STANDARDISATION DE L ANTIBIOGRAMME A L ECHELLE NATIONALE

Transcription

1

2 République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de la Santé, de la Population et de la Réforme Hospitalière Ministère de l Agriculture et du Développement Rural Réseau Algérien de la Surveillance de la Résistance des Bactéries aux Antibiotiques STANDARDISATION DE L ANTIBIOGRAMME A L ECHELLE NATIONALE (MEDECINE HUMAINE ET VETERINAIRE) Document édité avec la collaboration de l OMS 6 ème Edition

3 Editions précédentes : Fascicules de Standardisation de l Antibiogramme à l échelon national: En Médecine Humaine En Médecine Vétérinaire 1 ère édition 2 ème édition ère édition ème édition ème édition ème édition ème édition ème édition ème édition 2008 Fascicules de Surveillance de la Résistance des Bactéries aux Antibiotiques: 1 ère édition 2 ème édition 3 ème édition ème édition 08 ème édition 09 ème édition 4 ème édition ème édition 5 ème édition 6 ème édition ème édition CD ROM : «Standardisation de l antibiogramme à l échelle nationale selon les recommandations de l OMS»

4 Comité d organisation : K. Rahal (Institut Pasteur d Algérie - Alger) A. Benslimani (EHS Dr Maouche - Alger) H. Tali-Maamar (Institut Pasteur d Algérie - Alger) M. F. K. Missoum (Institut National de Santé publique - Alger) S. Kechih- Bounar (LVR Draa Ben Khedda- Tizi Ouzou) H. Ammari (CHU Béni Messous - Alger) Comité des experts médicaux: W. Amhis (EPH Bologhine- Alger) H. Ammari (CHU Béni Messous - Alger) R. Belouni (CHU Blida - Blida) N. Benamrouche (Institut Pasteur d Algérie - Alger) A. Benslimani (EHS Dr Maouche - Alger) M. N.Ouar - Korichi (EHS El Hadi Flici - Alger) R.Laliam- Zenati (Institut Pasteur d Algérie - Alger) A. S. Merad (Institut Pasteur d Algérie - Alger) M. Naim (Hôpital Central de l Armée - Alger) M. F. K. Missoum (Institut National de Santé Publique - Alger) K. Rahal (Institut Pasteur d Algérie - Alger) F. Smati (CHU Constantine - Constantine) H. Tali-Maamar (Institut Pasteur d Algérie - Alger) Comité des experts vétérinaires: A. Aboun (Institut Pasteur d Algérie Alger- Annexe de Kouba) S. Bait (LVR Laghouat- Laghouat) N. Belguendouz (LVR El Tarf- El Tarf) S. Benbernou (LVR Mostaghanem- Mostaghanem) S. Benelkadi (LCV El Harrach- Alger) S. Kechih-Bounar (LVR Draa Ben Khedda- Tizi Ouzou) H. Koutchoukali (LVR Constantine- Constantine) S. Ouali Chaouche (LVR Tlemcen- Tlemcen) Collaboration technique : M. Bouheraoua (Institut Pasteur d Algérie - Alger) R. Laliam - Zenati (Institut Pasteur d Algérie - Alger) C. Mahieddine (Institut Pasteur d Algérie - Alger) Corrigé par : H. Ammari (CHU Beni Messous- Alger) A. Benslimani (EHS Dr Maouche - Alger) K. Rahal (Institut Pasteur d Algérie - Alger) H. Tali-Maamar (Institut Pasteur d Algérie - Alger) S. Kechih- Bounar (LVR Draa Ben Khedda- Tizi Ouzou) 3

5 4

6 Sommaire Préambule 11 I. Médecine humaine 13 Liste des antibiotiques à tester 15 Techniques Antibiogramme par diffusion des disques Détermination de la CMI Technique de dilution en gélose Technique de dilution en milieu liquide Technique du E-test Tests complémentaires Recherches particulières Autres bactéries 79 Automatisation des tests de sensibilité aux antibiotiques 95 Contrôle de qualité de l antibiogramme 107 Recommandations et suggestions 117 Whonet II. Médecine vétérinaire 129 Liste des antibiotiques à tester 131 III. Références bibliographiques 137 IV. Annexes 141 V. Tables de lecture en médecine humaine 157 VI. Tables de lecture en médecine vétérinaire

7 β-lactamines Pénicilline Oxacilline Cloxacilline Ampicilline Amoxicilline Amoxicilline+Ac.clavulanique Ticarcilline Ticarcilline +Ac.clavulanique Pipéracilline Céfalexine Céfazoline Céfalotine Céfpirome Céfoxitine Céfotaxime Céfotétan Céfotétan+400µg Ac boronique Céftiofur Céftriaxone Céftazidime Cloxacilline Aztréonam Imipénème Céfuroxime Pipéracilline+ tazobactam Céftazidime+ac clavulanique Acide clavulanique Imipénème+EDTA Méropénème Ertapénème PEN OXA CLOX AMP AMX AMC TIC TCC PIP LEX CZO CEF CPO FOX CTX CTT CTT+bor TIO CRO CAZ CLOXA ATM IPM CXM TAZ CAZ CLAV AC IM+ED MER ERT PHENICOLES Chloramphénicol POLYPEPTIDES Colistine GLYCOPEPTIDES Vancomycine Teicoplanine SULFAMIDES ET ASSOCIES Triméthoprime Triméthoprime+ sulfaméthoxazole QUINOLONES Acide nalidixique Ofloxacine Ciprofloxacine Lévofloxacine NITROFURANTOINES Furanes CHL COL VAN TEC TMP SXT NAL OFX CIP LVX NIT AMINOSIDES Gentamicine Gentamicine Haut niveau Streptomycine Streptomycine Haut niveau Kanamycine Amikacine Tobramycine Nétilmicine Spectinomycine Néomycine CYCLINES Tétracycline Doxycycline MACROLIDES Erythromycine Azithromycine Clindamycine Pristinamycine Spiramycine Tilmicosine GEN GEH STR STH KAN AMK TOB NET SPT NEO TCY DOX ERY AZM CLI PRI SPI TIL AUTRES Acide fusidique Rifampicine Fosfomycine Autres abréviations Céphalosporines de 1 ère génération Quinolones Ethylène- diamino-tétra-acétique Acide dipicolinique Acide boronique Mueller- Hinton Mueller- Hinton liquide ajusté en cations Mueller- Hinton base ajusté en cations Mac Farland Inhibiteur de β-lactamase Hautement chargé Pneumocoque de sensibilité diminuée à la pénicilline FUS RIF FOS C1G QUI EDTA DPA BOR MH MHLAC MHBAC MF IBL HC PSDP 6

8 Liste destableaux Tableau 1 Liste des antibiotiques à tester pour les bactéries non exigeantes 17 Tableau 2 Liste des antibiotiques à tester pour les bactéries exigeantes 18 Tableau 3 Résistances naturelles chez les entérobactéries 19 Tableau 4 Résistances naturelles chez les bacilles à Gram négatif non fermentaires 20 Tableau 5 Technique d antibiogramme (diffusion de disques antibiotiques) 27 Tableau 6 Souches de contrôle de qualité de l antibiogramme 28 Tableau 7 Tableau 8 Techniques de détermination de la CMI pour certaines bactéries selon les recommandations du CLSI 29 Techniques de détermination de la CMI des antibiotiques pour les bactéries à croissance difficile ou rarement incriminées (CLSI M100-S21 et M45) 30 Tableau 9 Schéma pour la préparation des dilutions d antibiotiques 33 Tableau 10 Schéma du mode opératoire (CMI par technique de dilution en milieu liquide) 35 Tableau 11 Tableau récapitulatif des différentes recherches complémentaires 41 Tableau 12 Recherche de la résistance à l oxacilline et interprétation des tests (méthode de diffusion des disques) 41 Tableau 13 Techniques utilisées pour la recherche de la résistance à l oxacilline 42 Tableau 14 Interprétation des tests de recherche de la résistance à l oxacilline 43 Tableau 15 Recherche de S.pneumoniae de sensibilité diminuée aux β-lactamines 47 Tableau 16 Valeurs critiques pour les CMI de S.pneumoniae 49 Tableau 17 Préparation des boîtes de cloxacilline (ou oxacilline) 55 Tableau 18 Phénotypes de résistance en fonction des différentes BLSE 57 Tableau 19 Phénotypes de résistance des souches synthétisant des céphalosporinases 67 Tableau 20 Classification des carbapénèmases 74 Tableau 21 Phénotypes de résistance en fonction des différentes carbapénèmases 74 Tableau 22 Liste des antibiotiques à tester pour les autres bactéries 81 Tableau 23 Tableau 24 CMI des macrolides, ofloxacine et triméthoprime+sulfaméthoxazole pour B. pertussis et B. parapertussis 85 Valeurs limites des CMI de la souche de référence utilisée pour le contrôle de qualité des CMI de Brucella spp. 88 Tableau 25 Pourcentage de résistance des Bacteroïdes du groupe fragilis isolés en Tableau 26 Automates permettant l identification des germes et leur antibiogramme 98 Tableau 27 Liste des antibiotiques testés par Microscan Walkaway SI par groupe de germes 99 Tableau 28 Liste des antibiotiques testés par Vitek 2 Compact par groupe de germes 100 Tableau 29 Liste des antibiotiques testés par Phoenix par groupe de germes 101 Tableau 30 Liste des antibiotiques testés par Vitek 2 compact (en médecine vétérinaire) 102 Tableau 31 Liste des groupes de germes identifiés en fonction des automates 103 Tableau 32 Souches de référence pour le contrôle de qualité interne (suivant les recommandations du fabricant) en fonction des automates 104 Tableau 33 Liste des tests utilisés en fonction des automates 105 Tableau 34 Liste des extensions des fichiers Whonet pour les laboratoires membres du réseau 127 Tableau 35 Liste des antibiotiques utilisés sur le terrain 133 Tableau 36 Liste des antibiotiques à tester pour les bactéries non exigeantes 136 Tableau 37 Liste des antibiotiques à tester pour les bactéries exigeantes 136 Tableau 38 Liste des solvants pour la préparation des solutions antibiotiques 144 Tableau 39 Molécules utilisées en médecine humaine et vétérinaire 145 Tableau 40 Prélèvements effectués et principaux germes recherchés 148 Tableau 41 Prélèvements à réaliser et pathologies suspectées 151 Tableau 42 Prélèvements à réaliser et pathologies suspectées 152 Tableau 43 Nature du prélèvement en fonction de la maladie suspectée

9 Liste des Figures Figure 1 Production de β- lactamase chez Haemophilus spp. par technique microbiologique (test du trêfle) Figure 2 CMI de la pénicilline G d une souche de S.pneumoniae (technique du E-test) 48 Figure 3 Souche de Klebsiella pneumoniae productrice de β- lactamase à spectre élargi 51 Figure 4 Souche de Pseudomonas aeruginosa productrice de β- lactamase à spectre élargi 53 Figure 5 Klebsiella pneumoniae productrice de BLSE 54 Figure 6 Test à la cloxacilline sur une souche de Klebsiella pneumoniae 55 Figure 7 Souche de P.stuartii codant pour une bla VEB-1 56 Figure 8 Algorithme décisionnel pour l étude de la sensibilité des staphylocoques aux glycopeptides 60 Figure 9 Figure 10 Figure 11 Schéma expliquant la disposition des disques d antibiotiques et les distances entre chacun d eux pour la détection des céphalosporinases 68 Recherche des céphalosporinases par la méthode des 2 disques de céfoxitine et céfotétan avec inhibiteur 69 Comparaison entre le test de confirmation pour les BLSE et le test à l acide boronique pour la détection des AmpC 71 Figure 12 Recherche des β- lactamases (BLSE et AmpC) 72 Figure 13 Recherche de céphalosporinases à partir de l extrait enzymatique 73 Figure 14 P.aeruginosa producteur de carbapénèmase de type B 76 Figure 15 Test de Hodge modifié 77 Figure 16 Schéma proposé par Rosco pour la détection des carbapénèmases KPC, métallo-βlactamases et oxacillinases 77 Figure 17 Protocole de surveillance des tests de contrôle de qualité 113 Figure 18 Utilisation du logiciel WHONET dans le monde en mai

10 Liste des Tables de Lecture Table 1 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Entérobactéries 159 Table 2 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour P.aeruginosa 160 Table 3 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Acinetobacter spp. 161 Table 4 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Staphylococcus spp. 162 Table 5 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Enterococcus spp. 164 Table 6 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Vibrio cholerae 165 Table 7 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Haemophilus spp. 166 Table 8 Table 9 Table 10 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour les Streptococcus spp. Groupe viridans (autres que S.pneumoniae) 167 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Streptococcus spp. Groupe β- hémolytiques 168 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Streptococcus pneumoniae 169 Table 11 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Neisseria gonorrhoeae 170 Table 12 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Neisseria meningitidis 171 Table 13 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition pour les souches de référence utilisées pour le contrôle de qualité 172 Table 14 Valeurs critiques des CMI pour Yersinia pestis 174 Table 15 Valeurs critiques des CMI pour Campylobacter spp. 175 Table 16 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition pour Helicobacter pylori. 176 Table 17 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition pour Anaérobies strictes. 176 Table 18 Valeurs critiques des CMI pour Brucella spp. 177 Table 19 Valeurs critiques des CMI pour Corynebacterium spp. 177 Table 20 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition pour Pasteurella spp. 178 Table 21 Table 22 Table 23 Table 24 Table 25 Table 26 Table 27 Table 28 Table 29 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Entérobactéries (Médecine vétérinaire) 181 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour P.aeruginosa (Médecine vétérinaire) 183 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Staphylococcus spp. (Médecine vétérinaire) 184 Valeurs critiques de la céfoxitine pour la detéction de souches de Staphylococcus spp. et aureus méticillino résistantes. (Médecine vétérinaire) 185 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Enterococcus spp. (Médecine vétérinaire) 186 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Streptococcus spp. Groupe viridans. (Médecine vétérinaire) 187 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Haemophilus spp. (Médecine vétérinaire) 188 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Pasteurellaceae (Médecine vétérinaire) 189 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition et des CMI pour Campylobacter jejuni et Campylobacter coli (Médecine vétérinaire) 190 Table 30 Valeurs critiques des CMI pour Listeria spp. (Médecine vétérinaire) 190 Table 31 Valeurs critiques des diamètres des zones d inhibition pour les souches de référence utilisées pour le contrôle de qualité (En médecine vétérinaire)

11 10

12 Préambule L un des rôles dévolu à la pratique bactériologique quotidienne est de guider le clinicien ou le vétérinaire dans le choix d un antibiotique pour traiter une infection bactérienne. Ce choix est rendu possible grâce aux données fournies par le test de sensibilité aux antibiotiques selon les techniques de diffusion en milieu gélosé ou par des automates. Ces données peuvent également être exploitées pour la surveillance des résistances bactériennes aux antibiotiques. Après avoir participé à l OMS (Genève) en 1994 à l élaboration des règles de standardisation de l antibiogramme : «Lignes directrices pour le contrôle de la sensibilité aux antimicrobiens à l intention des laboratoires de niveau intermédiaire situés dans des pays aux ressources limitées», nous avons appliqué les techniques préconisées par le CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute) recommandées par l OMS et agréees par de nombreux pays. La standardisation de la technique permet d échanger des données grâce à un logiciel de saisie et d exploitation fourni par l OMS : le WHONET, actuellement version 5.6. En dehors du CLSI, il existe actuellement un Comité Européen dénommé EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) qui diffuse via internet des directives concernant les tests de sensibilité aux antibiotiques. Depuis 2010, les normes CLSI et EUCAST ont évolué en tenant compte de la pharmacodynamie (PD) et de la pharmacocinétique (PK) des antibiotiques prescrits. En effet, les antibiotiques de classes différentes se caractérisent par des propriétés pharmacocinétiques et pharmacodynamiques distinctes qui doivent être prises en considération pour une optimisation du traitement et une interprétation correcte des réponses in vitro. Le CLSI et l EUCAST sont en concertation pour tenter d unifier les techniques, les milieux, les charges des disques et les valeurs critiques. Dans les années à venir, il y aura uniformisation des règles applicables par tous les pays. Il existe en Algérie un réseau de laboratoires chargé de la surveillance de la résistance des bactéries aux antibiotiques, il est dénommé : Algerian Antimicrobial Resistance Network (AARN). Son adresse Web est :

13 En ce qui concerne les vétérinaires, nous avons remarqué que la majorité des données concernaient les salmonelles isolées chez le poulet. Il a par conséquent été demandé aux vétérinaires de rédiger des fiches techniques de prélèvements sur différents animaux. Ces fiches techniques d information sont jointes en annexe et seront destinées à tous les vétérinaires. Pour être efficaces les microbiologistes devraient saisir les données quotidiennement afin de fournir chaque mois un état des lieux aux cliniciens et vétérinaires. Dans ce fascicule seront traités les tests de sensibilité aux antibiotiques selon la méthode classique et selon la technique automatisée en tenant compte des nouveaux concepts d interprétation des antibiogrammes (CLSI 2011). La partie vétérinaire sera traitée à part. Pr K. RAHAL 12

14 MEDECINE HUMAINE 13

15 14

16 LISTE DES ANTIBIOTIQUES A TESTER Dr H. Tali-Maamar 15

17 16

18 Tableau 1: Liste des antibiotiques à tester pour les bactéries non exigeantes Entérobactéries Pseudomonas spp. Acinetobacter spp. Staphylococcus spp. Enterococcus spp. Vibrio cholerae Ampicilline* (10µg) Ticarcilline (75µg) Ticarcilline (75µg) Pénicilline (10UI) Ampicilline* (10µg) Ampicilline* (10µg) Amoxicilline + Acide clavulanique (20/10µg) Ticarcilline + acide clavulanique (75/10µg) Ticarcilline + acide clavulanique (75/10µg) Oxacilline (1µg) Gentamicine (120µg) Amoxicilline + acide clavulanique (20/10µg) Céfalotine**** (30µg) Pipéracilline (100µg) Pipéracilline (100µg) Céfoxitine (30µg) Streptomycine (300µg) Céfotaxime ** (30µg) Céfazoline (30µg) Céftazidime (30µg) Céftazidime (30µg) Amikacine (30µg) Erythromycine (15µg) Tétracycline*** (30µg) Céfoxitine (30µg) Aztréonam (30µg) Imipénème (10µg) Gentamicine (10µg) Furanes (300µg) Furanes (300µg) Céfotaxime** (30µg) Imipénème (10µg) Amikacine (30µg) Kanamycine (30µg) Tétracycline *** (30µg) Colistine (10µg) Imipénème (10µg)/ Méropénème Amikacine (30µg) Gentamicine (10µg) Erythromycine (15µg) Vancomycine (30µg) Triméthoprime + sulfaméthoxazole (10µg) (1.25/23.75µg) Ertapénème (10µg) Gentamicine (10µg) Tobramycine (10µg) Clindamycine (2µg) Teicoplanine (30µg) Acide nalidixique (30µg) Amikacine (30µg) Tobramycine (10µg) Nétilmicine (CMI seulement) Pristinamycine (15µg) Lévofloxacine (5µg) Composé vibriostatique O/129***** Gentamicine (10µg) Nétilmicine (30µg) Ciprofloxacine (5µg) Ofloxacine (5µg) Rifampicine (5µg) Chloramphénicol (30µg) Acide nalidixique (30µg) Ciprofloxacine (5µg) Lévofloxacine (5µg) Chloramphénicol (30µg) Fosfomycine (200µg) Ciprofloxacine (5µg) Lévofloxacine (5µg) Doxycycline*** (30µg) Vancomycine (CMI seulement) Quinupristine -dalfopristine (15µg) Colistine (10µg) ***** Fosfomycine (50µg) +50µg G6P Triméthoprime + sulfaméthoxazole (1.25/23.75µg) Chloramphénicol (30µg) Rifampicine (30µg) Colistine (CMI seulement) Rifampicine (5µg) Teicoplanine (30µg) Chloramphénicol (30µg) Furanes (300µg) Colistine (10µg) Rifampicine (30µg) Triméthoprime + sulfaméthoxazole (1.25/23.75µg) Triméthoprime + sulfaméthoxazole Tétracycline*** (30µg) (1.25/23.75µg) Fosfomycine (200µg) Acide fusidique (10µg) Fosfomycine (50µg) Composé vibriostatique O/129***** * : réponse d interprétation valable pour l amoxicilline ** : réponse d interprétation valable pour céftriaxone, céfixime, céfoperazone, céfdinir et céfpodoxime *** : réponse d interprétation valable pour tétracycline et doxycycline **** : réponse d interprétation valable pour céfalexine, céfaclor ***** : antibiotique testé à visée diagnostic. 17

19 Tableau 2 : Liste des antibiotiques à tester pour les bactéries exigeantes spp. N.gonorrhoeae N.meningitidis N.meningitidis S.pneumoniae Streptococcus spp. s Streptococcus β- Haemophilus spp.. Groupe G viridans s hémolytique Ampicilline* (10µg) Pénicilline (10UI) Pénicilline (CMI) Pénicilline (CMI) Pénicilline (CMI) Pénicilline (10UI) Ampicilline (2µg) Céftriaxone** (30µg) Ampicilline* (CMI) Oxacilline**** (1 µg) Ampicilline (CMI) Ampicilline* (10UI) Amoxicilline + Ac clavulanique (20/10µg) Tétracycline*** (30µg) Spiramycine (100µg) Amoxicilline pour autre que LCR (CMI) Céfotaxime (30µg) Erythromycine (15µg) Céfalotine (30µg) Spectinomycine (100µg) Rifampicine (5µg) Céfotaxime (CMI) Pristinamycine (15µg) Clindamycine (2µg) Céfotaxime**(30µg) Ciprofloxacine (5µg) Chloramphénicol (30µg) Imipénème (CMI) Tétracycline (30µg) Pristinamycine (15µg) Tétracycline (30µg) Acide nalidixique (30µg) Erythromycine (15µg) Gentamicine (CMI pour infections graves) Tétracycline (30µg) Azithromycine (15µg) Clindamycine (2µg) Vancomycine (30µg) Lévofloxacine (5µg) Acide nalidixique (30µg) Pristinamycine (15µg) Chloramphénicol (30µg) Vancomycine (30µg) Ofloxacine (5µg) Chloramphénicol (30µg) Rifampicine (30µg) Chloramphénicol (30µg) Chloramphénicol (30µg) Rifampicine (5µg) Erythromycine (15µg) Gentamicine (500µg) Triméthoprime + sulfaméthoxazole (1.25/23.75µg) Triméthoprime + sulfaméthoxazole(1.25/23.75µg) Lévofloxacine (5µg) Rifampicine (30µg) Vancomycine (30µg) Clindamycine (2µg) Lévofloxacine (5µg) Tétracycline (30µg) Fosfomycine (50µg) * : réponse d interprétation valable pour l amoxicilline ** : réponse d interprétation valable pour céftriaxone, céfixime, céfopérazone, céfdinir et céfpodoxime *** : réponse d interprétation valable pour tétracycline et doxycycline **** : réponse d interprétation pour la pénicilline, (voir chapitre «recherches complémentaires») 18

20 RESISTANCES NATURELLES AUX ANTIBIOTIQUES DES PRINCIPALES ESPECES BACTERIENNES 1- BACILLES A GRAM NEGATIF NON EXIGEANTS : Pénicilline G, oxacilline, macrolides (érythromycine), lincosamides (lincomycine), streptogramines (pristinamycine), acide fusidique, glycopeptides (vancomycine) Entérobactéries : Tableau 3 : Résistances naturelles chez les entérobactéries Bactérie AMP/AMX AMC TIC/PIP C1G FOX GEN TCY COL NIT Klebsiella spp. R R C.koseri R R C.freundii R R R R E.cloacae R R R R E.aerogenes R R R R S.marcescens R R R R P.mirabilis R R R P.vulgaris R R R R R M.morganii R R R R R R P.stuartii R R R R R R R Y.enterocolitica R R R R R R : résistance naturelle 19

21 1.2- Autres Bacilles à Gram négatif non exigeants : Pseudomonas aeruginosa : aminopénicillines, céphalosporines 1 ère et 2 ème génération, céfotaxime, céftriaxone, kanamycine, tétracyclines, chloramphénicol, triméthoprime, quinolones. Acinetobacter baumannii, Acinetobacter calcoaceticus : aminopénicillines, céphalosporines 1 ère et 2 ème génération, fosfomycine, triméthoprime, furanes. Autres BGN non fermentaires : aminopénicillines, céphalosporines 1ère et 2ème générations et ertapénème. Tableau 4 : Résistances naturelles chez les bacilles à Gram négatif non fermentaires Bactéries TIC TCC PIP CTX CAZ IPM QUI CHL TMP FOS COL S.maltophilia R R R R R R B.cepacia R R R R R R R R A.denitrificans R C.meningosepticum R R R R R R R R O.anthropi R R R R R R : résistance naturelle Aeromonas Aminopénicillines (sauf Aeromonas trota), céphalosporines de 1 ère et de 2 ème génération (sauf Aeromonas veronii), ertapénème. 2- BACILLES A GRAM NEGATIF EXIGEANTS Haemophilus : macrolides (cycle à 16 atomes : spiramycine, josamycine, midécamycine), lincosamides. 3- COQUES A GRAM POSITIF Mécillinam, aztréonam, quinolones, colistine. Staphylococcus saprophyticus : fosfomycine, novobiocine. Staphylococcus cohnii et Staphylococcus xylosus : novobiocine, lincomycine. Micrococcus : furanes. Streptococcus (dont Streptococcus pneumoniae) : aminoglycosides (bas niveau), péfloxacine. Enterococcus : oxacilline, céphalosporines, ertapénème, aminoglycosides (bas niveau), péfloxacine, fosfomycine (bas niveau), sulfamides. Enterococcus faecalis : lincosamides, streptogramines A. Enterococcus faecium : Imipénème. 20

22 Enterococcus gallinarum - Enterococcus casseliflavus / flavescens : vancomycine. Pediococcus Leuconostoc : glycopeptides. 4- BACILLES A GRAM POSITIF Mécillinam, aztréonam, colistine, quinolones. Listeria monocytogenes : oxacilline, céphalosporines, lincosamides, fosfomycine, fluoroquinolones (bas niveau). Bacillus cereus : pénicilline G, amino et carboxy- pénicillines, céphalosporines. 5- COQUES A GRAM NEGATIF Neisseria : triméthoprime, glycopeptides; Neisseria meningitidis - Neisseria gonorrhoeae : lincosamides, colistine, Branhamella catarrhalis : lincosamides, triméthoprime. Moraxella : triméthoprime. 6- BACTERIES ANAEROBIES STRICTES Aminosides, aztréonam (sauf Fusobacterium), triméthoprime, quinolones. Bacteroides du groupe fragilis : aminopénicillines, céphalosporines 1 ère génération, colistine, polymyxine B, glycopeptides, fosfomycine. Prevotella : glycopeptides, fosfomycine. Porphyromonas : fosfomycine, colistine, polymyxine B. Clostridium difficile : céphalosporines, clindamycine. Clostridium innocuum : vancomycine (bas niveau). Actinomyces Propionibacterium : céphalosporines 1 ère génération, nitro-imidazolés. 21

23 22

24 TECHNIQUES Pr A. Benslimani 23

25 24

26 1. ANTIBIOGRAMME PAR DIFFUSION DES DISQUES 1.1- Milieu pour antibiogramme : Il doit être coulé en boîtes de Petri sur une épaisseur de 4 mm Les géloses doivent être séchées avant l emploi 1.2- Préparation de l inoculum : A partir d une culture pure de 18 à 24 h sur milieu d isolement approprié, racler à l aide d une anse de platine quelques colonies bien isolées et parfaitement identiques. Dans le cas de Streptococcus spp. et d Haemophilus spp. utiliser un écouvillon pour prélever plus facilement les colonies bactériennes. Bien décharger l anse ou l écouvillon dans 5 à 10 ml d eau physiologique stérile à 0,9%. Dans le cas de Neisseria gonorrhoeae, décharger l anse dans 1 à 2 ml de tampon phosphate stérile à ph 7,2. Bien homogénéiser la suspension bactérienne, son opacité doit être équivalente à 0,5 MF ou à une D.O. de 0,08 à 0,10 lue à 625 nm. L utilisation d un densitomètre est fortement souhaitable. La suspension bactérienne à 0,5 MF doit être diluée au 1/10 ème dans le cas où l on teste des molécules à charge SFM (c'est-à-dire des antibiotiques pour lesquels il n existe pas encore de critères d interprétation dans la technique CLSI) Ensemencement : Tremper un écouvillon stérile dans l inoculum. L essorer en le pressant fermement (et en le tournant) contre la paroi interne du tube, afin de décharger au maximum. Frotter l écouvillon sur la totalité de la surface gélosée, sèche, de haut en bas, en stries serrées. Répéter l opération 2 fois, en tournant la boîte de 60 à chaque fois, sans oublier de faire pivoter l écouvillon sur lui-même. Finir l ensemencement en passant l écouvillon sur la périphérie de la gélose. Dans le cas où l on ensemence plusieurs boîtes de Petri, il faut recharger l écouvillon à chaque fois Application des disques d antibiotiques : Il est préférable de ne pas mettre plus de 6 disques d antibiotique sur une boîte de 90 mm. Pour les bactéries exigeantes (Streptococcus spp., Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Haemophilus spp..), ne pas mettre plus de 4 disques par boîte de 90 mm. Presser chaque disque d antibiotique à l aide de pinces bactériologiques stériles et ne pas déplacer les disques après application. La liste des antibiotiques à tester selon la bactérie isolée, figure dans les tableaux n 1 et Conditions d incubation : Respecter la température, l atmosphère et la durée d incubation recommandées pour chaque bactérie (voir tableau n 5). 25

27 1.6- Lecture : Mesurer avec précision les diamètres des zones d inhibition à l aide d un pied à coulisse. Pour les bactéries testées sur Mueller-Hinton simple, les mesures seront prises en procédant par transparence à travers le fond de la boîte de Petri fermée. Pour les bactéries testées sur Mueller-Hinton au sang, les mesures de diamètres de zones d inhibition seront prises, boîte de Petri ouverte et bien éclairée. Comparer les résultats obtenus, aux valeurs critiques figurant dans les tables de lecture correspondantes. Classer la bactérie dans l une des catégories S, R ou I. 26

28 Tableau 5 : Technique d antibiogramme (diffusion de disques antibiotiques). Microorganismes Milieu pour antibiogramme Inoculum microbien Conditions d incubation Entérobactéries Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter spp. Staphylococcus spp. Enterococcus spp. Vibrio cholerae - Vibrio spp. Aeromonas spp.- Plesiomonas spp. Autres bactéries non exigeantes Gélose Mueller-Hinton 0,5 MF en eau physiologique ème (diluer au 1/10 è m pour les charges CA-SFM) ) 18 heures (à prolonger pour OXA et VAN/TEC) 35 C Atmosphère ordinaire Streptococcus spp. 0,5 MF en eau physiologique heures 35 C 5%C02 Pasteurella spp. Campylobacter jejuni/coli (selon SFM) Gélose Mueller-Hinton + 5% sang de mouton heures 35 C Atmosphère ordinaire 0,5 MF en eau physiologique à diluer au 1/10 ème 18 à 24 heures 35 C-37 C Microaérophilie Neisseria gonorrhoeae Gélose GC + 1% supplément* 0,5 MF en tampon Phosphate ph 7, heures 35 C 5% C02 Neisseria meningitidis Gélose Mueller-Hinton + 5% sang de mouton 0,5 MF en tampon PBS ou eau physiologique heures 35 C 5% C02 Atmosphère humidifiée Haemophilus spp. Gélose Haemophilus Test Medium* 0,5 MF en eau physiologique ème (diluer ( au a 1/10 1 è m pour les charges CA-SFM) ) heures 35 C 5% C02 * : voir composition en annexe 27

29 1.7- Contrôle de qualité : Pour chaque espèce bactérienne testée, un contrôle de qualité est réalisé dans les mêmes conditions de test et d incubation (voir tableau n 6). Tableau 6: Souches de contrôle de qualité de l antibiogramme Microorganismes Souche de référence ATCC Entérobactéries Escherichia coli ATCC Staphylococcus spp. Staphylococcus aureus ATCC Staphylococcus aureus ATCC Staphylococcus aureus ATCC Pseudomonas spp. Acinetobacter spp. Pseudomonas aeruginosa ATCC Enterococcus spp. Staphylococcus aureus ATCC Enterococcus faecalis ATCC Vibrio cholerae et Vibrio spp. Escherichia coli ATCC Haemophilus spp. Haemophilus influenzae ATCC Streptococcus spp. Groupe viridans Pasteurella spp. Streptococcus spp. Groupe β-hémolytique Streptococcus pneumoniae ATCC Neisseria gonorrhoeae Neisseria gonorrhoeae ATCC Neisseria meningitidis Streptococcus pneumoniae ATCC Campylobacter spp. Staphylococcus aureus ATCC C 16-18h atmosphère ordinaire 2. DETERMINATION DE LA CMI : Dans le cas de Neisseria meningitidis, Streptococcus spp. Groupe viridans, Streptococcus pneumoniae et Listeria monocytogenes, la technique de l antibiogramme n est pas validée pour certaines molécules antibiotiques. Pour ces molécules, la sensibilité de ces germes est appréciée uniquement par la détermination de la CMI, soit par la technique de référence, soit par une technique autre, recommandée par des travaux publiés. Ces techniques sont résumées dans le tableau n 7. Certaines bactéries à croissance difficile et/ou rarement incriminées dans les infections ont fait l objet d une standardisation de la technique d étude de la sensibilité aux antibiotiques selon les recommandations du CLSI (M100 - S21 et M45-A). La technique de diffusion des disques n est pas validée pour ces germes. La technique recommandée est la détermination de la CMI par dilution en milieu Mueller-Hinton liquide ajusté en cations. Ce milieu est supplémenté de 2,5 à 5% v/v de sang de cheval lysé et parfois de facteurs de croissance selon les espèces bactériennes testées. La technique de CMI pour les bactéries particulières est résumée dans le tableau n

30 Tableau 7 : Techniques de détermination de la CMI pour certaines bactéries selon les recommandations du CLSI* Microorganismes Antibiotiques Technique T recommandée Milieu M Inoculum Conditions d incubation Neisseria meningitidis Streptococcus spp. Groupe viridans Pénicilline G Amoxicilline Pénicilline G Ampicilline Dilution en gélose Dilution en milieu liquide Dilution en gélose MHBAC + 5% sang de mouton frais défibriné MHLAC+ 2-5% sang de cheval hémolysé MH + 5% sang de mouton frais 1 MF Eau physiologique ou PBS Spots de 1µl 1 MF Eau physiologique ou PBS 0,5 MF Eau physiologique H 35 C ± 2 C Sous 5%C02 + humidité 35 C± 2 C H 5% C02 Streptococcus pneumoniae Pénicilline G Amoxicilline (sauf LCR) Céfotaxime Imipénème Dilution en milieu liquide MHLAC %(V/V) sang de cheval hémolysé et défibriné 0,5 MF Eau physiologique H 35 C ± 2 C Air ambiant Listeria monocytogenes Pénicilline G Ampicilline Dilution en milieu liquide MHLAC % sang de cheval hémolysé 0,5 MF Eau physiologique 35 C H Bordetella pertussis Erythromycine Josamycine Azithromycine clarithromycine Dilution en gélose Gélose MH + 10% sang de cheval frais 0,5 MF en MHLAC dilué au 1/10 ème Spots de10 4 UFC/ml (1 à 2 µl) H 35 C Campylobacter jejuni/coli Erythromycine Ciprofloxacine Tetracycline Doxycycline Dilution en milieu liquide MHLAC+ 2-5% sang de cheval hémolysé 0,5 MF Eau physiologique C 48h Ou 42 C 24h microaérophilie MHLAC : Mueller-Hinton liquide ajusté en cations MHBAC : Mueller-Hinton base ajusté en cations * consulter le chapitre : tests complémentaires pour S.aureus, Enterococcus spp. et Acinetobacter spp Souches de référence S.pneumoniae ATCC S.pneumoniae ATCC S.pneumoniae ATCC S.pneumoniae ATCC L.monocytogenes ATCC B.pertussis ATCC 9797 S.aureus ATCC Campylobacter jejuni ATCC Autre technique validée E-Test (inoculum à 0,5 MF) Dilution en milieu liquide MHLAC % V/V sang de cheval E-Test E-Test ou dilution en gélose E-Test excepté pour Erythromycine E-Test (concordance moyenne de 61,9%) 29

31 Tableau 8: Techniques de détermination de la CMI des antibiotiques pour les bactéries à croissance difficile ou rarement incriminées (CLSI M100 IS21 et M45) Microorganismes Milieux Conditions d incubation Souches de référence Autres techniques validées (réf bibliographique) Abiotrophia spp. Granulicatella spp. MHLAC + 2.5I5% sang de cheval lysé % PyridoxalIHCL 20I24H 35 C atm ordinaire S.pneumoniae ATCC 4V61V Aucune Bacillus spp. Autre que B.anthracis MHLAC 16I20H 35 C atm ordinaire S.aureus ATCC 2V213 CMI par dilution en gélose MH (CAISFM) Corynebacterium spp. Erisypelothrix rhusiopathiae MHLAC + 2.5I5% de sang de cheval lysé MHLAC + sang de cheval lysé (2.5I5% v/v) 24I48H 35 C atm ordinaire 20I24 H 35 C atm ordinaire S.pneumoniae ATCC 4V61V E.coli ATCC 25V22 pour Gentamicine S.pneumoniae ATCC 4V61V I Antibiogramme(CAISFM) I EITest Aucune HACCEK* Lactobacillus spp. Leuconostoc spp. MHLAC + sang de cheval lysé (2.5I5% v/v) MHLAC + sang de cheval lysé (2.5I5% v/v) MHLAC + sang de cheval lysé (2.5I5% v/v) 24I48H 35 C Sous C02 20I24 H 35 C atm ordinaire 20I24 H 35 C atm ordinaire S.pneumoniae ATCC 4V61V S.pneumoniae ATCC 4V61V E.coli ATCC 25V22 pour Gentamicine S.pneumoniae ATCC 4V61V E.coli ATCC 25V22 pour Gentamicine IH : antibiogrammei EItest IA : EItest IC : antibiogrammei EItest ICapnocytophaga : EITest IE : antibiogrammei EItest IK : antibiogrammei EItest EITest sauf aminosides (5) I Antibiogramme IEITest (sauf aminosides) (5) Moraxella catarrhalis MHLAC 20I24 H 35 C atm ordinaire S.aureus ATCC2V213 Antibiogramme (5) Pediococcus spp. Brucella spp. Yersinia pestis MHLAC + sang de cheval lysé (2.5I5% v/v) MHLAC + sang de cheval lysé (2.5I 5% v/v) MHLAC 20I24 H 35 C atm ordinaire 48 H 35 C±2 Sous C02 24 I 48 H 35 ±2 S.pneumoniae ATCC 4V61V E.coli ATCC 25V22 pour Gentamicine Brucella melitensis ATCC E.coli ATCC 25V22 I CMI par dilution en gélose IEITest (sauf aminosides) Iantibiogramme (5) I EI Test (milieu MH + Sang de cheval, inoculum à 0,5MF) I CMI par dilution en gélose Aucune Bacillus anthracis MHLAC 16I 20 H 35 ±2 E.coli ATCC 25V22 S.aureus ATCC 2V213 Aucune Lignes grisées : manipulations en laboratoire de niveau de sécurité 2 ou 3 HACCEK* : Haemophilus, Actinobacillus, Capnocytophaga, Cardiobacterium, Eikenella et Kingella 30

32 2.1- Technique de dilution en gélose : a- Milieu de culture : - Milieu Mueller-Hinton en gélose - Il est liquéfié par ébullition puis maintenu à la température de surfusion (45 C) jusqu au moment de l emploi. - Il peut être supplémenté en sang frais ou autres en fonction des microorganismes testés : voir tableaux 7 et 8. b- Préparation des boîtes de dilutions d antibiotique (voir tableau n 9) : Peser 51,20 mg de poudre titrée d antibiotique. Diluer dans le volume de solvant approprié pour obtenir une concentration stock de 5120 µg/ml (solution-mère). Procéder aux dilutions semi-logarithmiques de raison 2 (de demi en demi), dans le solvant aproprié, jusqu à la concentration finale de 1,25 µg/ml. Répartir 2 ml de chaque dilution d antibiotique, dans la boîte correspondante en procédant de la plus faible concentration à la concentration la plus élevée. Ne pas changer de pipette. Compléter chaque boîte avec 18 ml de milieu Mueller-Hinton liquéfié et homogénéiser délicatement, sans faire de bulle, le contenu des boîtes par des mouvements circulaires. La dilution obtenue (1/10 ème ) dans chaque boîte aboutit à une concentration finale allant de 512 µg/ml à 0,125 µg/ml. La gamme de dilution peut être etendue selon les valeurs souhaitées. Préparer une boîte témoin sans antibiotique en remplaçant le volume d antibiotique par le même volume d eau physiologique stérile. Après solidification, sécher les boîtes, couvercle en place, pendant 30 mn. c- Préparation de l inoculum bactérien : Préparer un inoculum standard à une turbidité de 0,5 MF, ce qui correspond à CFU/ml en moyenne. Utiliser l eau physiologique (eau ø) à 0,9% pour la préparation de la suspension directe à partir d une culture jeune de la bactérie à tester. Déposer sous forme de spots à la surface de la gélose, 10 4 CFU/ml par spots de 5 à 8 mm. Si on utilise un applicateur de 2µl par spot, diluer l inoculum au 1/10 ème en eau physiologique. Si on utilise un applicateur de 0,1 à 0,2µl par spot, ne pas diluer l inoculum de départ (0,5 MF). d- Dépôt des spots bactériens : Déposer les spots dans les 15 mn suivant la préparation de l inoculum. Marquer la boîte de dilution d antibiotique pour localiser et identifier chaque spot. Appliquer chaque spot sur la gélose, en utilisant un appareil de Steers, une anse calibrée ou une pipette automatique à cône stérile. 31

33 Commencer par la boîte témoin, puis déposer les spots sur les différentes boîtes en allant de la plus faible concentration à la concentration la plus élevée. Terminer en appliquant les spots sur une 2 ème boîte témoin. Etaler une goutte de chaque souche testée, sur une gélose non sélective et incuber une nuit (détection des cultures mixtes, obtention d une culture jeune). e- Incubation : Laisser les boîtes à température ambiante, couvercle vers le haut, jusqu à absorption de l humidité (séchage des spots, pas plus de 30 mn). Renverser les boîtes et incuber à 35 C±2 pendant heures. Ne pas incuber en atmosphère à forte concentration de C02 si cela n est pas recommandé (le C02 perturbe le ph du milieu). Incuber Neisseria meningitidis et Streptococcus spp. dans une atmosphère contenant 5% de C02. f- Lecture des CMI : Placer les boîtes sur une surface sombre, non réflective Noter la CMI (la plus faible concentration d antibiotique inhibant toute croissance bactérienne visible). Ne pas prendre en considération 2 colonies ou un léger film Si on note plus de 2 colonies persistantes ou si l on constate une réapparition de la culture au-delà de la CMI, vérifier la pureté de l inoculum et refaire le test. Comparer les résultats obtenus, aux valeurs critiques figurant dans les tables de lecture correspondantes. Classer la bactérie dans l une des catégories S, R ou I. 32

34 Tableau 9 : Schéma pour la préparation des dilutions d antibiotique Etape Concentration (µg/ml) ATB (ml) Diluant (ml) Concentration intermédiaire Concentration finale dans la gélose (µg/ml) Solution mère ,5 1, ,5 0,25 0, Technique de dilution en milieu liquide : a- Milieu de culture : C est le Mueller-Hinton liquide, recommandé pour tester les microorganismes couramment isolés, à croissance rapide, aérobies ou aérobie-anaérobies facultatifs. Le milieu MH liquide est ajusté en cations (MHLAC) Le MHLAC est supplémenté avec 2.5 à 5% (v/v) de sang hémolysé de cheval (voir mode de préparation en annexe) pour la croissance des bactéries difficiles ou d isolement peu courant. b- Gamme des dilutions d antibiotique : Dissoudre 10,24 mg de poudre titrée d antibiotique dans le volume adéquat du solvant correspondant, pour obtenir une solution mère à 1024 µg/ml. Répartir dans des tubes stériles le milieu MHLAC supplémenté ou non, à raison de 0,25 ml par tube ou bien à raison de 25 µl par cupule en microplaque à fond rond. Réaliser à partir de la solution mère, les dilutions semi-logarithmiques de raison 2 ; on obtient des concentrations intermédiaires allant de 512 µg/ml à 0,063 µg/ml (voir tableau n 10). c- Préparation de l inoculum bactérien : Préparer a partir d une culture pure de 48 heures, une suspension de la souche à étudier, dans 5 à 10 ml d eau physiologique stérile (ou de bouillon MHLAC), d une densité équivalente à 0,5 MF (10 8 CFU/ml) Diluer la suspension d opacité 0,5 MF au 1/10 ème pour distribuer un inoculum de CFU/ml de germe dans chaque tube ou cupule. 33

35 Vérifier par ailleurs, la pureté de chaque souche en en effectuant l isolement sur gélose non sélective. d- Distribution de l inoculum bactérien : Elle doit se faire dans les 15 mn suivant la préparation de l inoculum Inoculer les tubes d antibiotiques (ou les cupules de la microplaque) avec 50 µl de suspension bactérienne par tube (ou 5 µl par cupule). Pour chaque série, réaliser un témoin sans antibiotique (tube ou cupule). e- Distribution du milieu MHLAC : Répartir dans les tubes 0.70ml de MHLAC (ou 70µl / cupule) ; la concentration d antibiotique obtenue va ainsi de 128 µg/ml à µg/ml. f- Incubation : Recouvrir la plaque d un couvercle en plastique (ou boucher les tubes) Les conditions d incubation seront appliquées en fonction des germes testés (voir tableaux n 7 et 8). g- Lecture : La CMI de chaque antibiotique correspond au 1 er tube ou à la 1 ère cupule CLAIRE (pas de culture par rapport au témoin sans antibiotique). Comparer la CMI lue, aux CMI critiques correspondantes à chaque antibiotique testé (tables de lecture). Classer les bactéries dans la catégorie R, I ou S selon le résultat. 34

36 Tableau 10: Schéma du mode opératoire (CMI par technique de dilution en milieu liquide) N tube ou cupule Volume de la solution d antibiotique à rajouter Concentration intermédiaire (μg /ml) Volume MH suplémenté en sang ou non Inoculum Concentration finale/ tube ou cupule (vol final:1ml/tube ou 100µl /cupule) 1 0,25ml (ou 25 µl /cupule) de la solution à 1024μg/ml 512 0,70 ml (ou 70µl) 50µl /tube (ou 5µl /cupule) 128 μg/ml 2 0,25ml (ou 25 µl /cupule) de la solution à 512μg/ml 256 0,70 ml (ou 70µl) 50µl /tube (ou 5µl /cupule) 64 μg/ml 3 0,25ml (ou 25 µl /cupule) de la solution à 256μg/ml 128 0,70 ml (ou 70µl) 50µl /tube (ou 5µl /cupule) 32 μg/ml 4 0,25ml (ou 25 µl /cupule) de la solution à 128μg/ml 64 0,70 ml (ou 70µl) 50µl /tube (ou 5µl /cupule) 16 μg/ml 5 0,25ml (ou 25 µl /cupule) de la solution à 64μg/ml 32 0,70 ml (ou 70µl) 50µl /tube (ou 5µl /cupule) 8 μg/ml 6 0,25ml (ou 25 µl /cupule) de la solution à 32μg/ml 16 0,70 ml (ou 70µl) 50µl /tube (ou 5µl /cupule) 4 μg/ml 7 0,25ml (ou 25 µl /cupule) de la solution à 16μg/ml 8 0,70 ml (ou 70µl) 50µl /tube (ou 5µl /cupule) 2 μg/ml 8 0,25ml (ou 25 µl /cupule) de la solution à 8μg/ml 4 0,70 ml (ou 70µl) 50µl /tube (ou 5µl /cupule) 1 μg/ml 9 0,25ml (ou 25µl /cupule) de la solution à 4μg/ml 10 0,25ml (ou 25µl /cupule) de la solution à 2μg/ml 2 0,70 ml (ou 70µl) 1 0,70 ml (ou 70µl) 50µl /tube (ou 5µl /cupule) 50µl /tube (ou 5µl /cupule) 0,5 μg/ml 0,25 μg/ml 11 0,25ml (ou 25 µl /cupule) de la solution à 1μg/ml 0,5 0,70 ml (ou 70µl) 50µl /tube (ou 5µl /cupule) 0,125 μg/ml 12 0,25ml (ou 25 µl /cupule) de la solution à 0.5μg/ml 0,25 0,70 ml (ou 70µl) 50µl /tube (ou 5µl /cupule) 0,063 μg/ml 13 0,25ml (ou 25 µl /cupule) de la solution à 0,25μg/ml 0,125 0,70 ml (ou 70µl) 50µl /tube (ou 5µl /cupule) 0,032 μg/ml 14 0,25ml (ou 25 µl /cupule) de la solution à 0,125μg/ml 0,063 0,70 ml (ou 70µl) 50µl /tube (ou 5µl /cupule) 0,016 μg/ml T 0,70 ml (ou 70µl) 50µl /tube (ou 5µl /cupule) 35

37 2.3- Technique du E-Test : C est une technique de détermination de la CMI, validée pour les bactéries non exigeantes et pour un certain nombre de bactéries exigeantes (voir tableaux n 7 et n 8). a- Milieu : Il doit être coulé en boîtes de Petri sur une épaisseur de 4 mm Les géloses doivent être séchées avant l emploi. b- Préparation de l inoculum : A partir d une culture pure de 18 à 24 h sur milieu d isolement approprié, racler à l aide d une anse de platine quelques colonies bien isolées et parfaitement identiques. Dans le cas de Streptococcus spp. et d Haemophilus spp. utiliser un écouvillon pour prélever plus facilement les colonies bactériennes. Bien décharger l anse ou l écouvillon dans 5 à 10 ml d eau physiologique stérile à 0,9%. Dans le cas de Neisseria gonorrhoeae, décharger l anse dans 1 à 2 ml de tampon phosphate stérile à ph 7,2. Bien homogénéiser la suspension bactérienne, son opacité doit être équivalente à 0,5 MF ou à une D.O. de 0,08 à 0,10 lue à 625 nm. Ajuster le plus précisément possible. L utilisation d un densitomètre est fortement souhaitable. L inoculum à 0,5 MF est dilué pour certaines bactéries (S.pneumoniae). Se référer aux recommandations du fournisseur. c- Ensemencement : Tremper un écouvillon stérile dans l inoculum. L essorer en le pressant fermement (et en le tournant) contre la paroi interne du tube, afin de décharger au maximum. Frotter l écouvillon sur la totalité de la surface gélosée, sèche, de haut en bas, en stries serrées. Répéter l opération 2 fois, en tournant la boîte de 60 à chaque fois, sans oublier de faire pivoter l écouvillon sur lui-même. Finir l ensemencement en passant l écouvillon sur la périphérie de la gélose. Dans le cas où l on ensemence plusieurs boîtes de Petri, il faut recharger l écouvillon à chaque fois. Ensemencer dans les mêmes conditions la (ou les) souches de référence (voir tableaux n 6, n 7 et n 8). d- Dépôt de la bandelette E-test : Prélever la bandelette à l aide de pinces bactériologiques préalablement flambées au bec Bunsen ; le contact avec les pinces doit se faire au niveau de l extrémité marquée E ; à noter que l utilisation d un applicateur (à commander auprès du fournisseur de bandelettes E- test) est recommandée. 36

38 Déposer la bandelette délicatement sur la surface gélosée, en commençant par l extrémité correspondant aux concentrations les plus faibles de l antibiotique testé puis en progressant jusqu aux concentrations les plus élevées. Eviter la formation de bulles d air entre la gélose et la bandelette, une fois appliquée la bandelette ne peut être déplacée. A noter que l on ne peut déposer qu une ou deux bandelettes E-test au maximum par boîte de 90 mm de ø (risque de chevauchement des ellipses avec plus d une bandelette). Laisser la boîte couvercle en haut pendant 15 mn au plus. Incuber la boîte dans les conditions requises selon la nature de la bactérie testée (voir tableaux n 5, n 7 et n 8). e- Lecture et interprétation : La CMI de l antibiotique testé est lue à l œil nu, boîte ouverte et bien éclairée. Elle correspond à la graduation, située à la jonction entre l ellipse (dessinée par l inhibition de la culture bactérienne) et la bandelette E-test. Contrôler la qualité du test par la CMI de la souche de référence. Se référer au tableau de lecture fourni au niveau du prospectus E-Test. Lire ensuite la CMI de la souche bactérienne testée. Se référer aux recommandations du fournisseur pour l interprétation de cas ambigus (double zone). Comparer les résultats obtenus, aux valeurs critiques figurant dans les tables de lecture correspondantes. Classer la bactérie dans l une des catégories S, R ou I. 37

39 38

40 TESTS COMPLEMENTAIRES Dr H. Ammari 39

41 3-1 Recherche de la résistance de Staphylococcus spp. à l oxacilline 3-2 Recherche de la β-lactamase 3-3 Détection des souches de S.pneumoniae de sensibilité diminuée aux β-actamines a. Antibiogramme b. CMI par bandelettes E-test c. Détermination de la CMI par la technique de dilution en milieu liquide 3-4 Recherche de la β-lactamase à spectre élargi (BLSE) chez les entérobactéries, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp. a. Définition d une BLSE b. Quand rechercher une BLSE c. Méthodes de détection de la BLSE c.1. c.2. c.3. Test de synergie Test de confirmation ou technique du double disque Test à la cloxacilline 3-5 Recherche de Staphylococcus spp. de sensibilité diminuée aux glycopeptides a. Etape de screening ou criblage b. Test de confirmation 3-6 Recherche d Enterococcus spp. de sensibilité diminuée aux glycopeptides a. Critères de présomption ou d alerte b. Test de screening c. Test de confirmation d. Phénotypes de résistance 3-7 Détection d Haemophilus spp. de sensibilité diminuée aux β- lactamines 40