positive des agents chélateurs: présence d une zone d inhibition (ou une zone fantôme) entre les disques DPA et les disques méropénème et/ou ertapénème ou entre le disque imipénème-edta et les disques méropénème et/ou ertapénème. Le test de Hodge est positif. KPC (enzymes classe A) : Pas d action des agents chélateurs (pas de zone d inhibition ou fantôme) Présence de synergie entre l ac. boronique et/ou l amoxicilline/ac.clavulanique et les carbapénèmes (une ou plusieurs). Pas de synergie entre la cloxacilline et les carbapénèmes. Le test de Hodge est positif. Oxacillinases (enzymes classe D) Pas d action des agents chélateurs (pas d inhibition). Absence de synergie entre amoxicilline /ac.clavulanique et les carbapénèmes Absence de synergie entre acide boronique/cloxacilline 500 µg et les carbapénèmes. Le test de Hodge positif. AmpC haut niveau + modification / perte de porine Présence de synergie entre la cloxacilline et les carbapénèmes. Le test de Hodge négatif. 78

80 AUTRES BACTERIES Dr N. Benamrouche 79

81 La technique de l antibiogramme n étant pas standardisée pour toutes les espèces bactériennes, nous proposons ci-après un protocole technique consensuel 80

82 Tableau 22 : Liste des antibiotiques à tester pour les autres bactéries Y.. pestis s B.. pertussis s Listeria spp. s Campylobacter spp. s Helicobacter pylori i Brucella spp. s Corynebacterium spp. s Pasteurella ell a spp. s Anaérobies strictes Streptomycine Gentamicine Ciprofloxacine Lévofloxacine Tétracycline a Doxycycline Chloramphenicol Triméthoprime+ sulfaméthoxazole Erythromycine Josamycine Azithromycine Clarithromycine Roxithromycine Ofloxacine O Triméthoprime+ me+ m sulfaméthoxazole Pénicilline P Ampicilline A Gentamicine Chloramphénicol Tétracycline Erythromycine Rifampicine Triméthoprime+ sulfaméthoxazole Ampicilline A Amoxicilline+ Acide clavulanique Céfalotine C a Céfotaxime Streptomycine Gentamicine Kanamycine Tobramycine e Erythromycine Acide nalidixique a Ciprofloxacine Tétracycline Chloramphénicol Erythromycine Ciprofloxacine Streptomycine Gentamicine Tétracycline Doxycycline Triméthoprime+ sulfaméthoxazole Pénicilline P Céfotaxime C Imipénème I Vancomycine Gentamicine e Erythromycine Clindamycine Ciprofloxacine Tétracycline Doxycycline Triméthoprime+ sulfaméthoxazole Pénicilline P Ampicilline A Amoxicilline+ acide clavulanique Céftriaxone Erythromycine Azithromycine Lévofloxacine Tétracycline Doxycycline Chloramphénicol o l Triméthoprime+ sulfaméthoxazole Amoxicilline Amoxicilline+ acide clavulanique Ticarcilline T Ticarcilline+ acide clavulanique Céfotaxime Imipénème I Clindamycine Pristinamycine Ofloxacine O b Vancomycine Rifampicine Chloramphénicol Métronidazole Kanamycine a Colistine C a a. Aide à l identification b. Pour Propionibacterium spp. et quelques souches de Peptostreptococcus spp. isolées d infections sévères (osseuse ou cérébrale) 81

83 1. Yersinia pestis : Précautions à prendre au niveau du laboratoire: - Manipulation obligatoire des prélèvements sous hotte avec filtration d'air (hotte à flux laminaire vertical). - Le manipulateur doit porter des vêtements de protection : lunettes de protection, masque respiratoire chirurgical, blouse, double gants. - Préparation du plateau de travail: pipettes pasteur, anses de platine, récipient en verre autoclavable contenant de l'eau de javel, boîtes de milieux de culture préalablement séchées, boîte de Petri vide (servira au transport des lames de Gram ou de bleu), lames, pinces, poires, coton imbibé d'alcool à 70, stérilisateur d'anses. - Le travail doit se faire dans le calme, les gestes doivent êtres lents et le manipulateur doit être concentré sur son travail. Détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) : a- Milieu de culture : Mueller-Hinton liquide ajusté en cations (Ca ++, Mg ++ ) b- Contrôle de qualité : E coli ATCC est utilisée comme souche de référence pour le contrôle de qualité. c- Gamme de dilution : - Dissoudre mg de poudre titrée d'antibiotique dans 10 ml du solvant correspondant. - Répartir dans des tubes stériles le MH liquide ajusté en cations à raison de 0.25 ml/tube (macro-méthode), ou bien en microplaque à fond rond à raison de 25 µl/cupule. Dilutions des antibiotiques pour les CMI en milieu liquide (voir tableau N 10) d- Inoculation des tubes ou des cupules et inoculum : - A partir d'une culture pure de 48h, préparer une suspension de la souche à étudier dans 5 à 10 ml d'eau physiologique d'une densité équivalente à 0.5 Mc Farland. - Déposer 0.05 ml (50µl) par tube, ou ml (5 µl) par cupule de cette suspension bactérienne. - Pour chaque série, réaliser un témoin sans antibiotique en déposant dans un tube : l inoculum (0,05ml), le solvant (0,25ml) et le MH liquide (0,70ml). e- Incubation : Incuber pendant 24h à 35 ± 2 C, ou 48h si la culture n'est pas apparente dans le tube (ou cupule) témoin. f- Lecture : (table de lecture 14) La CMI de chaque antibiotique correspond à la première cupule sans culture apparente (visuelle). 82

84 2. Bordetella pertussis : 2.1- Méthode de diffusion des disques : a- Milieu : - Gélose MH additionnée de 10% de sang de cheval défibriné, coulée sur une épaisseur de 4mm. - Les géloses sont séchées avant l'emploi. b- Inoculum : - A partir d'une culture de 36h à 48h, sur milieu d'isolement, racler à l'aide d'une anse de platine quelques colonies bien isolées. - Décharger l'anse dans 5ml de Mueller-Hinton liquide. - Bien homogénéiser la suspension bactérienne, son opacité doit être équivalente à 0.5 Mc Farland ou à une D O de 0.08 à 0.10 lue à 625 nm. - L'inoculum peut être ajusté en ajoutant, soit de la culture s'il est trop faible, soit du Mueller-Hinton liquide, s'il est trop fort. c- Ensemencement : Il se fait par écouvillonnage selon la fiche technique n 1. d- Application des disques d'antibiotiques : - Les disques d'antibiotiques doivent être suffisamment espacés (grandes zones d inhibition). e- Lecture : - Mesurer avec précision, les diamètres des zones d'inhibition à l'aide d'un pied à coulisse métallique, boite ouverte et bien éclairée. - Des souches de B. pertussis résistantes à l'erythromycine sont décrites, d'où la nécessité de déterminer la CMI de l'erythromycine si on observe des colonies à l'intérieur de la zone d'inhibition (éviter les E-test). f- Contrôle de qualité : La souche de référence utilisée pour le contrôle de qualité est B. pertussis ATCC Détermination de la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) : CMI en milieu solide ou par E- test Dissoudre 16 mg de poudre d antibiotique dans le diluant correspondant (le diluant utilisé dépend de la nature de l antibiotique). 83

85 Préparation de la gamme d antibiotiques : Solution mère d antibiotiques Solution mère (ml) Eau distillée (ml) Concentration en tubes (µg/ml) Concentration en boîtes (µg/ml) 1600 µg/ml 1 ml 0,5 ml 9 ml 9,5 ml Changer de pipette 80µg/mL 2 ml 1 ml 0,5 ml 0,5 ml 2 ml 3 ml 3,5 ml 7,5 ml ,5 Une seule pipette 2 ml 2 ml 2,5 0,25 Changer de pipette 5 µg /ml 1 ml 0,5 ml 3 ml 3,5 ml 1,25 0,63 0,125 0,063 0,5 ml 7,5 ml 0,32 0,032 Changer de pipette 0,32µg/mL 2 ml 2 ml 0,16 0,016 Répartir 2 ml de chaque concentration d antibiotique en allant de la plus faible à la plus forte concentration dans des boîtes de Petri portant le numéro de la concentration correspondante. Ajouter dans chaque boîte 18 ml de milieu MH additionné de 10% de sang de cheval, homogénéiser par des mouvements rotatifs et laisser se solidifier, une boîte témoin sans antibiotique est ajoutée. a- Inoculum : 0.5 Mc Farland, dilué au 1/10. b- Application : La concentration finale par spot est de 10 4 CFU (anse, micropipette ou appareil de Steers) c- Incubation : 24 à 36 h à 35 C d- Contrôle de qualité : La souche de référence utilisée pour le contrôle de qualité est B. pertussis ATCC 9797 et S.aureus ATCC

86 Tableau 23 : CMI des macrolides, ofloxacine et triméthoprime+sulfaméthoxazole pour B. pertussis et B. parapertussis (9, 12, 34) Antibiotiques Concentrations critiques µg/ml B. pertussis B. parapertussis CMI 90 Concentrations critiques µg/ml CMI 90 Erythromycine Josamycine Azithromycine Clarithromycine Roxithromycine Ofloxacine Sulfaméthoxazole+triméthoprime Listeria spp.: a- Milieu : Gélose Mueller Hinton, additionnée de 5% de sang de mouton. b- Inoculum : - Il est à 0,5 Mc Farland. - Souches de références : S. pneumoniae ATCC Listeria monocytogenes ATCC c- Ensemencement : Se fait par écouvillonnage. d- Incubation : - 20 à 24h à 35 C en atmosphère ordinaire. - Listeria monocytogenes est naturellement résistante aux céphalosporines. - Les antibiotiques à tester sont : pénicilline, ampicilline, gentamicine, chloramphénicol, tétracycline, triméthoprime/sulfaméthoxazole, érythromycine, rifampicine - Le CLSI préconise pour l ampicilline, la pénicilline et le triméthoprime/sulfaméthoxazole la détermination des concentrations minimales inhibitrices par la méthode de micro dilution en milieu liquide. - Bouillon Mueller Hinton + 2,5 à 5 % de sang de cheval hémolysé incubé à 35 C ; pendant 20 à 24 h. L interprétation des résultats est : Ampicilline 2µg/ml : souche sensible. Pénicilline 2µg/ml : souche sensible. Triméthoprime+sulfaméthoxazole e- Lecture : Interprétative 0, 5/9, 5 µg/ml : souche sensible 1/19-2/38 µg/ml : souche intermédiaire 4/76 µg/ml : souche résistante 85

87 4. Campylobacter spp. : La méthode de référence préconisée par le CLSI est la détermination de la concentration minimale inhibitrice par la méthode de micro dilution en milieu liquide (pour l érythromycine, ciprofloxacine, tétracycline et doxycycline), cependant la réalisation de cette technique est lourde en pratique. De ce fait, la technique par diffusion préconisée par le CA-SFM (2011) est recommandée : a- Milieu : Gélose MH additionnée de 5% de sang de mouton ou de cheval b- Inoculum : colonies en suspension à 0,5 Mc Farland dilué au 1/10 c- Incubation : 35 à 37 C pendant 18-24h d- Atmosphère : microaérophile ou anaérobiose selon la croissance optimale des souches e- Contrôle qualité : Souche de référence, Staphylococcus aureus ATCC incubée à la température de 35 à 37 C pendant 16 à 18h en atmosphère ordinaire f- Lecture : Table de lecture Helicobacter pylori : Le CLSI préconise la CMI en milieu liquide comme méthode de référence, celle-ci est validée seulement pour une molécule antibiotique, la clarithromycine. La technique par diffusion est préconisée par le CA-SFM (2011) a- Milieu : Gélose MH additionnée de 10% de sang de cheval b- Inoculum : colonies en suspension à 3 Mc Farland, vérifier l absence de formes coccoides (< 10 %) c- Incubation : C pendant 72h et 4 jours pour détecter les doubles populations d- Atmosphère : microaérophilie e- Lecture : Table de lecture Brucella spp.: La brucellose appartient au groupe à risque III considéré comme une menace pour le personnel de laboratoire. Les causes essentielles de contamination au laboratoire sont : - L habitude des microbiologistes à sentir les cultures bactériennes (sniffing). - La génération d aérosols en grand nombre, lors des manipulations (préparation des suspensions bactériennes pour antibiogramme). 86

88 Précautions au laboratoire : La culture de Brucella est très contagieuse par voie aérienne, conjonctivale et cutanéo muqueuse. - La manipulation de la culture sous hotte à flux laminaire vertical (type Biological Safety Cabinet class III) - La présence sous la hotte d un incinérateur d anse est indispensable. - Le manipulateur doit être protégé (port de blouse, masque, lunettes et gants). La technique de l antibiogramme ne se pratique pas pour les brucelles en raison des risques de contamination. Détermination des CMI par technique des E- tests: a- Milieu : MH +sang cuit b- Inoculum : Faire une suspension directe à 0,5 McFarland dans de l eau physiologique (Ne pas générer d aérosols lors de la préparation de la suspension) c- Technique : - Tremper un écouvillon stérile dans la suspension bactérienne. - L essorer en le pressant fermement (en le tournant) sur la paroi interne du tube, afin de le décharger au maximum. - Frotter l écouvillon sur la totalité de la surface gélosée, sèche, de haut en bas, en stries serrées. - Répéter l opération deux fois, en tournant la boite de 60 à chaque fois sans oublier de faire pivoter l écouvillon sur lui-même. Finir l ensemencement en passant l écouvillon sur la périphérie de la gélose. - Dans le cas ou l on ensemence plusieurs boites de Petri, il faut recharger l écouvillon à chaque fois. d- Incubation : 35 +/- 2 C pendant 48 H (sous CO 2 pour certains biovars de B. abortus) e- Contrôle de qualité : Il faut en parallèle ensemencer dans les mêmes conditions des souches de référence : Escherichia coli ATCC Streptococcus pneumoniae ATCC f- Interprétation : Voir la table de lecture

89 Tableau 24 : Valeurs limites des CMI des souches de référence utilisées pour le contrôle de qualité des CMI de Brucella spp. Antibiotiques testés E.coli ATCC Heures S.pneumoniae ATCC Heures Streptomycine Gentamicine Tétracycline 0,5-4 0,06-0,5 Doxycycline 1-4 0,03-0,25 Triméthoprime+sulfaméthoxazole - 0,5 / 9,5 2 / Corynebacterium spp. : La technique de référence préconisée par le CLSI est la méthode de micro dilution en milieu liquide, toutefois la technique du E-test présente une bonne corrélation avec la méthode de référence. Détermination des CMI par technique des E-tests a- Milieu : Gélose MH coulée sur une épaisseur de 4 mm. Les géloses sont séchées avant l'emploi. b- Inoculum : Colonies en suspension équivalent à 0,5 Mc Farland. c- Incubation : 24 à 48 h à 35 C ; atmosphère ordinaire. d- Contrôle de qualité : Souches de référence : Streptococcus pneumoniae ATCC e- Lecture : Escherichia coli ATCC pour la gentamicine. Les résistances peuvent être reportées à 24h. Les isolats montrant des sensibilités aux β- lactamines doivent être ré-incubés et les résultats lus à 48h. f-interprétation : Voir la table de lecture

90 8. Pasteurella spp. a- Milieu : Gélose MH additionné de 5% de sang de mouton. b- Inoculum : Colonies en suspension à 0,5 Mc Farland. c- Incubation : 35 C en atmosphère ordinaire en 18 à 24h. d- Contrôle de qualité : Souches de référence : Streptococcus pneumoniae ATCC Escherichia coli ATCC (pour la combinaison β-lactamine/inhibiteur de β-lactamase). Staphylococcus aureus ATCC (pour amoxicilline+acide clavulanique et doxycycline). e- Interprétation : Voir la table de lecture 20 Certaines souches requièrent une incubation sous 5% de CO 2. Ces souches doivent être testées uniquement par la méthode de micro dilution en milieu liquide. 9. Bactéries anaérobies stricts : Sensibilités et résistances aux antibiotiques : - Les tétracyclines, macrolides et apparentés sont de moins en moins actifs. - Bacteroïdes du groupe fragilis et Prevotella sont sécréteurs de céphalosporinases inactivant la pénicilline G, les aminopénicillines, les céphalosporines de première et troisième générations. - Fusobacterium est sécréteur d'une β-lactamase inactivant pénicilline G, les aminopénicillines, les carboxypénicillines et les uréido-pénicillines. - Porphyromonas est sécréteur de pénicillinase. - Clostridium difficile (responsable de colites pseudomembraneuses et de diarrhées) des souches isolées à l'institut Pasteur d'algérie sont résistantes à l'imipénème. - Les bacilles à Gram négatif, les bacilles à Gram positif sporulés, les cocci à Gram positif et négatif sont toujours sensibles aux 5-Nitro-imidazolés. - Les bacilles à Gram positif sporulés (Clostridium) sont sensibles à la pénicilline G (excepté C. ramosum, C. clostridioforme et C. butyricum). - Les cocci à Gram positif sont sensibles aux ß-lactamines. - Le traitement de choix des infections à bacilles Gram négatif (Bacteroïdes, Prevotella, Porphyromonas et Fusobacterium) est un 5-Nitro-imidazolé. - Le traitement de première intention des infections dues aux bacilles à Gram positif sporulés, Clostridium (excepté C. ramosum, C. clostridioforme et C. butyricum) est la pénicilline G. 89

91 - Le traitement des infections graves à C. difficile est soit vancomycine, soit les 5-Nitro - imidazolés. Toutes ces bactéries peuvent être à l'origine de n'importe quel type d'infection localisée et/ou généralisée. Les bactéries anaérobies sont sensibles à l'oxygène moléculaire et nécessitent, pour leur isolement et identification, que le prélèvement soit réalisé et transporté dans des conditions d'anaérobiose. L'institut Pasteur d'algérie (service Anaérobies) prépare des milieux de transport et de conservation permettant de maintenir les germes aérobies et anaérobies, présents dans un prélèvement, vivants et sans que leur taux de départ ne soit modifié. Ce milieu permet également de conserver les germes anaérobies isolés dans les différents laboratoires nationaux et de les acheminer vers le laboratoire national de référence des anaérobies pour une identification complète. La méthode de référence préconisée par le CLSI pour l'étude de la sensibilité aux antibiotiques des bactéries anaérobies est la méthode de dilution, cependant celle-ci est difficile à mettre en œuvre. La technique par diffusion préconisée par le CA- SFM (2011) est recommandée : a- Milieu : Gélose Wilkins Chalgren + 5% de sang ou gélose Brucella + vitamine K1 (1mg/L) + 5% de sang b- Inoculum : colonies en suspension en bouillon Brucella ou Shaedler à 1 Mc Farland, les bouillons doivent être régénérés avant emploi Pour certaines espèces à croissance lente (> 72h), suspension en bouillon Brucella ou Shaedler à 0,5 Mc Farland à partir d une culture en bouillon c- Incubation : 35 à 37 C pendant 48h si la croissance est suffisante, pour la clindamycine, le test doit être lu impérativement après 48h d incubation d- Atmosphère : anaérobiose MILIEU DE TRANSPORT ET DE CONSERVATION DES GERMES - Le milieu est présenté en tube à vis gélosé ou semi gélosé d'une contenance de 12 ml, accompagné d'un écouvillon stérile. - Il est incolore et doit le rester après introduction du prélèvement ou de la souche à tester. - Il contient deux réducteurs (thioglycolate de sodium et cystéine) et un indicateur d'oxydoréduction (résazurine) qui est incolore lorsque le milieu est réduit, rose ou bleu lorsque le milieu est oxydé. - Si ce milieu vire au rose ou au bleu, il doit être régénéré par ébullition pendant 20 minutes avant de procéder à l'inoculation du prélèvement ou de la souche anaérobie à tester. Les souches anaérobies peuvent y être stockées pendant trois semaines au maximum, à l'abri de la lumière. 90

92 METHODE D'UTILISATION a. Transport de prélèvements : Si le pus est abondant : - Prélever à l'aide d'une seringue stérile montée d'une aiguille stérile, en évitant de faire des bulles. - Dévisser le bouchon du tube, transvaser le pus prélevé, enfoncer profondément dans la gélose l'écouvillon stérile afin que le pus y pénètre puis revisser rapidement le bouchon après avoir cassé la partie supérieure de l'écouvillon. Si le pus n'est pas abondant : - Prélever à l'aide d'un écouvillon stérile le plus profondément possible. - Dévisser le bouchon du milieu de transport, enfoncer profondément dans la gélose l'écouvillon chargé de pus, puis revisser rapidement le bouchon après avoir cassé la partie supérieure de l'écouvillon. b. Transport des souches anaérobies à tester. - Isoler la souche sur milieu Columbia au sang préparé extemporanément. - Incuber en anaérobiose 48 h à 5 jours selon l'espèce : 48h pour Clostridium spp., Bacteroïdes du groupe fragilis, Fusobacterium spp. 72h pour Peptostreptococcus spp., Propionibacterium spp., Actinomyces spp. 05 jours pour Prevotella spp., Porphyromonas spp. - Racler toute la surface de la boîte à l'aide d'un écouvillon stérile. - Dévisser le bouchon du milieu de transport et y enfoncer profondément l'écouvillon chargé. - Casser la partie supérieure de l'écouvillon et revisser le bouchon rapidement. - Garder le milieu de transport ensemencé à l'abri de la lumière à température ambiante, si l'envoi de la souche est retardé. c. Fiche de renseignements : L'envoi du milieu de transport vers le laboratoire national de référence des anaérobies de l'institut Pasteur d'algérie doit être accompagné d'une fiche de renseignements dûment remplie (cf. fiche de renseignements). 91

93 SERVICE DES ANAEROBIES INSTITUT PASTEUR D ALGERIE FICHE DE RENSEIGNEMENTS NOM :.. N : PRENOMS : Opérateur : AGE :. SEXE :. DATE DE PRELEVEMENT : /./ 2005 ADRESSE/REGION :. LIEU D HOSPITALISATION :. NATURE ET SIEGE DU PRELEVEMENT :. RENSEIGNEMENTS CLINIQUES :... MALADIES ASSOCIEES : ANTIBIOTIQUES REÇUS : DUREE DU TRAITEMENT :. AUTRES EXAMENS EFFECTUES :.. MILIEU DE TRANSPORT (MODE OPERATOIRE) 1) La zone bleue ou rose qui indique l oxygénation du milieu ne doit pas dépasser 1 cm. Au delà de 1 cm régénérer le milieu de transport par ébullition pendant 20 mn, laisser refroidir. 2) Dévisser le tube contenant le milieu de transport, enfoncer rapidement le coton tige dans le milieu à 0,5 cm du fond du tube et casser la partie supérieure de l écouvillon (bouchon rouge) puis revisser aussitôt. 3) Garder à température ambiante et acheminer vers le centre de référence des Anaérobies dans les plus brefs délais. 92

94 Tableau 25 : Pourcentage de résistance des Bacteroïdes du groupe fragilis isolés en Antibiotiques Concentrations critiques : µg/ml (interpretation prospectus E-test) Nombre de souches résistantes % de résistance Ampicilline (CA-SFM) 0,5 - >2 31/ Pipéracilline - >128 15/31 25 Ticarcilline 32 - >64 19/31 60 Céfoxitine 16 - >64 11/31 35 Céfotaxime 16 - >64 28/31 90 Amoxicilline+acide clavulanique 4/2 - >16/2 1/31 5 Imipénème 4 - >16 0/31 0 Clindamycine 2 - >8 15/31 25 Tétracycline 4 - >16 20/31 65 Chloramphénicol 8 - >32 1/31 5 Métronidazole 8 - >32 0/31 0 RECHERCHE DE LA CEPHALOSPORINASE. Cette recherche doit être réalisée pour toutes les souches de Bacteroïdes du groupe fragilis et de Prevotella par la technique acidimétrique suivante : - Dissoudre 1 million d unités de céfotaxime dans 4,5 ml d eau distillée stérile. - Ajouter 0,5 ml d une solution aqueuse de rouge phénol à 0,5 %. - Ajuster à ph 8,5 à l aide d une solution de soude 1N (obtention d une couleur pourpre).(ce mélange peut être conservé 08 jours à -80 C). - Préparer une suspension dense de la souche à tester dans 0,5 ml d eau distillée stérile. - Ajouter 03 gouttes du mélange. - Inclure, en parallèle, un témoin négatif constitué de 0,5 ml d une suspension dense de Clostridium perfringens CIP en eau distillée stérile additionnée de 3 gouttes du mélange. - La réaction est négative si la couleur reste pourpre. - La réaction positive montre un virage du pourpre au jaune : dans ce cas, répondre résistant pour les aminopénicillines, les carboxypénicillines, les céphalosporines 1 ère et 3 ème génération. 93

95 94

96 AUTOMATISATION DES TESTS DE SENSIBILITE AUX ANTIBIOTIQUES Dr N. Benamrouche 95

97 96

98 L introduction de l automatisation des tests de sensibilité aux antibiotiques permet de répondre aux besoins croissants des laboratoires hospitaliers devant la charge de travail en offrant une meilleure gestion du temps avec des systèmes qui permettent une identification et un antibiogramme rapides et un rendu de résultats en CMI pour les tests de sensibilité en se basant sur la méthode de CMI en milieu liquide. En Algérie, certains laboratoires hospitaliers ont introduit ces automates dans la pratique courante de diagnostic. Devant cette situation, et dans un but de standardisation*. Nous avons décidé d intégrer dans cette nouvelle édition, un chapitre spécifique à l antibiogramme automatisé. Les tableaux rapportent un descriptif des différents automates existant sur le marché à savoir : Vitek2 Compact, Phoenix et Microscan WalkAway SI, de chaque automate comparativement à la méthode manuelle classique et les performances ainsi que les limites de chaque appareil. Un choix préalable des listes antibiotiques a été fait concernant chaque automate en se rapprochant le plus possible des listes standardisées du réseau utilisées dans la méthode manuelle classique et basées sur la liste des antibiotiques de la nomenclature algérienne. Cette sélection a concerné les antibiotiques utilisés en médecine humaine et dans la mesure du possible (quand le fournisseur proposait cette recherche) en médecine vétérinaire. * : Un séminaire-atelier a été organisé sur ce thème par le réseau AARN à l IPA (annexe Sidi Fredj) les 9 et 10 février

99 Tableau 26: Automates permettant l identification des germes et leur antibiogramme Fabricant/ Représentant Microscan Walkaway SI Vitek 2 Compact Phoenix P Siemens/Lapropharm Plus BioMérieux/Filiale BioMérieux Algérie Becton Dickinson/IMD Principe P CMI en milieu liquide CMI en milieu liquide CMI en milieu liquide Normes CLSI CLSI CLSI Version du logiciel Expert E Groupes de germes ciblés c Description Résultats en CMI Mises à jour régulières Mises à jour régulières Mises à jour régulières Entérobactéries BGN non fermentaires Staphylocoques Streptocoques B et entérocoques Pneumocoques et streptocoques (autres que streptocoques B) Haemophilus spp. CMI mesurées Valeurs des CMI ne dépendent pas de l identification Plaques à cupules Ajouts de réactifs biochimiques au niveau de l appareil Consommables : système d inoculation, milieux pour antibiogrammes pneumocoque et Haemophilus spp. Entérobactéries BGN non fermentaires Staphylocoques Streptocoques B et entérocoques Pneumocoques Résultats en CMI CMI calculées Valeurs des CMI dépendent de l identification Cartes à micro-cupules Inoculation rapide Pas d ajouts de réactifs Entérobactéries BGN non fermentaires Staphylocoques Entérocoques Streptocoques Résultats en CMI CMI mesurées Valeurs des CMI ne dépendent pas de l identification Galeries à puits Inoculation rapide Pas d ajouts de réactifs Maintenance Equipe technique installée en Algérie Equipe technique installée en Algérie Equipe technique non installée en Algérie 98

100 En médecine humaine Tableau 27: Listes des antibiotiques testés par Microscan Walkaway SI par groupe de germes Liste d antibiotiques Antibiotiques appartenant aux listes standardisées mais ne figurant pas sur les plaques** Entérobactéries NEG COMBO 53 Ampicilline Amoxicilline+Acide clavulanique Pipéracilline+Tazobactam Amikacine Tobramycine Aztréonam Céfazoline Céfepime Céfotaxime Céfoxitine Ceftazidime Céfuroxime Céfalotine Ciprofloxacine Ertapénème Céfotaxime+Acide clavulanique (ESBLTest) Ceftazidime+Acide clavulanique (ESBL Test) Gentamicine Imipénème Acide nalidixique Tigécycline Triméthoprime+Sulfaméthoxazole Chloramphénicol Nitrofurantoine Fosfomycine Colistine BGN non fermentants NEG COMBO 54 Amikacine Ticarcilline Ampicilline+Sulbactam Pipéracilline+Tazobactam Aztréonam Céfépime Ceftazidime Ciprofloxacine Colistine Fosfomycine Gentamicine Tobramycine Imipénème Lévofloxacine Méropénème Minocycline Tigécycline Triméthoprime+Sulfaméthoxazole Pipéracilline Ticarcilline+Acide clavulanique Nétilmicine Doxycycline Staphylococcus spp. Streptocoques B Enterococcus spp. POS COMBO 32 Ampicilline Céfoxitine screen Ciprofloxacine Clindamycine Daptomycine Erythromycine Fosfomycine Gentamicine Gentamicine synergy screen Inductible clindamycine test Lévofloxacine Linézolide Nitrofurantoine Oxacilline Pénicilline Streptomycine synergy screen Synercid Teicoplanine Tétracycline Vancomycine Triméthoprime+Sulfaméthoxazole Amikacine Kanamycine Ofloxacine Chloramphénicol Pristinamycine Rifampicine Acide fusidique Céfotaxime Streptococcus spp. (excepté Streptocoques B) Haemophilus spp* MICroSTREP pl u s 1 Ampicilline Amoxicilline+Acide clavulanique Azithromycine Céfaclor Céfépime Céfotaxime Ceftriaxone Céfuroxime Chloramphénicol Erythromycine Clindamycine Lévofloxacine Gatifloxacine Méropénème Pénicilline Tétracycline Triméthoprime+Sulfaméthoxazole Vancomycine Amoxicilline Imipénème Gentamicine Rifampicine Pristinamycine Fosfomycine *seulement lecture visuelle de la plaque pour Haemophilu spp. **il est recommandé de tester ces molécules par la méthode classique 99

101 Tableau 28 Listes des antibiotiques testés par Vitek 2 Compact par groupe de germes Liste d antibiotiques Antibiotiques appartenant aux listes standardisées mais ne figurant pas sur les cartes** Entérobactéries AST-N103 Ampicilline Amoxicilline+Acide clavulanique Ticarcilline Pipéracilline+Tazobactam Céfalotine Céfoxtine Céfotaxime Ceftazidime Imipénème Ertapénème Gentamicine Amikacine Tobramycine Nétilimicine Acide nalidixique Norfloxacine Ofloxacine Ciprofloxacine Nitrofurantoine Triméthoprime+ Sulfaméthoxazole Céfazoline Colistine Chloramphénicol Fosfomycine BGN non fermentants AST-N093 Ticarcilline Ticarcilline+Acide clavulanique Pipéracilline Pipéracilline+Tazo-bactam Ceftazidime Céfepime Aztréonam Imipénème Méropénème Gentamicine Amikacine Tobramycine Isépamicine Minocycline Péfloxacine Ciprofloxacine Rifampicine Colistine Triméthoprime+ Sulfaméthoxazole Nétilmicine Fosfomycine Doxycycline Staphylococcus spp. AST-P581 Benzylpénicilline Céfoxitine (test) Oxacilline (CMI) Erythromycine Lincomycine Pristinamycine Résistance inductible à la clindamycine (test) Kanamycine Gentamicine Tobramycine Minocycline Tétracycline Ofloxacine Nitrofurantoine Acide fusidique Fosfomycine Rifampicine Triméthoprime+ Sulfaméthoxazole Vancomycine Teicoplanine Linézolide Amikacine Clindamycine Chloramphénicol Streptocoques B Enterococcus spp. AST-P606 Benzylpénicilline Ampicilline Erythromycine Clindamycine Quinupristine/Dalfopristine Lévofloxacine Moxifloxacine Tétracycline Nitrofurantoine Triméthoprime+ Sulfaméthoxazole Chloramphénicol Vancomycine Teicoplanine Linézolide Kanamycine HC Gentamicine HC Streptomycine HC Céfotaxime Pristinamycine Rifampicine *l utilisation de cette carte est optionnelle **il est recommandé de tester ces molécules par méthode classique S.pneumoniae AST-P576 Benzylpénicilline Amoxicilline Céfotaxime Ceftriaxone Imipénème Ofloxacine Sparfloxacine Lévofloxacine Télithromycine Moxifloxacine Erythromycine Pristinamycine Quinupristine/Dalfopristine Tétracycline Chloramphénicol Triméthoprime+ Sulfaméthoxazole Rifampicine Vancomycine Linézolide Entérobactéries AST-EXN8* (utilisée de paire avec AST-N103) Ampicilline+Sulbactam Ticarcilline+Acide clavulanique Pipéracilline Céfuroxime Céftriaxone Céfepime Céfixime ESBL confirm Aztréonam Meropénème Lévofloxacine Moxifloxacine Minocycline Tétracycline Tigécycline Chloramphénicol Triméthoprime Colistine Fosfomycine Céfazoline Fosfomycine 100

102 Tableau 29: Listes des antibiotiques testés par Phoenix par groupe de germes Liste d antibiotiques Antibiotiques appartenant aux listes standardisées mais ne figurant pas sur les panels* BGN fermentants NMIC/ID--69 Ampicilline Ticarcilline Pipéracilline Amoxicilline+Acide clavulanique Pipéracilline+Tazobactam Céfalotine Céfoxitine Céfotaxime Ceftazidime Céfépime Imipénème Aztréonam Amikacine Tobramycine Gentamicine Norfloxacine Ciprofloxacine Triméthoprime+ Sulfaméthoxazole Céfazoline Chloramphénicol Colistine Nitrofurantoine Acide nalidixique Fosfomycine BGN non fermentants NMIC/ID--68 Ticarcilline Ticarcilline+Acide clavulanique Pipéracilline Pipéracilline+Tazobactam Cefsulodine Ceftazidime Céfotaxime Céfépime Imipénème Méropénème Aztréonam Amikacine Gentamicine Tobramycine Ciprofloxacine Colistine Fosfomycine Nétilmicine Doxycycline Triméthoprime+ Sulfaméthoxazole Rifampicine Staphylococcu spp. PMIC/ID-60 Pénicilline Oxacilline Céfoxitine Moxalactam Kanamycine Tobramycine Gentamicine Erythromycine Lincomycine Pristinamycine Rifampicine Acide fusidique Tétracycline Lévofloxacine Linézolide Vancomycine Teicoplanine Daptomycine Triméthoprime+ Sulfaméthoxazole Fosfomycine Amikacine Clindamycine Ofloxacine Chloramphénicol *il est recommandé de tester ces molécules par méthode classique Enterococcus spp. PMIC/ID-61 Ampicilline Gentamicine HN Streptomycine HN Erythromycine Lincomycine Clindamycine Pristinamycine Dalfo-quinupristine Lévofloxacine Moxifloxacine Ciprofloxacine Linézolide Tétracycline Nitrofurantoine Daptomycine Teicoplanine Vancomycine Chloramphénicol Triméthoprime+ Sulfaméthoxazole Streptococcus spp. SMIC/ID-9 Pénicilline Amoxicilline Céfotaxime Céfépime Méropénème Gentamicine HC Erythromycine Clindamycine Pristinamycine Moxifloxacine Lévofloxacine Télithromycine Chloramphénicol Teicoplanine Vancomycine Tétracycline Triméthoprime+ Sulfaméthoxazole Linézolide Ampicilline Imipénème Rifampicine Fosfomycine 101

103 En médecine vétérinaire Tableau 30: Liste des antibiotiques testés par Vitek2 compact Liste d antibiotiques Ampicilline Ampicilline/sulbactam Benzylpénicilline Céfazoline Céfoxitine screen Chloramphénicol Clindamycine Enrofloxacine Erythromycine Acide fusidique Gentamicine Gentamicine HN Imipénème Résistance inductible à la clindamycine Kanamycine Marbofloxacine Mupirocine Nitrofurantoine Oxacilline Rifampicine Tétracycline Triméthoprime+sulfaméthoxazole Vancomycine AST -GP69* AST-GN38* Amikacine Amoxicilline/acide clavulanique Ampicilline Céfalexine Céftiofur Cefpirome Cefpodoxime Chloramphénicol Enrofloxacine Test BLSE Gentamicine Imipénème Marbofloxacine Nitrofurantoine Pipéracilline Polymyxine Rifampicine Tétracycline Tobramycine Triméthoprime+sulfaméthoxazole * Antibiotiques utilisés en médecine vétérinaire en Algérie mais ne figurant pas sur la liste des cartes : céfalotine, néomycine, spiramycine, tilmicosine, norfloxacine, acide nalidixique, acide oxolinique, fluméquine, colistine 102

104 Tableau 31: Liste des groupes de germes identifiés en fonction des automates Germes Microscan Walkaway SI Vitek 2 Compact Phoenix NID PID HNID ANAID YSTID Vitek 2 GN Vitek 2 GP Vitek 2 NH Vitek 2 ANC Vitek 2 BCL Vitek 2 YST NID PID Entérobactéries Non-Entérobactéries X X X X X X Staphylococcus Enterococcus Streptococcus Listeria Gardnerella Corynebacterium Bacillus X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X Neisseria Haemophilus Campylobacter HACCEK X X X X X X Anaérobies X X Levures X X HACCEK : Haemophilus, Actinobacillus, Capnocytophaga, Cardiobacterium, Eikenella et Kingella 103

105 Tableau 32 : Souches de référence pour le contrôle de qualité interne (suivant les recommandations du fabricant) en fonction des automates Entérobactéries BGN non fermentants Staphylococcus spp. Streptocoques B Enterococcus spp. Streptococcus spp. (excepté Streptocoques B) Haemophilus spp. Microscan Walkaway SI NEG COMBO 53 NEG N E COMBO C 54 5 POS COMBO 32 E. coli ATCC P. aeruginosa ATCC S. aureus ATCC E. faecalis ATCC MICroSTREP plus1 S. pneumoniae ATCC H. influenzae ATCC Entérobactéries BGN non fermentants Staphylococcus spp. Streptocoques B Enterococcus spp. Streptococcus spp. (excepté Streptocoques B) Vitek 2 Compact AST-N103 S 3 E. coli ATCC P. aeruginosa ATCC E. coli ATCC (IBL) AST-N093 S 3 E. coli ATCC P. aeruginosa ATCC E. coli ATCC (IBL) AST-P581 S 1 E. faecalis ATCC S. aureus ATCC S. aureus ATCC-1026 (cefoxitin screen) S. aureus ATCC BAA-977 (inductible clindamycine resistance) S. aureus ATCC BAA-977 (inductible clindamycine resistance) AST-P606 S 6 E. faecalis ATCC S. aureus ATCC E. faecalis ATCC (Gentamicine HC, Streptomycine HC) AST-P576 S 6 S. pneumoniae ATCC BGN fermentants BGN non fermentants Staphylococcus spp. Enterococcus spp. Streptococcus spp. Phoenix NMIC/ID-69 N E. coli ATCC E. coli ATCC (IBL) K. pneumoniae ATCC NMIC/ID-68 N P. aeruginosa ATCC E. coli ATCC (IBL) K. pneumoniae ATCC PMIC/ID-60 P S. aureus ATCC S. aureus ATCC (Nitrocefin test) PMIC/ID-61 E. faecalis ATCC E. faecalis ATCC (Gentamicine HC, Streptomycine HC) S. aureus ATCC (Nitrocefin test) SMIC/ID-9 S. pneumoniae ATCC

106 Tableau 33 : Liste des tests utilisés en fonction des automates Automates Tests Utilisation Microscan Walkaway SI/ Plaques Vitek 2 Compact/Cartes NID (Negative IDentification) PID (Positive ID) HNID (Haemophilus Neisseria ID) ANAID (ANAerobi ID) YSTID (YeaST ID) NEG COMBO 53 (Negative COMBO) NEG COMBO 54 POS COMBO 32 (Positive COMBO) MICroSTREP plus1 (Minimal Inhibitory Concentration STREPtococcus plus 1) Vitek 2 GN (Gram Negative) Vitek 2 GP (Gram Positive) Vitek 2 NH (Neisseria Haemophilus) Vitek 2 ANC (ANaerobi Corynebacter i um ) Vitek 2 BCL (BaCiLlus) Vitek 2 YST (YeaST) Identification des bactéries à Gram négatif Identification des bactéries à Gram positif Identification d Haemophilus spp. et Neisseria spp. Identification des anaérobies Identification des levures Antibiogramme/identification combinée des entérobactéries Antibiogramme/identification combinée des BGN non fermentants Antibiogramme/identification combinée des staphylocoques, streptocoques B et entérocoques Antibiogramme des streptocoques (excepté streptocoques B) et Haemophilus spp. Identification des bactéries à Gram négatif Identification des bactéries à Gram positif Identification d Haemophilus spp. et Neisseria spp. Identification des anaérobies et Corynebacterium spp. Identification de Bacillus spp. Identification des levures Médecine humaine AST-N103 (Antimicrobial Susceptibility Test) AST-N093 AST-P581 AST-P606 AST-P576 AST-EXN8 Médecine vétérinaire AST-GP69 AST-GN38 Phoenix/Galeries NID (Negative IDentification) PID (Positive ID) NMIC/ID--69 (Negative Minimal Inhibitory Concentration/ID) NMIC/ID-68 PMIC/ID-60 (Positive MIC/ID) PMIC/ID -61 SMIC/ID-9 (Streptococcus MIC/ID) Antibiogramme des entérobactéries Antibiogrammes des BGN non fermentants Antibiogramme des staphylocoques Antibiogramme des entérocoques et streptocoques B Antibiogramme des pneumocoques Antibiogramme étendu des entérobactéries (carte couplée à la carte AST-N103) Antibiogramme des bactéries à Gram positif Antibiogramme des bactéries à Gram négatif Identification des bactéries à Gram négatif Identification des bactéries à Gram positif Antibiogramme/identification combinée des entérobactéries Antibiogramme/identification combinée des BGN non fermentants Antibiogramme/identification combinée des staphylocoques Antibiogramme/identification combinée des streptocoques B et entérocoques Antibiogramme des streptocoques (excepté streptocoque B) 105

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108 CONTROLE DE QUALITE DE L ANTIBIOGRAMME Dr M.F.K. Missoum 107

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110 1. Objectifs : - Rappelons que le contrôle de qualité permet de garantir : La précision et la fiabilité de la technique des tests de sensibilité. La performance des réactifs utilisés dans les tests. La performance du personnel qui effectue les tests et la lecture. - Afin de se conformer à ces exigences, plusieurs souches de référence peuvent être utilisées : Escherichia coli ATCC Escherichia coli ATCC Klebsiella pneumoniae ATCC Pseudomonas aeruginosa ATCC Staphylococcus aureus ATCC Staphylococcus aureus ATCC Staphylococcus aureus ATCC Staphylococcus aureus ATCC Enterococcus faecalis ATCC Haemophilus influenzae ATCC Neisseria gonorrhoeae ATCC Streptococcus pneumoniae ATCC Haemophilus influenzae ATCC Procédure de contrôle : - Le contrôle de qualité doit se faire à chaque nouveau lot de Mueller-Hinton et ou d antibiotiques. Ce travail de contrôle doit être permanent. Il est conseillé de désigner dans chaque laboratoire une personne chargée de la supervision du contrôle de qualité. Une traçabilité des disques antibiotiques doit être réalisée à l aide des numéros de lots. - Les souches de référence devant être obligatoirement testées sont : E. coli ATCC S. aureus ATCC P. aeruginosa ATCC S. pneumoniae ATCC H. influenzae ATCC Une fois par semaine, ces souches seront testées, dans les mêmes conditions opératoires que celles décrites pour les bactéries isolées (Cf protocole de surveillance des tests de contrôle de qualité page 98-99). Toutefois d autres souches peuvent être intégrées dans le système de contrôle, leur choix est laissé à l appréciation du microbiologiste et doit tenir compte du type d antibiogramme pratiqué

111 - Faire une analyse mensuelle (analyse pouvant être faite par le logiciel Whonet), de l ensemble des tests de contrôle de qualité, par molécule et par technicien. Si les résultats ne sont pas satisfaisants, il faudra contrôler chacun des paramètres suivants : 1. La lecture et l interprétation des diamètres des zones d inhibition 2. Le milieu de culture 3. L inoculum 4. Les disques d antibiotiques 5. Les souches de référence. - Le contrôle de qualité doit être pratiqué par tous les techniciens et jamais par un seul Lecture et interprétation : - La lecture de l antibiogramme doit se faire à l aide d un pied à coulisse. Elle doit être précise : o pour éviter au maximum les erreurs de parallaxe en maintenant l instrument de mesure perpendiculairement à l axe optique. o pour les MH au sang la lecture des diamètres se fait à l intérieur des boîtes, sans toucher la gélose o pour les MH simples la lecture se fait à l extérieur de la boîte. - Il faut vérifier que les interprétations (S, I, R) correspondent bien aux diamètres mesurés. - Les mesures des diamètres d inhibition seront soigneusement prises, et comparées aux valeurs critiques figurant dans la table de lecture Il faut éviter les confusions entre les différentes tables de lecture. - Les deux causes principales d erreur sont: mauvais ensemencement (stries non serrées) et mauvaise mesure des diamètres Contrôle du milieu :.. ph : - Doit être de 7,2 à 7,4. Il faut le contrôler pour chaque nouveau lot de M H, à l aide d un ph- mètre, en effet toute variation de ph affecte l activité des aminosides, des macrolides et des phénicolés. - Plonger l électrode dans un flacon de MH, semi liquide (faire attention, car il y a risque d éclatement de l électrode si la température est trop élevée), la gélose doit se solidifier autour de l extrémité de l électrode, à ce moment là: prendre le ph... Préparation des boîtes : - Couler le milieu MH sur des boîtes posées au préalable sur un plan de travail strictement horizontal afin de permettre une répartition homogène du MH de 04 mm d épaisseur (ce qui correspond à une quantité de 20 ml de MH pour les boîtes de Petri de 90 mm de diamètre)

112 .. Humidité: - Les boîtes doivent être convenablement séchées avant l ensemencement... Concentration en thymidine ou thymine: - Une concentration trop élevée en tymidine, entraîne une réduction des diamètres d inhibition autour des disques de sulfamides et triméthoprime. Ignorer 20% de croissance au bord du disque du diamètre d inhibition et lire la ligne de croissance la plus visible. - Pour cela, il faut tester le milieu MH avec la souche de référence E. faecalis ATCC 29212, un diamètre d inhibition 20 mm doit être observé autour du disque de triméthoprime+sulfaméthoxazole. -.. Concentration en cations divalents: - Une concentration trop élevée en ions divalents (principalement : Ca 2+ et Mg 2+ ) entraîne une diminution des zones d inhibition pour les aminosides (testés pour P. aeruginosa), alors que de faibles concentrations donnent des zones d inhibition trop grandes. - Les ions Zn 2+ influencent l activité des carbapénèmes. - Ces concentrations doivent être de: Calcium mg/l Magnésium mg/l 2.3- Contrôle de l inoculum : - Préparer l étalon 0,5 Mc Farland, en versant 0,5 ml d une solution de Ba Cl 2 dihydraté à 1% (10 g/l), dans une éprouvette de 100ml. Compléter à 100 ml avec du H 2 SO 4 à 1% (10 ml/l). Ainsi préparé, il doit avoir une D.O. de 0,08 à 0,1 lue à 625 nm. - Aliquoter la solution en volumes de 10ml, dans des tubes identiques à ceux qui serviront à la préparation des inoculums (le nombre d aliquots sera fonction du nombre de manipulateurs). - Sceller ces tubes de façon à éviter toute évaporation (parafilm, ruban adhésif,..). - Repérer le niveau du liquide à l aide d un marqueur, et le contrôler régulièrement en prenant la densité optique. - Conserver les tubes à température ambiante et à l abri de la lumière (papier aluminium). - Homogénéiser le tube étalon avant de le comparer à l inoculum préparé : Inoculum et étalon doivent avoir la même turbidité lorsqu ils sont examinés sur un fond rayé. - Privilégier l utilisation des densitomètres Disques d antibiotiques : - Il existe 03 normes servant à la production de disques imprégnés d antibiotiques : Normes DIN (Deutsche Institut fur Norming) (90-125%) Normes WHO (World Health Organisation) (75-135%) 111

113 Normes FDA (Food Drug Administration) (60-135%) Les valeurs citées ci-dessus correspondent aux écarts tolérés sur le disque par rapport à la charge indiquée pour l antibiotique en question. - Avant d utiliser toute cartouche d antibiotique, il faut vérifier la date de péremption, surtout pour les β-lactamines, ainsi que la charge des disques. - Le stock de cartouches d antibiotiques doit être conservé, à 20 C, les cartouches dans leurs étuis correctement rebouchés. Les applicateurs, munis de cartouches d antibiotiques sont conservés à +4 C. - Tout disque mouillé, ou ayant été directement au contact de la glace, ou bien encore conservé à température ambiante ne devrait pas être utilisé. - Les cartouches doivent être retirées du congélateur 1 à 2 heures avant leur utilisation Souches de référence : - Dés leur réception, les souches de référence doivent être isolées sur milieu adéquat, une gélose nutritive ordinaire suffit pour les bactéries non exigeantes (voir tableau ci-après). - A partir de cette culture faire 12 congélations à - 70 C. - Chaque mois sortir un tube de congélation de chaque souche qui sera testée. - Gratter la souche à l aide d un écouvillon sans la décongeler. - Refaire 12 congélations pour l année suivante à partir du 12 ème tube de conservation. - Les valeurs critiques des souches de référence pour les antibiotiques testés sont reportées dans la table de lecture 13. Mode de conservation -Lyophilisation -Congélation à 70 C -Gélose profonde Observations -Conservation à long terme -Conservation à long terme -Repiquage régulier des souches. - A défaut de congélateur ou de lyophilisateur, on peut ensemencer une GSC inclinée ; l incuber 24h, puis la conserver à 20 C. Cette technique permet de conserver le pneumocoque jusqu à 6 mois Une évaluation externe de la qualité est instaurée depuis 1999, pour l ensemble des laboratoires du réseau de surveillance de la résistance aux antibiotiques. Tout microbiologiste désirant participer à ce contrôle, pourra le faire en s inscrivant au laboratoire de bactériologie médicale, de l Institut Pasteur d Algérie chargé de superviser la surveillance de la résistance bactérienne aux antibiotiques au niveau national

114 Figure 17 : PROTOCOLE DE SURVEILLANCE DES TESTS DE CONTROLE DE QUALITE (CQ) A- Rythme quotidien Si à 1test incorrect (out) tous les 20 tests consécutifs Si > à 1test out parmi 1 série de 20 tests Continuer à tester quotidiennement Apporter une action correctrice * Pour chaque molécule si : 1 test out sur 20 tests ou 3 tests out sur 30 tests 1 CQ Test par semaine Une erreur évidente* Retester le même jour après correction de l erreur Une erreur non évidente Action correctrice immédiate*** Rechercher la cause et corriger Correction des résultats Continuer à tester quotidiennement Résultats des CQ Retester le même jour et 5 jours de suite Pas de changement Continuer à tester quotidiennement Investigation plus approfondie*** 113

115 B- Rythme Hebdomadaire : Résultats de tests quotidiens CQ satisfaisants (1 test out parmi 20/ ou 3 out parmi 30 résultats d une série) Mise en place d un rythme Quelques tests incorrects Action correctrice Une erreur évidente* Après correction ; retester le même jour Une erreur non évidente Correction des résultats Résultats toujours incorrects Action correctrice immédiate** Retester le même jour et les 05 jours Reprendre le rythme hebdomadaire Tous les résultats corrects Quelques résultats toujours incorrects Reprendre le rythme hebdomadaire Investigations plus approfondies*** - Recherche d une source possible d erreur 114

116 * Une erreur évidente : - Souche ATCC inappropriée avec le test CQ - Contamination de la souche ATCC - Mauvaises ou inadéquates conditions d incubation. ** Action correctrice Immédiate: - Tester la combinaison antibiotique/souche ATCC le même jour où le test out est observé et refaire le test 05 jours consécutifs. Noter tous les résultats. - Les tests CQ doivent être effectués quotidiennement jusqu'à résolution du problème. - Si au cours de ces 05 jours, des résultats incorrects (out) sont toujours signalés pour le test en question, préconiser des investigations plus approfondies ***. *** Investigations plus approfondies : Vérifier toutes les procédures mises en place : - La souche de contrôle ATCC n a pas été changée et n est pas contaminée. - La suspension de l inoculum est préparée et ajustée correctement à partir d une culture de 24h. - Qualité de l étalon Mac Farland, bien l agiter avant utilisation. - Les réactifs et disques antibiotiques utilisés ne sont pas périmés et sont stockés à la température adéquate. - Mesure et transcription des valeurs des diamètres d inhibition. - Tout équipement fonctionne correctement (ex : incubateur)

117 116

118 RECOMMANDATIONS ET SUGGESTIONS Pr K. Rahal 117

119 118

120 Du matériel et des réactifs 1- Disques antibiotiques - Toute commande de réactifs y compris celle des disques d antibiotiques doit obligatoirement comprendre : le nom du fournisseur, le code du produit, le nom et la présentation du produit commandé ainsi que la quantité à commander. - Vérifier soigneusement que la charge requise correspond bien au code du produit. - Vu que nous appliquons les normes CLSI, commander des disques dont les charges correspondent aux charges recommandées par le CLSI. - Chaque fournisseur de cartouches de disques antibiotiques commercialise également des distributeurs de disques adaptés à ses propres cartouches Une cartouche d un fournisseur ne peut s adapter à un distributeur d un autre fournisseur. - Chaque cartouche doit avoir une étiquette sur laquelle sont inscrits : le nom du laboratoire producteur, le N de code, la charge du disque, le nom de l antibiotique et la date de péremption. Si le nom du laboratoire producteur ne figure pas sur la cartouche, cela signifie que l origine du produit est inconnue. Ce type de cartouche existe et ne devrait pas être commercialisé. Le MSPRH ne fait pas contrôler les réactifs comme il le fait pour les médicaments donc certains réactifs non règlementaires peuvent apparaître sur le marché. Le laboratoire de Bactériologie médicale de l Institut Pasteur d Algérie (IPA) expertise les disques d antibiotiques et les milieux pour antibiogrammes mais celle-ci n est pas obligatoire. Si un produit vous paraît suspect, demandez au fournisseur de vous communiquer l expertise. - Les disques d antibiotiques devront être transportés et stockés, de préférence à -20 C et distribués en tenant compte des besoins en ces produits ainsi que de leurs dates de validité. Le retard à quelque niveau que ce soit aura des retombées sur le traitement du patient. - Les applicateurs doivent être stérilisés régulièrement à l autoclave durant 15 mn à 120 C ou désinfectés avec de l eau javellisée ; en outre pour éviter toute contamination de la gélose, obturer par du ruban adhésif les ouvertures vides non chargées de cartouches d antibiotiques. 2- Milieux - L antibiogramme devra être réalisé obligatoirement sur milieu de Mueller-Hinton. Le milieu de Mueller-Hinton est un milieu complexe commercialisé par peu de laboratoires dans le monde. La commande de ce milieu doit tenir compte de la consommation dans le laboratoire pour éviter la pénurie, car si pénurie il y a, aucun autre milieu ne pourra être utilisé. - Concernant le Mueller-Hinton supplémenté au sang, il faut tenir compte du type de sang recommandé : mouton ou cheval et de la quantité dans le milieu, en général 5%. Il serait souhaitable de commercialiser au niveau de l IPA les milieux GC supplémenté et HTM destinés respectivement à la réalisation des antibiogrammes de N.gonorrhoeae et Haemophilus spp., afin d en garantir une disponibilité continue. - Les milieux doivent être conditionnés en flacons de 250ml et non de 500ml

121 3- Boîtes de Petri - Les boîtes de Petri stériles doivent être parfaitement conditionnées, il faut être vigilant et éliminer les sachets détériorés suite à un mauvais stockage. Un contrôle de stérilité des boîtes peut s avérer nécessaire en cas de contamination importante des cultures. - Il faudra prévoir un quota de boîtes de Petri en verre que l on utiliserait en cas de pénurie de boîtes en plastique. 4- Les souches de référence :. E.coli ATCC S.aureus ATCC P.aeruginosa ATCC S.pneumoniae ATCC H.influenzae ATCC ont été distribuées à tous les membres du réseau. Elles sont disponibles au niveau du laboratoire de bactériologie médicale à l Institut Pasteur de Dely Ibrahim. Pour les autres ATCC, des commandes peuvent être faites auprès de divers fournisseurs. - Pour la conservation des souches exigeantes, le laboratoire doit être doté d un congélateur à -70 C relié à un groupe électrogène afin de palier aux coupures de courant. 5- Atmosphère enrichie en CO2 Pour obtenir une atmosphère enrichie en CO2, une étuve à CO2 serait l idéal, mais à défaut, une jarre avec gaspack ou une cloche avec une bougie conviennent également. 6- Le ph mètre devra régulièrement être étalonné. De la technique - L identification exacte des germes est aussi importante que la réalisation de l antibiogramme. - Certains disques d antibiotiques doivent être disposés de manière à mettre en évidence certains mécanismes de résistance (ex : céphalosporines de 3 ème génération à côté d un inhibiteur de bêta lactamase pour la mise en évidence de la BLSE ; érythromycine à côté d un disque de clindamycine pour la mise en évidence de la résistance inductible aux macrolides. - Pour certaines molécules antibiotiques de la nomenclature algérienne, il n existe pas de valeurs critiques selon les normes CLSI. Pour ces anciennes molécules d origine française, nous nous sommes donc référés aux valeurs critiques définies par la Société Française de Microbiologie- Comité de l Antibiogramme

122 Du résultat de l antibiogramme - Les antibiotiques testés doivent être classés par familles et leurs noms écrits intégralement sur la feuille de résultat de l antibiogramme (et non sous forme d abréviations). - Les trois catégories de sensibilité aux antimicrobiens doivent être répertoriées en Sensible, Intermédiaire, Résistant et jamais par des croix. Les trois catégories de sensibilité aux antimicrobiens sont définies comme suit : Sensible : l infection provoquée par la souche testée répondra probablement au traitement par cet antibiotique. Résistant : l infection provoquée par la souche testée ne répondra probablement pas au traitement à cet antibiotique. Intermédiaire : la réponse au traitement est imprévisible. - En cas de BLSE, interpréter uniquement en fonction des valeurs critiques. - En cas de MRSA, ne pas oublier de corriger le résultat initialement classé dans la catégorie Sensible en résultat Résistant. - Il est utile d inclure un commentaire particulier destiné au clinicien sur la souche isolée et sur sa sensibilité aux antibiotiques : ex :S.aureus MRSA+ : la souche est résistante à toutes les β- lactamines. - Le résultat de l antibiogramme doit être contrôlé et validé par le responsable du laboratoire avant sa remise au patient (externe) ou au clinicien (patient hospitalisé). Il faut s assurer en particulier que : La sensibilité aux antibiotiques concorde avec l identification de la souche isolée. (ex : Proteus mirabilis doit en général être résistant à la colistine). Les résultats au sein d une classe d antibiotiques suivent la hiérarchie établie pour les règles d activité au sein de cette famille d antibiotiques. (ex : les céphalosporines de 3 ème génération sont plus actives que celles de 1 ère et de 2 ème génération sur les entérobactéries). La souche isolée est sensible aux antibiotiques pour lesquels rares sont les résistances signalées. (ex : S.aureus et vancomycine, H.influenzae et céfotaxime, N.meningitidis et ampicilline). - Tout résultat inhabituel ou discordant doit entraîner une vérification des paramètres suivants :. Erreur de transcription des résultats. Contamination de la souche bactérienne. Contrôle des résistances inhabituelles par la détermination des CMI. Si la raison des résultats inhabituels n est pas élucidée, il faudra refaire l identification de la souche et/ou refaire l antibiogramme

123 122

124 Whonet 5.6 Dr H. Tali- Maamar 123

125 124

126 WHONET est un logiciel utilisé pour la surveillance de la résistance bactérienne aux antibiotiques. Plusieurs pays l utilisent (voir figure ci-dessous). Une mise à jour régulière est faite pour ce programme, tenant compte des nouvelles recommandations des différents comités d antibiogramme. Pays utilisant le WHONET Source : Figure 18 : Utilisation du logiciel WHONET dans le monde en mai 2011 En Algérie, ce logiciel est utilisé depuis 1999 par l ensemble des membres du réseau de bactériologie (A.A.R.N.). Grâce à cet outil, les résultats d antibiogrammes sont saisis puis analysés par les microbiologistes. Ceci permet l édition d un rapport annuel d évaluation sur les données de résistance bactérienne aux antibiotiques au niveau national. La dernière mise à jour est la version WHONET 5.6. L installation de la nouvelle version se fait directement sur celle du «5.5», en conservant les données et la configuration initiale. L ancienne version WHONET 5.5 est automatiquement écrasée. Si vous souhaitez conserver la version précédente, il faut prendre soin de sauvegarder le fichier exécutable avant de procéder à l installation. Les principales nouveautés de cette version, concernent : - La mise à jour des valeurs critiques du CLSI (2010) - Ajout des normes EUCAST (2010) - La possibilité de transfert des données à partir d automates : MicroScan et Vitek vers WHONET, en utilisant le baclink. Une documentation complète sur l utilisation du logiciel est proposée en même temps que le fichier exécutable

127 Erreurs fréquemment retrouvées lors de l exploitation des résultats : - Souche de référence saisie incorrectement, exemple : E.coli au lieu de E.coli ATCC Pas de précision de la BLSE. Celle-ci doit être reportée au niveau de la case qui lui est attribuée sur la fiche de saisie. - Même problème pour les MRSA. - Erreur dans les charges des antibiotiques, exemple : OX 1µg testée, mais résultat saisi sur OX 5µg. - Erreur de saisie des antibiotiques, exemple : pristinamycine pour Pseudomonas aeruginosa. - Mauvaise sauvegarde des fichiers, exemple : fichiers vides. - Extensions des fichiers non respectées. Le nom du fichier whonet doit être composé de deux parties : L identifiant et l extension * La première partie est composée de huit caractères alphanumériques comme nom ou identifiant, dont on peut identifier le fichier, le mois de création du fichier, l année et le pays. * La deuxième partie c est l extension, avec l extension on peut identifier le laboratoire qui a créé ce fichier, et donc à qui appartiennent les données. Un point sépare l identifiant de l extension. * Chaque laboratoire a sa propre extension. Exemple : le fichier whonet du mois de janvier de l année 2010 de l Institut Pasteur d Algérie est présenté comme suit : W0110DZA.IPA Identifiant Point Extension W0110DZA. IPA W signifie fichier whonet Signifie Institut Pasteur D Algérie 01 le mois «01» janvier 10 l année «10» 2010 DZA le pays «DZA» Algérie 126

128 Tableau 34 : liste des extensions des fichiers Whonet pour les laboratoires membres du réseau : Laboratoire Service de Bactériologie médicale Institut Pasteur d Algérie CHU Mustapha - Alger - Service de microbiologie. CHU Beni Messous - Alger - Laboratoire central CHU Beni Messous - Alger - Laboratoire mère-enfant CHU Bab El Oued Alger - Laboratoire central. EHS Centre Pierre et Marie Curie - Laboratoire central. EHS Dr M.A. Maouche El Biar Alger - Service de Biologie Clinique. EHS El Hadi Flici Bab El Oued Alger. Laboratoire central Institut National de Santé Publique. El Biar Alger. Département Soutien Technique-Laboratoire de microbiologie CHU Hussein Dey Alger - Laboratoire Central. EPH de Birtraria - Alger - Laboratoire central. Hôpital Central de l armée Kouba Alger. Laboratoire de bactériologie. Institut Pasteur d Algérie - Alger CHU BENBADIS- Constantine- Service de microbiologie. CHU Batna Département de Biologie. CHU Frantz Fanon Blida - Laboratoire central EPH de Boufarik Blida - Laboratoire central. CHU de Sétif -- Laboratoire de bactériologie. CHU d Oran- Oran Laboratoire central CHU Dorban Annaba - Laboratoire central. CHU de Tizi-Ouzou - Laboratoire de microbiologie et parasitologie. Hôpital militaire régional universitaire de Constantine Laboratoire de microbiologie EPH de Bologhine - Laboratoire central Hôpital militaire universitaire d'oran - Laboratoire de microbiologie Hôpital militaire universitaire spécialisé de Staoueli Alger Laboratoire central. EPH Tamanrasset Laboratoire central EHU 1er Novembre1954 Oran- Service Bactériologie EPH Batna- laboratoire central Extension.IPA.STD.LBM.LME.BEO.CPM.CNM.EHF.ISP.PAR.BIT.HCA.IPA.LM6.LBB.HDB.SSB.LMS.LBO.HDA.CTB.HM5.LCB.LAH.HMS.TAM.EHO.EPB 127

129 Laboratoire Extension Laboratoire central vétérinaire d Alger Laboratoire vétérinaire régional de Tizi-Ouzou Laboratoire vétérinaire régional de Constantine Laboratoire vétérinaire régional de Tlemcen Laboratoire vétérinaire régional de Mostaganem Laboratoire vétérinaire régional de Laghouat Laboratoire vétérinaire régional d EL Tarf Institut Pasteur d Algerie Annexe de Kouba.Service de microbiologie vétérinaire et d épizootiologie.lcv.lvd.lvc.lvt.lvm.lvl.lve.lva 128

130 MEDECINE VETERINAIRE 129

131 130

132 LISTE DES ANTIBIOTIQUES A TESTER EN MEDECINE VETERINAIRE Dr S. Kechih-Bounar 131

133 132

134 Principaux antibiotiques utilisés en médecine vétérinaire en Algérie: a- A titre curatif : La nomenclature algérienne est établie en 2004,les molécules suivantes sont les plus utilisées sur le terrain. Tableau 35 : Liste des antibiotiques utilisés sur le terrain : Antibiotique Espèce animale Observations particulières 1.β-Lactamines Ampicilline Amoxicilline Oxacilline Pénicilline Amoxicilline+ Acide clavulanique Aviaire, bovine, caprine, équine, ovine, piscicole Bovine Bovine, caprine, équine, ovine Aviaire, bovine, caprine, cameline, équine, ovine, cunicole Aviaire, bovine, caprine, équine, ovine. Ces antibiotiques sont utilisés pour traiter les cas de septicémies, d infections respiratoires et urinaires chez de nombreux animaux Céfalotine Céftiofur 2. Aminosides : 2.1- Aminocyclitoles : Spectinomycine Bovine, caprine, équine, ovine Aviaire, bovine, caprine, équine, ovine, cunicole Aviaire, bovine, caprine, équine, ovine, cunicole et piscicole. Sont utilisés pour le traitement des septicémies, des infections respiratoires et mammaires. 2-2.Aminoglycosides : Streptomycine Néomycine Kanamycine Apramycine Tobramycine Amikacine Framycetine Rifamixine 3. Cyclines : Doxycycline Oxytétracycline Tétracycline Apicole, aviaire, bovine, caprine, équine, ovine,cunicole et piscicole. Apicole, aviaire, bovine, caprine, équine, ovine,cunicole Aviaire, bovine, équine et piscicole. Aviaire, bovine, cunicole, ovine. Equine Equine Bovine, caprine, ovine. Equine, cunicole, ovine. Aviaire, bovine, cameline, caprine, équine, ovine, cunicole et piscicole. Apicole, aviaire, bovine, caméline, caprine, équine, ovine,cunicole et piscicole. Apicole, aviaire, bovine, caméline, caprine, équine, ovine,cunicole et piscicole. Les aminoglycosides sont utilisés dans le traitement des septicémies; des affections digestives, respiratoires et urinaires. Antibiotiques très utilisés dans le traitement de nombreuses maladies bactériennes chez beaucoup d'espèces animales 133

135 Antibiotique Espèce animale Observations particulières 4. Sulfamides et associés : 4.1- Sulfonamides : Sulfadimérazine Aviaire, bovine, caprine, équine, ovine,cunicole Sulfadiméthoxine Aviaire,bovine, équine,caprine, ovine,cunicole et piscicole. Sulfaguanidine Caprine, ovine. Sulfadiméthoxazole Aviaire, bovine. Sulfamethoxine Aviaire, piscicole. Sulfanilamide Bovine, caprine, ovine Sulfonamides+Diaminopyrimidines : Triméthoprime+sulfonamide Aviaire, bovine, caprine, équine, ovine,cunicole et piscicole Diaminopyrimidines : Triméthoprime Aviaire, bovine, caprine, équine, ovine,cunicole. 5. Quinolones : 5.1- Quinolones de 1 ère génération Fluméquine Aviaire, bovine, caprine, équine, ovine,cunicole et piscicole. Acide Nalidixique Bovine Acide Oxolinique Aviaire, bovine, cunicole et piscicole 5.2- Quinolones de 2 ème génération (Fluoroquinonolones) Ciprofloxacine Aviaire, bovine Danofloxacine Aviaire, bovine, caprine, cunicole et piscicole Enrofloxacine Aviaire, bovine, caprine et équine. Marbofloxacine Bovine Norfloxacine Aviaire, bovine, caprine, cunicole et ovine 6. Orthosomycines : Avilamycine Aviaire et cunicole. 7. Polypeptides : Les sulfamides seuls ou en combinaison avec les diaminopyrimidines sont très utilisés pour le traitement de beaucoup de pathologies et chez de nombreuses espèces animales. Les quinolones de 1 ère et 2 ème génération sont utilisées dans le cas des colibacilloses et des septicémies. Les fluoroquinolones sont très utilisées dans le traitement des maladies respiratoires chroniques(mrc) chez la volaille Antibiotique utilisé pour traiter les maladies digestives de la volaille et des lapins. Très efficace pour le traitement de l'entérite nécrotique chez les poulets. Antibiotique utilisé seulement chez l animal. Bacitracine Aviaire, bovine et cunicole. Antibiotique indiqué dans le traitement des septicémies, de la colibacillose et des infections urinaires. Colistine Polymyxine 8. Macrolides : Erythromycine Josamycine Spiramycine Tilmicosine Tylosine Aviaire, bovine, caprine, équine, cunicole et ovine. Aviaire, bovine, caprine, équine, cunicole et ovine. Aviaire, apicole, bovine, caprine, équine, ovine,cunicole et piscicole. Aviaire et piscicole. Aviaire, bovine, caprine, équine, cunicole, ovine et piscicole. Aviaire, bovine, caprine, cunicole et ovine. Apicole, aviaire, bovine, caprine, cunicole et ovine. Antibiotiques utilisés pour traiter les infections à mycoplasmes chez la volaille, les maladies digestives hémorragiques et les infections respiratoires chez les bovins

136 Antibiotique Espèce animale Observations particulières 9. Lincosamides : Clindamycine 10. Autres : Novobiocine : Aviaire, bovine, caprine ovine et piscicole. Bovine, caprine, ovine et piscicole. Antibiotiques essentiels dans le traitement des pneumonies à mycoplasmes, de l'arthrite infectieuse et de l entérite hémorragique chez les ovins et les caprins. Antibiotique utilisé chez les cas de septicémies chez les poissons et dans le traitement des mammites (sous forme de crèmes intra mammaire en association avec la pénicilline (10 unités/30 μg). Antibiotique utilisé uniquement chez les animaux b- Antibiotiques utilisés comme facteurs de croissance : Les antibiotiques comme facteurs de croissance ne sont plus incorporés dans l alimentation animale et sont interdits d utilisation depuis Avril 2007 (décision interministérielle du 24 Décembre 2006). c- Antibiotiques suspendus de l homologation : Furanes : Nitrofurantoines Phénicoles : Chloramphénicol Aminosides : gentamicine Ces antibiotiques sont cependant testés au laboratoire dans le cadre de la surveillance de la résistance des bactéries aux antibiotiques 135

137 Tableau 36 : Liste des antibiotiques à tester pour les bactéries non exigeantes : Entérobactéries Pseudomonas spp. Staphylococcus spp. Enterococcus spp. Ampicilline Amoxicilline+Acide clavulanique * Pénicilline+Novobiocine Pénicilline Amoxicilline+Acide clavulanique* Céftiofur* Amoxicilline+Acide clavulanique * Ampicilline Céfalotine Enrofloxacine Oxacilline Enrofloxacine Céftiofur * Gentamicine** Céfoxitine*** Tétracyclines Tétracycline Tobramycine Tétracyclines Sulfisoxazole Fluméquine/Acide nalidixique Colistine Enrofloxacine Triméthoprime+sulfam éthoxazole Enrofloxacine/Marbofloxacine Néomycine /Kanamycine Erythromycine Néomycine /Kanamycine Gentamicine** Tilmicosine Gentamicine** Bacitracine Lincomycine Colistine Sulfisoxazole Vancomycine** Sulfisoxazole Triméthoprime+ sulfaméthoxazole Nitrofurantoine** Chloramphénicol** Triméthoprime+ Sulfaméthoxazole Erythromycine Vancomycine** Clindamycine *Antibiotique testé seulement pour la recherche des β-lactamases. ** Antibiotique testé uniquement dans le cadre de l épidémiosurveillance. *** Antibiotique testé seulement pour la recherche des souches MRSA+. Tableau 37 : Liste des antibiotiques à tester pour les bactéries exigeantes : Streptococcus spp. Haemophilus spp. Pasteurella spp. Listeria monocytogenes Campylobacter coli/jejuni Pénicilline Ampicilline Céftiofur Pénicilline Gentamicine** Pénicilline+novobiocine Amoxicilline+ Acide clavulanique* Enrofloxacine Ampicilline Tétracyclines Ampicilline Céfalotine Danofloxacine Céftiofur*** Acide nalidixique Céfotaxime Céftiofur* Spectinmycine Erythromycine Tétracyclines Tétracycline Tilmicosine Clindamycine Erythromycine Enrofloxacine Tétracyclines Ciprofloxacine Vancomycine** Chloramphénicol** Trimethoprime+ Sulfamethoxazole Spectinomycine *Antibiotique testé seulement pour la recherche des β-lactamases ** Antibiotique testé uniquement dans le cadre de l épidémiosurveillance *** Intérêt diagnostic 136

138 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 137

139 138

140 1- Arlet. G, A. Philippon. Les nouvelles β-lactamases à l aube du troisième millénaire. Rev Fr. des Lab. 2003, 352 : Aubert. D, AT. Naas, MF. Lartigue, P. Nordmann. Novel Genetic Structure Associated with an Extended-Spectrum ß-Lactamase blaveb Gene in a Providencia stuartii Clinical Isolate from Algeria. Antimicrob. Agents Chemother. 2005, 49: Bourgeois. N, F. Doucet-Populaire, J.C. Ghnassia. Infection à Bordetella pertussis : Diagnostic et épidemiologie clinique et moléculaire. Feuillets de biologie. 2003, 250 : Brett. M, P.Short, S.Beatson. The comparative in-vitro activity of roxithromycin and other antibiotics against Bordetella pertussis. J antimicrob. chemother. 1998, 41: Comité de l Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie.2007, 2010 et Coudron. PE. Inhibiteur-based methods for detection of plasmid-mediated AmpC β lactamases in Klebsiella spp.,escherichia coli, and Proteus mirabilis. J. Clin Microbiol. Aug 2005, 43 : Courvalin. P, R. Leclerc, E. Bingen. Antibiogramme. 2006, 2 ème edition ESKA. 8- Gallusser A Gordon K A., J.Fusco, D J. Biedenbach, M A. Pfaller, R N. Jones. Antimicrobial Susceptibility Testing of Clinical Isolates of Bordetella pertussis from Northern California: Report from the Sentry Antimicrobial Surveillance Program. Antimicrob Agents Chemother. 2001, 45: Holasova. M, R. Karpiskova, S. Karpiskova, V. Babak, J. Schlegelova. Comparison of methods for the determination of antimicrobial resistance in Campylobacter spp. human and the food chain isolates; Veterinarni Medicina. 2007, 52: Hoppe. JE, A. Hang. Antimicrobial susceptibility of Bordetella pertussis.infection 1988, 16: Hoppe J E., E. Rahimi-Galougahi, G.Seibert. In Vitro Susceptibilities of Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis to four fluoroquinolones (Levofloxacin, d-ofloxacin, Ofloxacin, and Ciprofloxacin), Cefpirome, and Meropenem. Antimicrob Agents Chemother. 1996, 40: Institut National de médecine vétérinaire Algérien 1995 : Guide des méthodes de prélèvements en médecine vétérinaire. 14- Konte. M, G. Vassiliades et Y. Leforban. Prélèvements biologiques pour analyses au laboratoire. Institut Sénégalais de recherches agricoles, cahiers d information. Issn. 1990, Osso Vol 4 N Lignes directrices pour le contrôle de la sensibilité aux antimicrobiens à l intention des laboratoires de niveau intermédiaire situés dans les pays aux ressources limitées. Rapport technique de l OMS. 1995, 850 : Manchanda V, Singh NP. Occurrence and detection of AmpC β-lactamases among Gram negative clinical isolates using a modified three dimensional test at Guru Tegh Bahadur Hospital, Delhi, India. J. Antimicrob. Chemother. 2003, 51: Manuel terrestre de l O.I.E, 2008 : Prélèvement et expédition des échantillons pour le diagnostic. 18- Mécanismes de résistances Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Test For Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standards. Seventh edition. CLSI. January 2006, M7-A7, Vol 26. N

141 20- Methods for antimicrobial dilution and disk susceptibility testing of infrequently isolated or fastidius bacteria, Approved guideline.clsi. 2006, M45-A, Vol 26. N Nicolas. P, J-D. Cavallo, R. Fabre et G. Martet. Standardisation de l antibiogramme de Neisseria meningitidis. Détection des souches relativement résistantes à la pénicilline - Bulletin de l OMS. 1998,76: Ouar-Korichi. M. N, Senouci. H, Rahal. K. Diagnostic bactériologique et sérologique de la Brucella humaine. Institut Pasteur d Algérie ème édition.ands. 23- Patel JB et al. Carbapenemase in Enterobacteriaceae: Activity, Epidemiology and Laboratory Detection. Clinical Microbiology Newsletter. 2009, 31: Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for bacteria isolated from Animals, Approuved Standard. Second Edition.NCCLS. M31-A2. Vol 22. N 6. May Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for bacteria isolated from Animals, Informational Supplement. NCCLS. document M31-S. Vol 24. N 17. May Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved Standards. Ninth Edition. CLSI. M2-A 9 Vol 26 N 1. January Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing ; Sixeenth Informational Supplement. CLSI. M100-S16 Vol 26, n 1. January Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing ; Eighteenth Informational Supplement. CLSI. January M100-S18 Vol 26, n Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for bacteria isolated from Animals, Approuved Standard. Third Edition.NCCLS. M31-A3. Vol 28. N Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing ; twenty Informational Supplement. CLSI. M100-S20. Vol 30. N Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing ; twenty first. Informational Supplement. CLSI. M100-S21. Vol 31. N Philippon. A, G. Arlet. Les β-lactamases chez les bacilles à Gram Négatif : que de nouveautés en 15 ans!. Antibiotiques. 2005, 7 : Philippon. A, G. ARLET. β-lactamases de bacilles à Gram négatif : le mouvement perpétuel! Ann.Biol.Clin. 2006, 64 : Renaud F., F.Tissot Guezzaz. La sécurité au laboratoire de biologie clinique. Manuel de bactériologie clinique ème Ed. Vol. 1 Ed. Elsevier

142 ANNEXES 141

143 142

144 Composition des milieux et préparation de géloses spécifiques A- Bactéries non exigeantes : Mueller-Hinton Agar : Infusion de viande de boeuf déshydratée g Hydrolysat de caséine ,5g Amidon de maïs ,5g Agar agar Eau distillée g qsp 1000ml ph final ,2-7,4 B- Neisseria gonorrhoeae : Milieu GC : Bacto Proteose Peptone g Amidon de maïs Phosphate dipotassique Phosphate monopotassique Chlorure de sodium Agar Eau distillée g 4g 1g 5g 10g qsp 1000ml ph final ,2-7,4 Supplément (Oxoïd) : Supplément : (1.1g L-cysteine, 0.03g guanine HCL, 3mg thiamine HCL, 13mg PABA, 0.01g B12, 0.1g cocarboxylase, 0.25g NAD, 1g adenine, 10g L-glutamine, 100 g glucose, 0.02g ferric nitrate [dans 1L H2O] ajouté après autoclavage. 1% C- Haemophilus spp. : Milieu HTM : (Haemophilus Test Medium) M H. agar g/l Supplément : Hématine Bovine (Prendre 30ml d une solution d hématine bovine à 0,05g/l Poids/volume) préparée dans du NaOH 0,01 N). NAD (ou β NAD) (Prendre 3ml d une solution de NAD à 5g/l (poids/volume) préparée avec de l eau distillée stérile, ajoutée après stérilisation à l autoclave). 15 mg/l 15 mg/l Extrait de levure g/l Eau distillée qsp 1000ml ph final ,2-7,

145 D- Gélose Mueller Hinton additionnée de 4% NaCl M H Agar NaCl Eau distillée g 40g qsp 1000ml E- Bouillon glycérolé pour la congélation des bactéries Bouillon coeur-cervelle Glycérol qsp 100ml 20 ml Congeler dés ensemensement. F- Préparation du milieu Mueller-Hinton additionné de 2 à 5% de sang de cheval hémolysé et défibriné : Défibriner le sang de cheval en l agitant lentement dans un récipient stérile contenant des billes de verre pendant 15 à 20mn. Congeler et décongeler 5 à 7 fois environ jusqu'à ce que le sang défibriné soit complètement lysé. Rajouter aseptiquement et à volume égal de l eau distillée stérile (ce qui ramène la dilution à 50% de sang hémolysé et défibriné). Centrifuger le sang défibriné et hémolysé à tours/mn pendant 20mn et récupérer le surnageant (il ne doit pas être trouble). Alliquoter le sang ainsi préparé et le conserver à 20 C pour une durée ne dépassant pas un mois. Ajouter les quantités nécessaires de surnagent au milieu Mueller-Hinton liquide pour avoir une concentration finale de 2 à 5%. Ajuster aseptiquement le ph à 7,2 7,4. Tableau 38: Liste des solvants pour la préparation des solutions antibiotiques (Référence : Document CLSI M100-S ) Antibiotique Solvant Diluant Pénicilline Eau distillée stérile Eau distillée stérile Amoxicilline Tampon phosphate ph6,0/ 0,1M Tampon phosphate ph6,0/ 0,1M Ampicilline Tampon phosphate ph8,0/ 0,1M Tampon phosphate ph6,0/ 0,1M Oxacilline Eau distillée stérile Eau distillée stérile Céfotaxime Eau distillée stérile Eau distillée stérile Imipénème Tampon phosphate ph7,2/ 0,01M Tampon phosphate ph7,2/ 0,01M Erythromycine 95% Ethanol Eau distillée stérile Ciprofloxacine Eau distillée stérile Eau distillée stérile Chloramphénicol Ethanol absolu Eau distillée stérile Gentamicine Eau distillée stérile Eau distillée stérile Streptomycine Eau distillée stérile Eau distillée stérile Tétracycline Eau distillée stérile Eau distillée stérile Doxycycline Eau distillée stérile Eau distillée stérile Rifampicine Méthanol Eau distillée stérile Colistine Eau distillée stérile Eau distillée stérile Vancomycine Eau distillée stérile Eau distillée stérile 144

146 Tableau 39 : Molécules utilisées en médecine humaine et vétérinaire: Famille Sous-famille Molécule(s) Bêta-lactamines Pénicillines Céphalosporines Usage chez l'homme Usage chez l'animal Pénicilline G X X Pénicilline V Pénicilline M X X Pénicilline A X X Carboxypénicilline Uréidopénicilline Première génération X X Deuxième génération X X Troisième génération X X Monobactames Cyclines X X Aminosides X X Macrolides X X Apparentés aux Macrolides Quinolones Furanes Phénicolés Lincosamides X X Kétolides Synergistines/streptogramines Première génération X X Deuxième génération X X Triméthoprimes X X Polymyxines X X Sulfamides X X Glycopeptides Imidazolés X X Anti-tuberculeux X X * Divers Acide fusidique X X Bacitracine X X Fosfomycine * Utilisation interdite sauf pour une molécule dans le cadre d une mammite X X X X X X X X X X FICHES TECHNIQUES DE PRELEVEMENTS A L USAGE DES VETERINAIRES : Introduction La qualité des résultats du laboratoire dépend étroitement des prélèvements reçus et effectués en effet, les renseignements insuffisants, les prélèvements inadaptés, le mauvais état de conservation, engendrent de mauvaises interprétations des résultats et entraînent des prises de décision inadéquates à l origine de l insatisfaction des demandeurs. Afin que les laboratoires vétérinaires soient de meilleure rentabilité, nous nous proposons de définir les prérogatives des laboratoires vétérinaires en matière de pathologie bactérienne ainsi que le choix et la qualité des prélèvements adéquats

147 I. Recommandations de l organisation internationale des épizooties (O.I.E) pour la réalisation du prélèvement et l expédition des échantillons pour le diagnostic de laboratoire - Il existe des réglementations spécifiques pour le conditionnement et l envoi des substances infectieuses, y compris les échantillons de diagnostic, qui doivent être appliquées. - Les échantillons peuvent être prélevés directement sur l'animal ou à partir de l environnement pour de multiples raisons telles que le diagnostic d'une maladie, la surveillance du statut sanitaire ou l établissement d un certificat sanitaire. - Les échantillons collectés doivent être appropriés aux buts de l'analyse et suffisants en nombre et quantité pour permettre un résultat statistiquement valide. - Les échantillons doivent être prélevés avec soin afin de ne pas perturber l'animal ou provoquer des lésions. - L opérateur et ses aides doivent également être à l abri de tout risque. - Il peut être nécessaire d utiliser des systèmes de contention de l animal, voire des tranquillisants ou des anesthésiques. - Lorsque du matériel biologique est prélevé, que ce soit sur animal vivant ou mort, le risque de zoonose doit être pris en compte afin d éviter des infections humaines. - Une attention particulière doit être portée pour éviter de contaminer l environnement ou tout risque de dissémination d une maladie via des insectes. En ce sens, des précautions doivent être prises pour l évacuation correcte des déchets d animaux ou de tissus. - Certains échantillons doivent être prélevés de manière aseptique, et un soin doit être porté pour empêcher les contaminations croisées entre les échantillons. - Le prélèvement doit être conditionné avec soin, identifié et expédié au laboratoire par le moyen le plus rapide, avec un contrôle approprié de la température. - Les échantillons doivent être représentatifs de la maladie à étudier et des lésions observées. - Doivent aussi être pris en considération, le stade de la maladie et le développement des lésions ainsi que le genre de test(s) qui seront réalisés. II- Méthodes de prélèvements en médecine vétérinaire Tout recours au laboratoire doit s effectuer dans le respect des règles déjà citées dans les recommandations de l OIE, en veillant à la rédaction d un document d accompagnement complet. Puis à l expédition de l échantillon vers le laboratoire le plus proche (Adresse des laboratoires vétérinaires de l INMV en annexe). Le recours au laboratoire est un moyen de diagnostic de certitude. A- Règles générales : - Il est inutile d effectuer des analyses sur un cadavre en putréfaction, car il y a une forte prolifération de germes de putréfaction qui masquent ceux responsables de la pathologie

148 - Les viscères (foie, poumons, rate, reins) doivent être pourvus de revêtement sur au moins l une de leur face et peser plus de 25 grammes. - Avantager la cautérisation à l utilisation d un antiseptique. Les liquides d épanchement ; le pus, le sang, le lait et l urine doivent être prélevés dans des récipients stériles. 1- Suspicion de septicémie : Les analyses sont effectuées sur : - Les organes (foie, rate, rein), - L os long désarticulé aux extrémités. - Le frottis sanguin. 2- Suspicion d avortement infectieux : Tout avortement infectieux constitue une suspicion de Brucellose. Les prélèvements sur l animal avorté doivent être réalisés par le vétérinaire sanitaire. Pour pratiquer un diagnostic de groupe valable, il convient de pratiquer d une part, a. Les recherches des germes sur l avorton : - Les enveloppes fœtales, les cotylédons avec des lésions d une ou plusieurs femelles avortées ou à défaut, l écoulement vaginal récolté dans un tube stérile. - Un ou plusieurs fœtus en cas d épidémie. b. Les recherches sérologiques à l échelle du troupeau : - Si une sérologie est effectuée, l échantillon de sang sera réalisé sur tube sec. - L échantillon de sang doit être prélevé le plus stérilement possible par ponction veineuse. la veine jugulaire est utilisée chez les grands mammifères (Les veines de la glande mammaire, de la queue ou des membres peuvent également être utilisées). la veine alaire (veine brachiale), chez la volaille. - Pour un échantillon de sérum, le prélèvement est laissé à température ambiante (veiller à le protéger des températures excessives) pendant 1 à 2 h jusqu au début de la rétraction du caillot. Retirer celui-ci avec une pipette stérile et conserver le sérum au réfrigérateur à 4 C. - Pour les échantillons prélevés sur anticoagulant, il est nécessaire de les homogénéiser par agitation douce. - Pour les réactions de polymérisation en chaîne (PCR), l E.D.T.A est l anticoagulant de choix. III- Techniques de prélèvements et principaux germes recherchés en médecine vétérinaire : Afin que les résultats soient exploitables, envoyer au laboratoire : a- Pour le diagnostic des maladies aviaires, et des petits élevages : des animaux malades morts ou moribonds. b- Pour le diagnostic des maladies affectant les grands animaux et les animaux de compagnie : des organes frais, du sang dans des tubes avec anticoagulants, du lait dans des tubes stériles, des matières fécales dans des pots à prélèvements stériles

149 Tableau 40 : Prélèvements effectués et principaux germes recherchés: Nature du prélèvement Appareil respiratoire Appareil genital Germes rencontrés Pasteurella spp., Bordetella spp., Chlamydia spp. Pseudomonas spp. Actinobacillus spp. Haemophilus spp. Corynebacterium spp., Mycoplasmes Chlamydia spp. Haemophilus spp., Actinobacillus spp., Corynebacterium spp., Campylobacter spp., Pseudomonas spp., Clostridium spp., Listeria spp., Brucella spp. Klebsiella spp., Mycoplasmes Techniques de prélèvements Effectuer les prélèvements immédiatement après la mort de l animal, sans dépasser 6 h. Utiliser un couteau désinfecté pour prélever les organes. Appareil locomoteur Staphylococcus spp. Streptococcus spp. Corynebacterium spp. Actinobacillus spp. Pasteurella spp. Entérobactéries, Haemophilus spp., Mycoplasmes spp. Erysipelothrix spp. Lors d affections podales, prélever une partie du tissu affecté, Lors de plaies, d abcès, prélever le contenu stérilement à l aide d un écouvillon. Transmettre au laboratoire, sous froid dans les 24 h suivant le prélèvement. Système nerveux Listeria spp., Haemophilus spp. Staphylococcus spp. Streptococcus spp. À l'aide d'un couteau d'autopsie, désarticuler la tête de la carcasse au niveau de l'articulation atlanto-occipitale. Séparer les nerfs crâniens de la moelle épinière. Dégager la moelle épinière et l encéphale. Avortements Os long Sang Chlamydia spp. Haemophilus spp. Actinobacillus spp. Corynebacterium spp. Campylobacter spp., Mycoplasma spp., Pseudomonas spp., Clostriduium spp. Listeria spp., Brucella spp. Klebsiella spp. Clostridium perfringens, Bacillus anthracis, Pasteurella spp. Streptococcus spp., Salmonella spp., Brucella spp., Pasteurella spp., Leptospira spp., Erysipelothrix spp., Francisella spp., Bacillus anthracis. Prélever les secrétions utérines (par écouvillonnage du col utérin), les enveloppes ou fragments d enveloppes, les avortons ou leurs organes (estomac, rate, os long désarticulé). N.B : Opérer avec soins pour éviter toute contamination ou propagation du contage Prélever l os long d un des membres, de préférence métacarpe ou métatarse Enlever tous les fragments de chair. L envelopper à sec dans un linge propre ou dans un sac en plastique,le conserver au réfrigérateur. Faire plusieurs prélèvements espacés de quelques heures (décharge fugace de bactéries dans la circulation) ; Prélever 10 à 40 ml de sang par ponction aseptique à la jugulaire sur animal à jeûne. Urines Entérobactéries Staphylococcus spp., Streptococcus spp. Corynebacterium spp. Pseudomonas spp., Leptospira spp. Opérer par sondage ou prélever lors de miction après asepsie 10 à 20 ml d urine

150 Fèces Entérobactéries, Mycobacterium paratuberculosis, Campylobacter spp., Clostridium spp. Liquides d épanchement Lait Ecouvillonnage nasal et oculaire Entérobactéries, Staphylococcus spp., Pseudomonas spp., Pasteurella spp.,mycoplasma spp. Entérobactéries, Staphylococcus spp., Streptococcus spp. Campylobacter spp., Haemophilus spp., Mycobacterium spp., Bacillus spp., Pasteurella spp. Pseudomonas spp., Clostridium spp., Leptospira spp., Corynebacterium spp., Mycoplasma spp. Isolement des bactéries à tropisme respiratoire (agents de pneumopathies) ou oculaire. Pus Staphylococcus spp. Streptococcus spp. Actinobacillus spp. Actinomyces spp. Entérobactéries, Pseudomonas spp., Clostridium spp., Pasteurella spp., Corynebacterium spp. Mycobacterium spp. Prélever 60 à 80 ml de matières fécales dès leur émission,ou à partir de l ampoule rectale ou du rectum. Lors de diarrhée aiguë, prélever dans les heures qui suivent l apparition des symptômes Ne pas congeler le prélèvement. L envoi d anses intestinales ligaturées et prélevées en régions liquides est aussi possible. Prélèvement du liquide pleural, péritonéal ou péricardique Prélèvement de la lymphe thoracique,par ponction aseptique de la cavité thoracique entre la 7ème et la 8 ème côte Les liquides sont déposés dans des flacons stériles. Laver et sécher complètement la mamelle Désinfecter I extrémité du trayon à l alcool à 70, en insistant sur l orifice du canal du trayon Prélever séparément les 4 quartiers Le flacon stérile est ouvert au dernier moment, le bouchon étant tenu pour protéger le flacon qui restera le plus possible à l horizontale Les premiers jets de lait sont éliminés et 10 ml seulement sont prélevés en évitant de bouger le flacon qui sera immédiatement fermé sans être déplacé. Ecouvillonnage : ne pas réaliser le prélèvement au stade de jetage muco-purulent ou purulent (le germe causal n est plus retrouvé dans le jetage, mais seulement la flore banale bactérienne subsistera en plus de bactéries de surinfection) Enfoncer l écouvillon le plus profondément possible dans les cavités nasales Introduire l écouvillon dans le cul-de-sac conjonctival inférieur, sans toucher la face extérieure de la paupière. Abcès ouvert : procéder par le nettoyage de la plaie puis grattage ; réaliser les prélèvements le plus stérilement possible ; Seringue stérile, tubes ou flacons stériles bouchant hermétiquement Abcès fermé : antisepsie cutané, ponction avec une aiguille de diamètre supérieur à 1 mm, en éliminant les bulles d air

151 IV- Protocole de prélèvements et d autopsie : L examen nécropsique est la continuation de l examen clinique pratiqué sur l animal avant sa mort, ou sur d autres animaux présentant les mêmes symptômes. Le diagnostic d une maladie repose donc sur quatre types d examens qui se succèdent dans le temps : L examen clinique de l animal vivant, L examen épidémiologique (l affection dans le troupeau, dans la population), L examen nécropsique du cadavre ou mieux de l animal sacrifié, L examen de laboratoire à partir des prélèvements effectués sur l animal vivant ou lors de l autopsie. De ces quatre examens dépend la précision du diagnostic.certaines maladies peuvent être diagnostiquées par le seul examen clinique, mais le plus grand nombre nécessite une confirmation par examen nécropsique et expérimental. Les meilleurs résultats d autopsie sont obtenus sur l animal sacrifié par saignée. Lorsque nous intervenons sur un cadavre, l autopsie doit être pratiquée le plus rapidement possible après la mort. Une autopsie tardive ne fournira que peu de renseignements et ne permettra pas de faire de prélèvements (sauf un os long éventuellement). Pour être valable une autopsie doit être complète, limiter l examen aux seuls organes supposés atteints n est pas suffisant et il arrive assez souvent que l examen des organes supposés sains réserve des surprises. Dans le cas de mort rapide sans symptômes apparents, il faut tenter de dépister 3 ou 4 animaux vivants, «suspects»et ajouter 2 ou 3 autres venant de mourir. S il s agit de contrôle de routine de l état sanitaire d un cheptel, il faut prendre un échantillon représentatif du lot. S il s agit d une demande de diagnostic d une maladie en évolution, dans le cas de la volaille, envoyer 05 sujets adultes,10 poussins malades vivants, pour les autres espèces adresser les animaux ayant les symptômes les plus typiques. Il est important de rappeler que prélèvements et autopsies ne sont pas toujours des actes anodins dénués de tout risque, tant pour le cheptel que pour l opérateur (en cas de zoonose), il conviendra donc toujours de prendre les précautions minimales pour éviter la propagation des épizooties, la contamination de l opérateur et de ceux qui l assistent. V- Modalités de prélèvements dans le cadre des affections bactériennes chez les espèces aviaires et cunicoles : Le choix des prélèvements dépend de plusieurs paramètres : - Des symptômes et lésions observés - De la maladie suspectée, du moment de prélèvement - Du traitement ou non des animaux (l antibiothérapie peut masquer les germes sans les éliminer) Le prélèvement doit s opérer en respectant certaines règles d hygiène notamment l asepsie du matériel utilisé et de l opérateur. En règle générale, éviter les souillures par les bactéries du milieu ambiant. Les prélèvements doivent être représentatifs de la pathologie sévissant dans l exploitation

152 A- Prélèvements en pathologie aviaire : Tableau 41 : prélèvements à réaliser et pathologies suspectées : Maladies Espèces affectées Symptômes et lésions Prélèvements Colibacillose (E.coli) Poulets, dindons canards,autres espèces Granulomes cæcums, perihépatite, péricardite, complication de maladies respiratoires chroniques(mrc) Foie, cæcums ; vitellus, ovaires Salmonelloses Salmonella spp. Poulets, dindons canards,autres espèces Diarrhée jaune et fétide, splénomégalie, foie hypertrophié de couleur bronze Foie, rate, œufs, litière, duvets Pasteurellose P.multocida P.hémolytica Toutes espèces Cyanose, diarrhée, jetage, conjonctivite, dyspnée, entérite,zone de nécrose sur le foie Moelle osseuse, sang, foie et écouvillonnage des cavités nasales Chlamydiose C.psittaci Dindons, pigeons, canards, autres espèces Péricardite, pneumonie, perihépatite, splénomégalie, entérite, Poumon, rate, foie, intestin, cerveau Mycoplasmose M.gallisepticum M.meleagridis Poulets, dindons, autres Sinusite, retard de croissance, salpingite, aérosaculite péricardite fibrineuse, perihépatite, Sinus, poumons, sacs saériens Coryza infectieux Haemophilus gallinarum Poulets, faisans, pintades Sinusite, œdème facial, jetage, conjonctivite Sinus, Ecouvillonnage de la trachée, poumon Tuberculose aviaire (Mycobacterium avium ) Poulets, dindons, autres Amaigrissement, diarrhée, boiterie, arrêt de ponte, granulome hépatique Poumon, rate, foie, Arthrite staphylococcique (Staphylococcus aureus) Toutes les espèces, principalement les males reproducteurs Arthrites chroniques Articulations infectées 151

153 B- Prélèvements en pathologie cunicole : Tableau 42 : Prélèvements à réaliser et pathologies suspectées : Maladies /germes Symptômes et lésions Prélèvements Colibacillose à E.coli Entérotoxémie ou syndrome dysbactériose cæcale à Clostridium perfringens Entérotyphlyte à Clostridium spiroforme Maladie de Tyzzer à Clostridium piliforme Chez les adultes : diarrhée, congestion généralisée de l intestin et du cæcum. Chez les lapereaux : présence de points de nécrose sur le parenchyme hépatique, forte mortalité. Atteint surtout les reproducteurs, crottes ramollies enrobées de mucus, mortalité brutale, l animal ballonne rapidement après la mort, reins congestionnés, foie dégénéré, contenu cæcal liquide malodorant avec gaz, paroi hémorragique. Diarrhée importante à caractère aigu et brutal, entérotyphlyte et congestion de la muqueuse cæcale et intestinale. Entérite aigue, hémorragique, œdème aîgu du poumon Intestin, cæcum, foie, fèces Foie, intestin, cæcum, fèces Foie, rate, intestin Salmonellose à Salmonella Typhimurium et S.Enteritidis Klebsiellose à Klebsiella Oxytoca ou K.Pneumoniae Staphylococcie ou maux de pattes à Staphylococcus aureus Pasteurellose à Pasteurella multocida Bordetellose à Bordetella bronchiseptica Mycoplsmose à Mycoplasma bovis ou M. arginini Forte mortalité des femelles avant la mise bas, diarrhée,péritonite, avortement, splénomégalie, nécrose hépatique et cæcale, métrite, péricardite et entérite. Entérite hémorragique, foie décoloré et friable, splénomégalie, œdème du poumon, ictère. Fonte musculaire prononcée, mammite, métrite, ulcères cutanés des voutes plantaires et abcès divers Ecoulement nasal, pneumonie, bronchite, pleurésie, abcès mammaires ou cutanés, métrite, torticolis Affecte généralement les voies respiratoires supérieures rarement les poumons Hyperthermie, éternuements, pneumonie Foie, organes génitaux Poumon, écouvillonnage trachéal. Pus, lait Ecouvillonnage nasal ou trachéal, pus Ecouvillonnage nasal ou trachéal, poumon Sérum 152

154 VI- Prélèvements à effectuer dans le cadre des affections bactériennes chez les ruminants, les équidés et les camélidés Tableau 43 : Nature du prélèvement en fonction de la maladie suspectée : Maladies suspectées Prélèvements Sang Sérum Ganglions Os long Divers Péripneumonie + Lymphe thoracique Tuberculose + Paratuberculose + Produit de raclage de la muqueuse rectale, fèces. intestin grêle,ganglions mésentériques Charbon bactéridien + Rate Charbon symptomatique + Muscle à tumeur Pasteurellose + Fragment du tissu pulmonaire Botulisme Foie, contenu stomacal Brucellose + Cotylédons Listériose Cerveau, avorton, cotylédons Leptospirose + Avorton Campylobactériose Vibriose Mucus vaginal et préputial, avorton Chlamydiose + Cotylédons Fibvre Q + Cotylédons Syndromes divers : Mammites Métrite Diarrhée Abcès Arthrite Lait Ecoulement vaginal Fèces Pus Liquide synovial VII- Modalités de prélèvements dans le cadre des affections bactériennes chez l abeille : Les dominantes pathologiques bactériennes chez l espèce apicole affectent le couvain plutôt que les abeilles adultes. Elles sont réputées légalement contagieuses et à déclaration obligatoire. 1- Loque américaine ou loque maligne due à Paenibacillus larvae affecte les larves après opérculation de l alvéole. 2- Loque européenne ou loque bénigne, affecte les larves dans les deux premiers jours de leurs vie, elle est due à Paenibacillus alvei. L échantillon transmis au laboratoire pour analyse doit être représentatif de la population et de la pathologie sévissant dans l exploitation, et doit être constitué de cadres contenant du couvain avec des alvéoles operculées et non operculées

155 Pour que l analyse soit conforme, il faut prendre certaines précautions : - Ne jamais placer directement plusieurs cadres les uns sur les autres, mais les envelopper séparément pour éviter que les opercules ne soient endommagés ou que les rayons ne moisissent. - Emballer les cadres dans du papier solide et placés dans une boîte pour être transportés au laboratoire. - Eviter que les rayons ne s écrasent. - Mettre sur les rayons des numéros ou des indications concernant la colonie et le rucher. - Mettre au frais si l expédition du matériel est retardée. - Accompagner le prélèvement par une fiche commémorative explicative. VIII- Modalités de prélèvements dans le cadre du contrôle de la désinfection : Un contrôle bactériologique de l efficacité des opérations de désinfection par écouvillonnage devra être réalisé après toute décontamination. Ces contrôles se prolongeront tant que les résultats ne seront pas satisfaisants. Le représentant de production, l éleveur et le vétérinaire doivent collaborer afin de trouver l origine des contaminations et apporter les actions correctives nécessaires afin d aboutir aux résultats exigés par la réglementation. Ce contrôle doit être réalisé après séchage complet des installations, et, le cas échéant, après avoir fini tout nettoyage dans les exploitations voisines et doit concerner les différents endroits du bâtiment d élevage. Juste après l application, les écouvillons, sont refermés, identifiés et acheminés au laboratoire dans les conditions appropriées. Il importe de toujours procéder de la même manière afin d établir ultérieurement des comparaisons et des estimations

156 X- Adresse de la direction générale de l INMV, des laboratoires vétérinaires régionaux de l INMV et du laboratoire de microbiologie vétérinaire de l Institut Pasteur : Désignation Adresses Téléphone/fax E.mail Direction générale BP 205,hasasan Badi,El Harrach,Alger (00213) /20 (00213) [email protected] Laboratoire central vétérinaire d Alger BP 205,hasasan Badi,El Harrach,Alger (00213) /60 [email protected] Laboratoire vétérinaire régional de Tizi-Ouzou 7,rue du stade,draa- Ben-Khedda, Tizi- Ouzou (00213) /86 (00213) [email protected] Laboratoire vétérinaire régional de Constantine BP 22, El Khroub, Constantine (00213) (00213) [email protected] Laboratoire vétérinaire régional de Tlemcen BP 568, Route Mansoura,N 7,Tlemcen (00213) (00213) lvr_ Laboratoire vétérinaire régional de Mostaganem Route Marmèche, 27120, Mostaganem (00213) (00213) lvr_ Laboratoire vétérinaire régional de Laghouat Cité El Mukam,BP 527,Laghouat (00213) (00213) lvr_ Laboratoire vétérinaire régional d El Tarf Route Ben M hidi,el Kous, El Tarf (00213) (00213) lvr_ Institut Pasteur d Algerie Annexe de Kouba.Service de microbiologie vétérinaire et d épizootiologie 34, rue Ahmed Chérifi Kouba-Alger (00213) (00213) [email protected] 155

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158 TABLES DE LECTURE EN MEDECINE HUMAINE Pr A.Benslimani Dr N. Benamrouche 157

159 158

160 Table de lecture 1 * : Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Entérobactéries Antibiotiques testés Charge des Diamètres critiques (mm) CMI critiques (µg/ml) Disques R I S R I S Commentaires Ampicilline 10µg La réponse à l ampicilline est valable pour l amoxicilline Amoxicilline +Ac.clavulanique 20/10µg /16 16/8 8/4 Céfazoline 30µg Céfalotine 30µg Cefoxitine 30µg Céfotaxime 30µg Ceftriaxone 30µg Imipénème/Meropénème 10µg Ertapénème 10µg ,5 0,25 Amikacine 30µg Gentamicine 10µg Acide nalidixique 30µg Les breakpoints des céphalosporines et de l Aztréonam ont été révisés en fonction des propriétés PK-PD et des données cliniques. Ainsi, l application de ces breakpoints dépend du respect de posologies précises : céfazoline (2g toutes les 8h), céfotaxime (1g toutes les 8h), ceftriaxone (1g toutes les 24h) Suite à la révision des breakpoints des céphalosporines, la lecture interprétative anciennement basée sur la détection ou non d une BLSE, n est plus nécessaire. La réponse R, I ou S se fait en se référant aux seuls diamètres mesurés. A souligner cependant que la détection phénotypique de la BLSE garde tout son intérêt dans les études épidémiologiques et en hygiène hospitalière. (voir chapitre recherches complémentaires). Les breakpoints des carbapénèmes ont été révisés en fonction des propriétés PK-PD et des données cliniques. L application de ces breakpoints dépend du respect des posologies suivantes : Imipénème : 500 mg toutes les 6h ou 1 g toutes les 8h, Ertapénème : 1g toutes les 24h, Méropénème : 1g toutes les 8h. La détection phénotypique d une carbapénémase par le test MHT est réservée aux études épidémiologiques (voir chapitre recherches complémentaires). La sensibilité diminuée aux fluoroquinolones est détectée chez les salmonelles isolées d infections extra-intestinales en testant l Acide nalidixique à l antibiogramme. Chloramphénicol 30µg Ne pas tester en routine sauf pour les salmonelles. Ciprofloxacine 5µg Colistine Furanes 300µg Fosfomycine 200µg Triméthoprime+ Sulfaméthoxazole 1.25/23.75µg / /38 Ne tester à l antibiogramme que pour un but diagnostique. (résistance si culture au contact du disque ou présence d une cocarde). Indiqué uniquement pour les souches d E.coli isolées d infections urinaires. La CMI est déterminée par la technique de dilution en gélose supplémentée de 25µg/ml de glucose 6-phosphate. * Tableau extrait du Document M100 S21. Vol. 31, n Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twenty-first informational supplement. ** Extrait des recommandations 2011 du Comité de l Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie 159

161 Table de lecture 2 * : Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Pseudomonas aeruginosa. Diamètres critiques (mm) CMI critiques (µg/ml) Antibiotiques testés Charge des disques R I S R I S Ticarcilline 75 µg Ticarcilline + 75/10µg / /2 ac.clavulanique Pipéracilline 100 µg Ceftazidime 30 µg Aztréonam 30 µg Imipénème 10 µg Commentaires Détecter une BLSE en plaçant le disque de TCC entre le disque de CAZ et le disque d AZM (voir chapitre tests complémentaires). L application des breakpoints pour les céphalosporines dépend du respect de posologies précises. Ceftazidime et Aztréonam : 1g toutes les 6h ou 2g toutes les 8h. Il est recommandé d informer les infectiologues, pharmaciens, comité des antibiotiques et CLIN de l hôpital, de ces nouveaux critères d interprétation. Consulter le clinicien, en particulier pour les patients spécifiques. En cas de diamètre R ou I, détection de carbapénèmases (voir recherches complémentaires). Amikacine 30 µg Gentamicine 10 µg Nétilmicine 30 µg Tobramycine 10 µg Ciprofloxacine 5µg Lévofloxacine 5µg Fosfomycine ** 50µg > Tester avec un inoculum 0,5MF dilué au 1/10 ème 50µg G6P ne pas prendre en compte la présence de colonies dans la zone d inhibition Rifampicine ** 30 µg > Tester avec un inoculum 0,5MF dilué au 1/10 ème Colistine 10µg * Tableau extrait du Document M100 S21. Vol. 31, n Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twenty-first informational supplement. ** Extraits des recommandations 2011 du Comité de l Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie 160

162 Table de lecture 3 * : Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Acinetobacter spp. Antibiotiques testés Charge des disques Diamètres critiques (mm) CMI critiques (µg/ml) R I S R I S Ticarcilline 75 µg Ticarcilline + ac.clavulanique 75/10µg /2 32/2-64/2 16/2 Pipéracilline 100 µg Céftazidime 30 µg Imipénème 10 µg Amikacine 30 µg Gentamicine 10 µg Tobramycine 10 µg Nétilmicine CMI Ciprofloxacine 5µg Lévofloxacine 5µg Doxycycline 30µg Triméthoprime+ sulfaméthoxazole 1.25/23.75µg / /38 Colistine > 2 2 Commentaires Le disque de TCC doit être placé à côté du disque de CAZ. Une synergie entre les 2 disques indique la présence d une BLSE. (voir recherches complémentaires). Si résistance à doxycycline, réponse valable pour tétracycline La colistine est testée pour usage thérapeutique. Il faut déterminer la CMI. Rifampicine** 30µg > Lecture valable pour S.maltophilia- Diluer l inoculum 0,5 MF au 1/10 ème Tester avec un inoculum 0,5MF dilué au 1/10 ème * Tableau extrait du Document M100 S21. Vol. 31, n Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twenty-first informational supplement. ** Extraits des recommandations 2011 du Comité de l Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie 161

163 Table de lecture 4 : Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Staphylococcus spp. Antibiotiques testés Pénicilline Charge Diamètres critiques (mm) CMI critiques (µg/ml) des disques R I S R I S 10 UI , ,12 Oxacilline (S.aureus) 1 µg Oxacilline (S.lugdunensis) 1 µg Cefoxitine (S.aureus et S.lugdunensis) 30 µg Oxacilline (S.C.N. S.lugdunensis) sauf 1 µg , ,25 Céfoxitine (S.C.N.sauf S.lugdunensis) 30 µg Gentamicine 10 µg Kanamycine 30 µg Amikacine 30 µg Commentaires Le test de la ß-lactamase confirme les cas douteux (voir «Tests complémentaires».) Interprétation valable pour toutes les pénicillines inactivées par les ß- lactamases (ampicilline, ticarcilline, pipéracilline.) Tester le disque de céfoxitine 30 µg pour détecter la résistance à la méticilline de S.aureus et des staphylocoques à coagulase négative. En cas de résultat intermédiaire ou de discordance entre les disques d oxacilline et de céfoxitine, se référer au chapitre «Tests complémentaires». La résistance à la céfoxitine (et à l oxacilline) signifie la résistance à toute la famille des β- lactamines. Les souches résistantes à la gentamicine sont résistantes à tous les autres aminosides sauf à la streptomycine.** Pour S.aureus, les souches résistantes à la Kanamycine doivent être interprétées «R» à l amikacine quelque soit le diamètre autour de l amikacine**. Erythromycine 15 µg Clindamycine 2µg ,5 Détecter la résistance inductible en plaçant le disque d érythromycine à côté du disque de clindamycine. En présence d une image d antagonisme, répondre «Résistance à érythromycine et clindamycine» 162

164 Suite tableau n 4 * : Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Staphylococcus spp. Antibiotiques testés Charge des Diamètres critiques (mm) CMI critiques (µg/ml) disques R I S R I S Vancomycine CMI Teicoplanine 30 µg Ofloxacine 5µg Triméthoprime+ sulfaméthoxazole 1.25/23.75µg / /38 Rifampicine 5µg Tétracycline 30µg Chloramphénicol 30µg Commentaires Le disque de vancomycine ne permet pas de différencier les souches vanco «S» et «I» de Staphylococcus aureus, ni de différencier les souches vanco «S», «I» et «R» de S.C.N., car les diamètres d inhibition sont similaires. La détermination de la CMI de vancomycine est obligatoire. Interprétation valable pour péfloxacine, lévofloxacine et Ciprofloxacine Les souches sensibles à la tétracycline, sont sensibles à la doxycycline et à la minocycline. Pristinamycine 15 µg < > 2 1 Acide fusidique** 10 µg < > 1 1 Réponse de la pristinamycine est valable pour la quinupristinedalfopristine Tester ces molécules avec un inoculum 0,5MF dilué au 1/10 ème Fosfomycine** 50 µg < > Tableau extrait du Document M100 S21. Vol. 31, n Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twenty-first informational supplement. ** Extraits des recommandations 2011 du Comité de l Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie 163

165 Table de lecture 5 * : Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Enterococcus spp. Antibiotiques testés Charge Diamètres critiques (mm) CMI critiques (µg/ml) des disques R I S R I S Commentaires Ampicilline 10µg Interprétation valable pour amoxicilline Tétracycline 30µg Interprétation valable pour doxycycline Vancomycine 30µg Teicoplanine 30µg Gentamicine Haut niveau 120µg > CMI en milieu solide (BHI agar) Streptomycine Haut niveau 300µg > 1000 > 2000 Lévofloxacine 5µg Erythromycine 15µg ,5 Furanes 300µg Rifampicine 5µg Fosfomycine 200µg Rechercher la sensibilité diminuée aux glycopeptides (voir «Tests complémentaires»). Confirmer par la CMI de vancomycine et de teicoplanine en cas de réponse R ou I ou de screening test positif. CMI en milieu liquide (BHI bouillon) CMI en milieu solide (BHA) Interprétation valable uniquement pour les souches siolées des urines. Recommandé pour les souches d E.faecalis isolées du tractus urinaire. Quinupristine-Dalfopristine 15µg Spectre limité à E.faecium vancomycine résistant. Chloramphénicol 30µg Interpretation non valable pour les souches urinaires. Interprétation valable pour thiamphénicol. *Tableau extrait du Document M100 S21. Vol. 31, n Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twenty-first informational supplement

166 Table de lecture 6 * : Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Vibrio cholerae Antibiotiques testés Charge des Diamètres critiques (mm) CMI critiques (µg/ml) Disques R I S R I S Commentaires Ampicilline 10 µg Interprétation valable pour amoxicilline Amoxicilline+Ac.clavulanique 20/10µg Le disque d AMC doit être appliqué près du disque Céfotaxime 30 µg de CTX : une image de synergie indique la présence d une BLSE (voir chapitre «Tests complémentaires». Tétracycline 30 µg Interprétation valable pour doxycycline Triméthoprime+ sulfaméthoxazole 1.25/23.75µg /152 4/76 2/38 Chloramphénicol 30 µg Colistine 10 UI Intérêt diagnostique Furanes 300 µg Lecture interprétative Acide nalidixique 30 µg Lecture interprétative Composé vibriostatique 0/ Intérêt diagnostique * Tableau extrait du Document M100 S21. Vol. 31, n Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twenty first informational supplement

167 Table de lecture 7 * : Valeurs critiques des diamètres d inhibition et des CMI pour Haemophilus spp. Antibiotiques testés Charge des Disques Diamètres critiques (mm) Valeurs critiques des CMI (µg/ml) R I S R I S Ampicilline 10 µg Amoxicilline + Ac. clavulanique Céfotaxime ou Ceftriaxone Ampicilline** Céfalotine** 20/10 µg 30 µg 2 µg 30 µg <20 < /4 --- Ofloxacine 5 µg Azithromycine 15 µg Chloramphénicol 30 µg >1 > / Commentaires Interprétation valable pour amoxicilline. La majorité des souches d H.influenzae résistantes à ampicilline et amoxicilline produisent une β-lactamase type TEM. Il faut effectuer un test de détection de la β-lactamase. Le disque d AMC doit être placé à côté du disque de CTX pour détecter une éventuelle souche productrice de BLSE. Les disques d ampicilline à 2µg et de céfalotine à 30µg servent à la détection des souches BLNAR. voir chapitre «tests complémentaires» La sensibilité diminuée à ofloxacine est détectée par le disque de NAL. Tétracycline 30 µg Réponse valable pour doxycycline Triméthoprime + sulfaméthoxazole 1,25/23,75µg /76 1/19-2/38 0,5/9,5 Acide nalidixique** 30 µg < Tester le disque de NAL avec un inoculum 0,5MF dilué au 1/10 ème Permet de détecter la sensibilité diminuée aux fluoroquinolones (faire CMI des fluoroquinolones si NAL résistant) *Tableau extrait du Document M100 S21. Vol. 31, n Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twenty-first informational supplement. ** Extraits des recommandations 2011 du Comité de l Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie 166

168 Table de lecture 8 * : Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI, pour Streptococcus spp. groupe viridans (Autres que S. pneumoniae). Antibiotiques Charge des Diamètres critiques (mm) Valeurs Critiques CMI (µg/ml) Commentaires testés disques R I S R I S Pénicilline CMI CLSI ,25-2 0,12 Ne pas tester de disque de pénicilline ou d ampicilline. Il faut déterminer la CMI de ces 2 molécules. Ampicilline CMI CLSI ,5-4 0,25 Céfotaxime 30µg Gentamicine** (CMI CA- SFM) > Erythromycine 15µg ,25 Clindamycine 2µg ,25 Tétracycline Vancomycine 30µg µg Chloramphénicol 30µg Rifampicine** 30µg < > 0, ,06 Pristinamycine** 15µg < > Lévofloxacine 5µg < Il faut déterminer la CMI de la gentamicine dans les infections sévères. Les souches sensibles à la tétracycline sont considérées comme sensibles à la doxycycline et à la minocycline. Déterminer la CMI de la vancomycine dans les infections sévères. Tester ces 2 molécules avec un inoculum 0,5 MF. * Tableau extrait du Document M100 S21. Vol. 31, n Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twenty-first informational supplement. ** Extraits des recommandations du comité de l antibiogramme 2010de la Société Française de Microbiologie 167

169 Table de lecture 9 * : Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI, pour Streptococcus spp. groupe hémolytiques Antibiotiques testés Charge des disques Valeurs critiques des diamètres d inhibition (mm) Valeurs Critiques CMI (µg/ml) R I S R I S Penicilline 10UI ,12 Ampicilline 10µg ,25 Erythromycine 15µg ,25 Clindamycine 2µg ,25 Commentaires Détecter la résistance inductible en plaçant le disque d érythromycine à côté du disque de clindamycine. En présence d une image d antagonisme, répondre «Résistance à érythromycine et clindamycine». Tétracycline 30µg Les souches sensibles à la tétracycline sont considérées comme sensibles à la doxycycline et à la minocycline. Lévofloxacine 5µg Vancomycine 30µg Pour les diamètres inférieurs à 17 mm, déterminer la CMI et vérifier l identification bactérienne. Pristinamycine** 15µg < > Tester ces 2 molécules avec un inoculum 0,5 MF. Ne pas diluer. (charges SFM) Rifampicine** 30µg < > 0, ,06 Chloramphénicol 30µg Gentamicine** 500µg > *Tableau extrait du Document M100 S21. Vol. 31, n Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twenty-first informational supplement. ** Extraits des recommandations 2011 du Comité de l Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie 168

170 Table de lecture 10 * : Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Streptococcus pneumoniae Antibiotiques testés Diamètres critiques Charge des (mm) Valeurs Critiques CMI (µg/ml) Disques R I S R I S Commentaires Pénicilline parenterale méningite) (non Pénicilline parenterale(méningite) ,12-0,06 Pénicilline orale ,06 Oxacilline 1 µg La détection des souches de pneumocoques PSDP se fait en testant un disque d oxacilline (à 1µg ou 5µg). En cas de réponse «R» ou «I», déterminer les CMI de pénicilline, amoxicilline, céfotaxime et imipénème. (Voir «Tests complémentaires»). Oxacilline** 5µg 26 Amoxicilline Céfotaxime (non méningite) Cfotaxime (Méningite) ,5 Imipénème ,25 0,5 0,12 Les valeurs critiques de l amoxicilline ne s appliquent pas au LCR car il n y a pas de valeurs critiques de CMI de l amoxicilline pour ce site. L interprétation est valable pour le céftriaxone Déterminer la CMI de l imipénème seulement dans le cas de méningite. Vancomycine 30 µg Erythromycine 15 µg , Clindamycine 2µg ,5 0,25 Lévofloxacine 5µg Tétracycline 30µg L interprétation est valable pour la doxycycline. Chloramphénicol 30 µg Rifampicine 5µg Triméthoprime+sulfaméthoxazole 1,25/23,75µg /76 1/19-2/38 0,5/9,5 Pristinamicine** 15µg < > Fosfomycine** 50µg < > Tester ces 2 molécules avec un inoculum 0,5 MF. Ne pas diluer. *Tableau extrait du Document M100 S21 Vol. 31 n Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twenty-first informational supplement. ** Extraits des recommandations 2011 du Comité de l Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie 169

171 Table de lecture 11 * : Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI, pour Neisseria gonorrhoeae Antibiotiques testés -lactamines : Péicilline Cétriaxone Charge Valeurs critiques des diamètres d inhibition (mm) Valeurs critiques des CMI (µg/ml) des Disques R I S R I S 10 UI 30 µg , ,06 0,25 Commentaires Une β-actamase est recherchée par technique chromogénique, microbiologique (test du trèfle) ou iodométrique. (voir chapitre «Tests complémentaires». Quinolones : Ciprofloxacine 5 µg ,12-0,5 0,063 Tetracyclines : Tétracycline 30 µg ,5-1 0,25 Interprétation valable pour doxycycline ; Aminosides : Spectinomycine 100 µg * Tableau extrait du Document M100 S21 Vol. 31 n Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twenty-first informational supplement

172 Table de lecture 12 * : Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI, pour Neisseria meningitidis. Concentrations critiques (mg/l) Diamètres critiques (mm) Antibiotique Charge du disque S I R S I R Pénicilline G ,06 0,125-0,25 > 0, Ampicilline ,12 0, Commentaires Ne pas tester de disque de pénicilline ou d ampicilline pour N.meningitidis. Il faut déterminer les CMI de ces 2 molécules. Une β-lactamase (très rare) est recherchée par technique chromogénique. Interprétation pour l ampicilline est valable pour l amoxicilline Spiramycine** 100µg > Antibiotique utilisé uniquement en prophylaxie. Rifampicine 5 µg 0, Chloramphénicol 30µg Acide nalidixique** 30µg < 25 La détection d une sensibilité diminuée aux fluoroquinolones est détectée en testant un disque de NAL à l antibiogramme. Si diamètre de NAL inférieur à 25, fluoroquinolones (OFX ou CIP) déterminer CMI des * Tableau extrait du Document M100 S21 Vol. 31 n Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twenty-first informational supplement **Extraits des recommandations 2007 et 2011 du Comité de l Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie 171

173 Table de lecture 13 * : Valeurs limites des diamètres des zones d inhibition pour les souches de référence utilisées pour le contrôle de qualité. Antibiotiques testés Charge des disques E. coli ATCC S. aureus ATCC P. aeruginosa ATCC27853 S. pneumoniae ATCC49619 H. influenzae ATCC49247 N. gonorrhoeae ATCC49226 Amikacine 30µg Amoxicilline + Ac clavulanique 20/10µg Ampicilline 10µg Azithromycine 15µg Ac nalidixique 30µg Non déterminé ---- Aztréonam 30µg Cefazoline 30µg Céfalotine 30µg Non déterminé ---- Céfoxitine 30µg Céfotaxime 30µg Céftriaxone 30µg Ceftazidime 30µg Ciprofloxacine 5µg Colistine 10µg Chloramphénicol 30µg Clindamycine 2µg Doxycycline 30µg Non déterminé Erythromycine 15µg Fosfomycine 200µg Non déterminé Furanes 300µg * Tableau extrait du Document M100 S21. Vol. 30, n Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twenty first informational supplement ** Pour tester les disques de gentamicine 120µg, il faut utiliser la souche de référence Enterococcus faecalis ATCC29212 : (Gentamicine (16 22 mm))

174 Table de lecture 13* : suite : Valeurs limites des diamètres des zones d inhibition pour les souches de référence utilisées pour le contrôle de qualité. Antibiotiques testés Charge des disques E. coli ATCC S. aureus ATCC P. aeruginosa ATCC S. pneumoniae ATCC H. influenzae ATCC N. gonorrhoeae ATCC Gentamicine ** 10µg Imipeneme 10µg Kanamycine 30µg Levofloxacine 5µg Nétilmicine 30µg Ofloxacine 5µg Oxacilline 1µg Pénicilline 10UI Pipéracilline 100µg Rifampicine 5µg Non déterminé Spectinomycine 100µg Tétracycline 30µg Ticarcilline 75µg Ticarcilline + Ac clavulanique 75/10µg Tobramycine 10µg Triméthoprime + sulfaméthoxazole 1.25/23.75µg Teicoplanine 30µg Vancomycine 30µg

175 Table de lecture14 * : Valeurs critiques des CMI, pour Yersinia pestis Antibiotiques testés Valeurs critiques des CMI (µg/ml) R I S Streptomycine Gentamicine Ciprofloxacine 0, Lévofloxacine 0, Tétracycline Doxycycline Chloramphénicol Sulfaméthoxazole+triméthoprime 2/38-4/76 * Tableau extrait du Document M100 S20. Vol. 30, n Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twenty informational supplement

176 Table de lecture15 ** : Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition pour Campylobacter spp. Diamètres critiques (mm) Antibiotiques testés Charge des disques S R Ampicilline 10 µg 19 < 14 Amoxicilline+acide clavulanique 10/20 µg 21 < 14 céfalotine 30 µg 18 < 12 Céfotaxime 30 µg 26 < 23 Streptomycine 10 UI 15 < 13 Gentamicine 15 µg (10UI) 18 < 16 Kanamycine 30 UI 17 < 15 Tobramycine 10 µg 18 < 16 Commentaires Compte tenu des conditions d incubation (anaérobiose, microaérophilie), les diamètres des zones d inhibition autour des disques d aminosides sont toujours réduits Erythromycine 15 UI 22 < 17 Interprétation valable pour clarithromycine Acide nalidixique 30 µg 20 < 15 Ciprofloxacine 5 µg 25 < 22 Tétracycline 30 UI 19 < 17 Chloramphénicol 30 µg 23 < 19 ** Extraits des recommandations 2011 du Comité de l Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie

177 Table de lecture 16 ** : Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition pour Helicobacter pylori. Antibiotiques testés Charge des disques Diamètres critiques (mm) S R Commentaires Erythromycine 15 UI 22 <17 Interprétation valable pour clarithromycine Ciprofloxacine 5 µg 20 < 20 Interprétation valable pour lévofloxacine. Si le diamètre est inférieur à 20 mm mesurer la CMI Table de lecture17** : Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition pour Anaérobies strictes Antibiotiques testés Charge des disques Diamètres critiques (mm) S R Amoxicilline 25 µg 21 < 17 Amoxicilline+acide clavulanique Ticarcilline 75 µg Ticarcillin+acide clavulanique 10/20 µg 21 < < 22 < 22 75/10 µg 24 < 22 Céfotaxime 30 µg 21 < 15 Imipénème 10 µg 24 < 17 Clindamycine 2 UI 15 < 15 Pristinamycine 15 µg 22 < 19 Ofloxacine 5 µg 22 < 16 Vancomycine 30 µg 17 - Rifampicine 30 µg 19 < 14 Chloramphénicol 30 µg 23 < 23 Commentaires Interprétation pour les anaérobies à Gram positif Interprétation valable pour pénicilline G et ampicilline Interprétation pour les anaérobies à gram positif Interprétation pour les anaérobies à Gram négatif Pour B. fragilis, l interprétation est valable pour la pipéracilline Lecture obligatoire à 48h, risque de faux sensible à 24h d incubation Ne pas tester pour les Bacteroides du groupe fragilis Métronidazole Comprimé 16 µg 21 < 21 Interprétation valable pour l ornidazole Kanamycine 1000 µg - < 10 Colistine 10 µg - < 10 Aide à l identification des bacilles à Gram négatif ** Extraits des recommandations 2011 du Comité de l Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie 176

178 Table de lecture 18 * : Valeurs critiques des CMI pour Brucella spp. Antibiotiques Valeurs critiques CMI (µg/ml) S I R Commentaires Streptomycine Valeur critique sensible : 16 µg/ml si incubation sous CO 2 et 8µg/ml si incubation en atmosphère ordinaire Gentamicine Tétracycline Doxycycline Sulfaméthoxazole+ triméthoprime 2/ Table de lecture19 ** : Valeurs critiques des CMI pour Corynebacterium spp. Antibiotiques Valeurs critiques CMI (µg/ml) S I R Pénicilline Cefotaxime Imipenème Gentamicine Erythromycine 0,5 1 2 Clindamycine 0, Ciprofloxacine Tétracycline Doxycycline Sulfaméthoxazole+triméthoprime 2/38-4/76 Vancomycine * ** Tableau extrait du Document M100 S20. Vol. 30, n Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twenty informational supplement Tableau extrait du Document M 45-A. Vol 26 N methods for antimicrobial dilution and disk susceptibility testing of infrequently isolated or fastidius bacteria. Approved guideline 177

179 Table de lecture 20 * : Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition pour Pasteurella spp Antibiotiques Charge des disques Valeurs critiques S I R Pénicilline 10 U Ampicilline 10 µg Amoxicilline-acide clavulanique 20/10 µg Ceftriaxone 30 µg Erythromycine 15 µg Azithromycine 15 µg Levofloxacine 5 µg Tétracycline 30 µg Doxycycline 30 µg Chloramphénicol 30 µg Sulfaméthoxazole+triméthoprime 1,25/23,75 µg * Tableau extrait du Document M 45-A. Vol 26 N methods for antimicrobial dilution and disk susceptibility testing of infrequently isolated or fastidius bacteria. Approved guideline 178

180 TABLES DE LECTURE EN MEDECINE VETERINAIRE 179

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182 Table de lecture 21 : Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Entérobactéries (En médecine vétérinaire) Antibiotiques testés Charge du Diamètres critiques (mm) CMI critiques (µg/ml) disque R I S R I S Commentaires Ampicilline 10µg La réponse pour l ampicilline est valable pour l amoxicilline Chien : Escherichia coli Amoxicilline+ Acide clavulanique* Céfalotine ,25 20/10 µg /16 16/8 8/4 30 µg Céftiofur 30 µg Bovins (Mammites à Escherichia coli) Néomycine/ Kanamycine 30 µg Gentamicine** 10 µg Espèce canine 10 µg Espèce équine 10 µg La valeur 8 doit être utilisée pour les infections du tractus urinaire, cette valeur correspond à une administration orale de 25.6mg/kg Pour l amoxicilline, elle est de 11 mg / kg administrées cinq doses consécutives à 8 heures d'intervalle. La concentration des urines produites chez le chien est > 300µ/ml Le disque d AMC doit être appliqué près du disque de CTX ou TIO, une image de synergie indique la présence d une BLSE, Apres confirmation, la souche BLSE+doit être rendue résistantes à toutes les ß-lactamases (sans tenir compte des valeurs critiques La réponse à la cefalotine est valable pour toutes les céphalosporines de première génération. La réponse pour la néomycine est valable pour la kanamycine Ces valeurs sont inspirées de la pharmacocinétique (utilisant des doses cliniques acceptables) et des données pharmacodynamiques, pour les chiens, la dose de la gentamicine modifiée est : 10mg /kg /24h en IM. Ces valeurs sont inspirées de la pharmacocinétique (utilisant des doses cliniques acceptables) et des données pharmacodynamiques, pour les chevaux, la dose de la gentamicine modifiée est : 6.6mg /kg /24h en IM

183 Suite table de lecture 21 : Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Entérobactéries (En médecine vétérinaire) Antibiotiques testés Charge du disque Diamètres critiques (mm) CMI critiques (µg/ml) R I S R I S Sulfisoxazole 300 µg Triméthoprime+ Sulfaméthoxazole 1,25/23,75µg < /76-2/38 Tétracyclines 30 µg Commentaires La réponse pour le sulfisoxazole est valable pour les sulfonamides La valeur 2/38 peut être utilisée pour les isolats des infections du tractus urinaire. Le test de sensibilité à la tétracycline est valable pour tester la sensibilité aux chlortétracyclines, doxycyclines et oxytétracyclines.les organismes sensibles à la tétracycline sont aussi considérés comme sensibles à la doxycycline mais certains organismes classés comme intermédiaires ou résistants à la tétracycline peuvent être sensibles à la doxycycline ou à la minocycline ou aux deux. Acide nalidixique/ 30 µg La réponse pour l acide nalidixique est valable pour la fluméquine fluméquine Enrofloxacine 5 µg ,5-1 0,25 Aviaire (poulet et 5 µg ,5-1 0,25 dinde) Espèce féline et 5 µg ,5 canine Marbofloxacine 5 µg (même valeurs pour l espèce féline et canine) Colistine 10 µg Nitrofurantoine** 300 µg Chloramphénicol** 30 µg Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from Animals; Approved standard Third Edition M31-A3.Vol.28 N 8.Replaces M31-A2.Vol.22 N 6.February Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from Animals;Approved Standard-Second Edition, NCCLS document M31-A2.Vol.22 N 06 May *Antibiotique testé seulement pour la recherche des β-lactamases ** Antibiotique testé uniquement dans le cadre de l épidémiosurveillance 182

184 Table de lecture 22 : Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour P. aeruginosa (En médecine vétérinaire) : Antibiotiques testés Amoxicilline+ Acide clavulanique* Charge du disque Diamètres critiques (mm) CMI critiques (µg/ml) R I S R I S 20/10 µg /16 16/8 8/4 Céftiofur* 30 µg Gentamicine** 10 µg Espèce équine 10 µg Espèce canine 10 µg Tobramycine 10 µg Commentaires Le disque d AMC doit être appliqué près du disque de TIO, une image de synergie indique la présence d une BLSE,Apres confirmation, la souche BLSE+doit être rendue résistantes à toutes les ß-lactamases (sans tenir compte des valeurs critiques ) Ces valeurs sont inspirées de la pharmacocinétique (utilisant des doses cliniques acceptables) et des données pharmacodynamiques, pour les chevaux, la dose de la gentamicine modifiée est : 6.6mg /kg /24h en IM. Ces valeurs sont inspirées de la pharmacocinétique (utilisant des doses cliniques acceptables) et des données pharmacodynamiques, pour les chiens, la dose de la gentamicine modifiée est : 10mg /kg /24h en IM. Enrofloxacine 5µg ,25 Aviaire (poulet et dinde) 5 µg ,5-1 0,25 Espèce canine (chien) 5 µg ,5 Espèce féline (chat) 5 µg ,5 Colistine 10 µg * Antibiotique testé seulement pour la recherche des β-lactamases ** Antibiotique testé uniquement dans le cadre de l épidémiosurveillance Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from Animals; Informational Supplement, NCCLS document M31-S1.Vol.24 N 17.May Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from Animals;Approved Standard-Second Edition, NCCLS document M31-A2.Vol.22 N 06 May Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from Animals; Approved standard Third Edition M31-A3.Vol.28 N 8.Replaces M31-A2.Vol.22 N 6.February

185 Table de lecture 23 : Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Staphylococcus spp. (En médecine vétérinaire) : Antibiotiques testés Charge du Diamètres critiques (mm) CMI critiques (µg/ml) disque R I S R I S Commentaires Pénicilline 10UI ,25-0,12 Pénicilline+Novobiocine 10UI/30 µg /8 2/4 1/2 Traitement des mammites pendant la lactation Amoxicilline+Acide clavulanique* Oxacilline S.aureus S.C.N Céfoxitine*** S.aureus S. lugdunensis 20/10 µg /4-4/2 1 µg 1 µg µg Erythromycine 15 µg , µg Néomycine/ Kanamycine 16 Gentamicine** 10 µg Enrofloxacine 5 µg ,5 Sulfisoxazole 250 ou 300 µg Triméthoprime+ Sulfaméthoxazole Tétracyclines 1,25/23,75 µg 4 0, , Tester le disque de céfoxitine à 30 µg pour détecter la résistance à la meticilline des S.aureus et S.C.N La résistance à la céfoxitine (et à l oxacilline) signifie la résistance à toutes les ß-lactamines N/B : **** recommandation pour la mise en évidence de la résistance à la meticilline La réponse pour la néomycine est valable pour la kanamycine La réponse pour le sulfisoxazole est valable pour les sulfonamides /76-2/38 -Valable pour Triméthoprime/ Sulfadiazine -La valeur 2/38 peut être utilisée pour les isolats des infections du tractus urinaire. 30 µg Valables pour chlortétracyclines, oxytétracyclines et doxycyclines. 30 µg La détection de la résistance à la vancomycine exige une incubation de 24h. Vancomycine** Bacitracine 130 µg < <2 Clindamycine 2 µg < ,5 La réponse pour la Clindamycine est valable pour la lincomycine. La clindamycine est plus active sur la plupart des souches de Staphylococques Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from Animals; Approved standard Third Edition M31-A3.Vol.28 N 8.. February Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from Animals; Informational Supplement, NCCLS document M31-S1.Vol.24 N 17.May Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from Animals;Approved Standard-Second Edition, NCCLS document M31-A2.Vol.22 N 06 May *Antibiotique testé seulement pour la recherche des β-lactamases ** Antibiotique testé uniquement dans le cadre de l épidémiosurveillance *** Antibiotique testé seulement pour la recherche de la meticilline **** Pour la mettre en évidence de la résistance à la meticilline, le CLSI recommande dans son communiqué de février 2008 de dépister cette résistance à l aide d un disque de céfoxitine 30 µg (FOX) 184

186 Table de lecture 24 : Valeurs critiques de la céfoxitine pour la détection des souches de souches de Staphylococcus spp. et aureus meticillino résistantes a (En médecine vétérinaire): Antibiotiques testés Organismes Diamètres critiques (mm) Commentaires R S Cefoxitine (30µg) S.aureus and S.lugdunensis Si le diamètre de la zone d inhibition est 21 mm,la souche de S.aureus est résistante à l oxacilline - Si le diamètre de la zone d inhibition est 22 mm,la souche de S.aureus est sensible à l oxacilline S.C.N sauf S.lugdunensis Si le diamètre de la zone d inhibition est 24 mm, la souche de S.C.N est résistante à l oxacilline - Si le diamètre de la zone d inhibition est 25 mm, la souche de S.C.N est résistante à l oxacilline a : L incubation se fait pendant 18h pour le S.aureus et 24h pour le S.C.N. Pour les S.C.N, dont le diamètre est 24, la lecture doit se faire après 18 h d incubation

187 Table de lecture 25 : Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Enterococcus spp (En médecine vétérinaire). Antibiotiques testés Charge du disque Diamètres critiques (mm) CMI critiques (µg/ml) R I S R I S Commentaires Pénicilline 10 UI Les souches d Entrococcus productrices de ß lactamase sont mieux détéctées par le test chromogénique céphalosporines ß lactamase Ampicilline 10 µg Les souches d Entrococcus productrices de ß lactamase sont mieux détéctées par le test chromogénique céphalosporines ß lactamase Tétracyclines 30 µg Valables pour chlortétracyclines,oxytétracyclines et doxycyclines. Enrofloxacine 5 µg ,5 Sulfisoxazole 300µg Triméthoprime+ Sulfaméthoxazole 1,25/23, /76-2/38 -Valable pour Triméthoprime/ Sulfadiazine -La valeur 2/38 peut être utilisée pour les isolats des infections du tractus urinaire. Tilmicosine 15 µg Erythromycine 15 µg ,5 Vancomycine* 30 µg La détection de la résistance à la vancomycine exige une incubation de 24h. Lincomycine 2 µg ,5 Clindamycine peut aussi être testée à la place de la Lincomycine. Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from Animals; Approved standard Third Edition M31-A3.Vol.28 N 8.February Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from Animals; Informational Supplement, NCCLS document M31-S1.Vol.24 N 17.May Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from Animals;Approved Standard-Second Edition, NCCLS document M31-A2.Vol.22 N 06 May 2002 * Antibiotique testé uniquement dans le cadre de l épidémiosurveillance 186

188 Table de lecture 26 : Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Streptococcus spp. Groupe viridans (En médecine vétérinaire) Antibiotiques testés Pénicilline (Streptococcus non S.pneumoniae) groupe viridans Streptococcus canis (groupe G, ß hemolytique ) Penicilline-novobiocine (Streptococcus agalactiae, S.dysgalactiae,S.uberis) Charge du Diamètres critiques (mm) CMI critiques (µg/ml) disque R I S R I S Commentaires 10 UI ,25-2 0,12 MH +5%de sang de mouton, incubé sous atmosphère en CO2 10 µg ,12 10 UI/ 30 µg /8 2/4 1/2 Ampicilline 10 µg ,5-4 0,25 Streptococcus canis ; (groupe G, ß hémolytique) Streptococcus equi subsp zooepidermicus ,5-0, ,5-0,25 Céfotaxime 10 µg ,5-4 0,25 Ces valeurs sont inspirées de la pharmacocinétique et des données pharmacodynamiques, pour les chiens, la dose de l amoxicilline modifiée est : 22 mg /kg toutes les 12 heures par voie per os. Ces valeurs sont inspirées de la pharmacocinétique (utilisant des doses cliniques acceptables) et des données pharmacodynamiques, pour les chevaux, la dose de l ampicilline sodium modifiée est : 22mg /kg en IM. Tétracycline 30 µg ,25 L interprétation pour Tétracycline est valable pour doxycycline Erythromycine 15 µg ,5 0,25 Vancomycine* 30 µg Chloramphénicol* 30 µg La détection de la résistance à la vancomycine exige une incubation de 24h. Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from Animals; Approved standard Third Edition M31-A3.Vol.28 N 8 * Antibiotique testé uniquement dans le cadre de l épidémiosurveillance 187

189 Table de lecture 27 : Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Heamophilus spp. (En médecine vétérinaire) Antibiotiques testés Charge du disque Diamètres critiques CMI critiques (µg/ml) R I S R S Commentaires Ampicilline 10 µg /4 4/2 Amoxicilline+ Acide clavulanique* 20/10 µg /16 8/42 Céfalotine 30 µg /4 4/2 Ceftiofur * 30 µg /4 4/2 Tétracycline 30 µg L interprétation pour tétracycline est valable pour doxycycline Enrofloxacine 5 µg ,25 Trimethoprime+ Sulfamethoxazole /76 Spectinomycine µg *Antibiotique testé seulement pour la recherche des β-lactamases Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from Animals; Informational Supplement, NCCLS document M31-S1. Vol.24 N 17.May Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from Animals; Approved Standard-Second Edition, NCCLS document M31- A2.Vol.22 N 06 May 2002 Performance Standards for Antimicrobial susceptibility testing ;sixteenth informational supplement.edition, NCCLS document M100-S16. Vol.26 n

190 Table de lecture 28 : Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Pasteurellaceae (En médecine vétérinaire): Antibiotiques testés Charge du disque Diamètres critiques (mm) CMI critiques (µg/ml) R I S R I S Commentaires Céftiofur 30 µg Enrofloxacine Volaille 5 µg ,5-1 0,25 Bovins 5 µg ,5-1 0,25 Danofloxacine 5 µg ,25 Spectinomycine 100 µg Tilmicosine 15 µg < Tétracycline 30 µg Les valeurs limites sont dérivées des données pharmacocinétiques et pharmacodynamiques de l oxytetracycline à raison de 20 mg/kg en IM. Ces valeurs sont adaptées à la forme injectable Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from Animals; Approved standard Third Edition M31-A3.Vol.28 N 8.Replaces M31-A2.Vol.22 N 6.February

191 Table de lecture 29 : Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Campylobacter jejuni et Campylobacter coli (En médecine vétérinaire) : Antibiotiques testés Charge des disques Diamètres critiques (mm) CMI critiques (µg/ml) R S R S Gentamicine * 10 µg Clindamycine 2µg Ciprofloxacine 5 µg ,5 Erythromycine 15 µg Acide Nalidixique 30 µg Tétracycline 30 µg *Antibiotique testé uniquement dans le cadre de l épidémiosurveillance Table de lecture 30 : Valeurs critiques des CMI pour Listeria spp (En médecine vétérinaire) : Contrôle de qualité : L. monocytogenes: ATCC15313 S.pneumoniae : ATCC49619 Le CLSI préconise pour l ampicilline et la pénicilline la détermination des concentrations minimales inhibitrices par la méthode de micro dilution en milieu liquide. L interpretation des résultats : Ampicilline : 2 μg/ml : souche sensible Pénicilline : 2 μg/ml : souche sensible Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from Animals; Approved standard Third Edition M31-A3. Vol.28 N

192 Table de lecture 31 : Valeurs limites desdiamètres des zones d inhibition pour les souches de référence utilisées pour le contrôle de qualité (En médecine vétérinaire) Antibiotiques testés Charge du disque E.coli ATCC P.aeruginosa ATCC S.aureus ATCC S.pneumoniae ATCC H. influenzae ATCC Pénicilline 10 UI Pénicilline+Novobiocine (10UI /30 µg) Ampicilline 10 µg Amoxicilline+Acide clavulanique 20/10 µg Oxacilline 1 µg Céfalotine 30µg Céfotaxime 30µg Céfoxitine 30µg Céftiofur 30µg Kanamycine 30µg Gentamicine 10µg Sulfisoxazole 300 µg Triméthoprime+Sulfaméthoxazole 1,25/23,75 µg Tétracycline 30µg Acide Nalidixique 30µg Enrofloxacine 5µg Marbofloxacine 5µg Colistine 10µg Nitrofurantoine 10µg Erythromycine 15µg Chloramphénicol* 30µg Vancomycine 30µg Clindamycine 2µg Tilmicosine 15 µg

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194 Toute critique écrite est la bienvenue Ce document peut être téléchargé depuis le site internet AARN

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