Génétique. Kit PCR variation allélique du gène de l amélogénine. Réf : Français p 1. Version : 5102

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1 Français p 1 Kit PCR variation allélique du gène de l amélogénine Version : 5102

2 1 Amplification par PCR des allèles de l amélogénine 1.1 Introduction : la réaction PCR L ADN est synthétisé dans la nature grâce à un type d enzyme appelé ADN polymérase. Pour fonctionner, cette enzyme a besoin d une matrice d ADN simple brin à répliquer, d une amorce ADN complémentaire à l ADN à répliquer et de désoxyribonucléotides (datp, dgtp, dctp et dttp). La découverte d organismes thermophiles a permis de trouver des ADN polymérases ayant deux caractéristiques essentielles à savoir une température de fonctionnement élevée (typiquement vers 72 C) et surtout la capacité à ne pas être dénaturées définitivement par des températures supérieures à 90 C. Ces caractéristiques ont permis d inventer la réaction PCR ou réaction de polymérisation en chaîne qui consiste à synthétiser in vitro de l ADN de façon exponentielle. La première étape de cette réaction consiste en la dénaturation de l ADN double brin qui sert de matrice. Pour se faire, la solution d ADN est chauffée à une température proche de l ébullition ce qui permet de séparer les deux brins d ADN par fusion thermique. La seconde étape consiste à apparier, de part et d autre de la zone à amplifier, des amorces d ADN simple brin synthétique. Cette opération est simplement réalisée en abaissant suffisamment la température pour que cet appariement puisse être stable. La troisième et dernière étape consiste à se placer à la température optimale pour la synthèse d ADN par l ADN polymérase (typiquement 72 C) pendant le temps nécessaire pour que cette dernière ait le temps de synthétiser la longueur d ADN souhaitée. Ces trois étapes vont être répétées autant de fois que nécessaire pour amplifier de façon exponentielle l ADN recherché ou amplicon (Figure 1). Typiquement, la molécule d origine va pouvoir ainsi être multipliée par des facteurs de 10 6 à 10 9 la rendant détectable par électrophorèse sur un gel d agarose par exemple. FRANÇAIS 1

3 Figure 1 FRANÇAIS 2

4 2 Amplification d une partie des gènes de l amélogénine 2.1 But de la manipulation Le but de ces travaux pratiques est de révéler par réaction PCR les variations alléliques du gène de l amélogénine. Deux copies de ce gène existent chez l Homme, l une sur le chromosome X et l autre sur le chromosome Y. De plus, il est possible d obtenir des amplicons spécifiques avec un seul couple d amorces soit une seule réaction PCR. L amplicon du gène porté par X sera de 1268 paires de bases, alors que celui porté par Y sera de 1088 paires de bases. Dès lors, deux amplicons distincts seront retrouvés chez l homme (XY) alors qu un seul amplicon sera généré pour une femme (XX). Ces amplicons seront séparés par électrophorèse sur un gel d agarose. 2.2 Mode opératoire - Bien identifier les différents composants du kit : PCR Master Mix x 2 = tube à pastille verte Primer Mix x 2 = tube à pastille bleue DNA Release = tube à pastille rouge Marqueur de poids moléculaire = tube à pastille argentée - Préparer un microtube PCR 0,2 ml et l annoter au feutre (initiales de l expérimentateur par exemple). - Prélever 25 µl du PCR Master Mix x 2 (vert) et les placer dans le microtube PCR. - Changer de pointe de micropipette. FRANÇAIS 3

5 - Prélever 25 µl du Primer Mix x 2 (bleu) et les placer dans le microtube PCR. Mélanger par pipetage doux. - Prendre une anse stérile et effectuer un prélèvement à l intérieur de la joue en balayant cette dernière doucement de haut en bas 3 à 4 fois. On tiendra l anse de telle sorte qu elle soit perpendiculaire à la joue pendant le prélèvement. - Placer l anse dans le microtube PCR et la faire tourner comme un mélangeur 3 à 4 fois puis la sortir en prenant soin de ne pas emporter trop de volume réactionnel. - Fermer le microtube PCR et le placer dans le thermocycleur PCR. Attention, ces tubes sont assez fragiles. On utilisera plutôt une pression verticale ferme, mais modérée, entre le pouce et l index en évitant des pressions latérales. FRANÇAIS 4

6 - Exécuter le programme suivant : Température Temps 98 C 5 minutes 98 C 5 secondes 72 C 25 secondes X40 72 C 1 minute 4 C attente (non nécessaire si l analyse sur gel est menée immédiatement) 3 Préparation de gel d électrophorèse Le gel peut être préparé pendant la durée de la PCR (1 heure environ) ou la veille conservé dans du tampon Consommables pour réaliser 1 électrophorèse : Marqueur de taille 20 µl Agarose ( type II) 0.9 g Tampon TAE 10X 25 ml Colorant azur A 50 mg Matériels complémentaires : Alimentation électrique 75/140V Cuve à électrophorèse ADN-Protéines 4 Mode opératoire Durée de préparation : Préparation du gel, coulage, montage, migration, coloration, décoloration : 2 heures. 4.1 Préparation des solutions Préparation du tampon TAE 1X: Le volume de tampon nécessaire par cuve est d environ 300 ml (gel + tampon migration). Verser le contenu du flacon de tampon TAE 10X (Tris Acétate EDTA) dans 1125 ml d eau distillée, bien mélanger. Préparation et coulage d un gel d'agarose à 0,6% : Verser 83 ml de tampon TAE 1X dans un erlenmeyer de 250 ml. Peser 0,5 g d'agarose de type II dans une capsule et le verser en pluie fine dans le tampon TAE. Mettre l'erlenmeyer contenant le TAE et l agarose sur un agitateur magnétique chauffant avec un turbulent jusqu'à dissolution complète. S'assurer que l'agitation est maintenue constante afin de permettre une bonne homogénéisation du produit et d'éviter la formation de bulles dans le gel. Attendre le refroidissement de la solution (léger épaississement) et préparer le support (moule de coulage) comme suit. FRANÇAIS 5

7 a. Boucher les 2 extrémités du support de gel, utiliser les embouts hermétiques pour cuves ou disposer 2 morceaux d'adhésif pour peintre, un à chaque extrémité ouverte du support de gel pour le fermer complètement. S'assurer que l'adhésif utilisé est suffisamment résistant pour éviter la perte de la solution, et ce notamment si le gel est trop chaud et un peu trop liquide. b. Positionner le peigne sur le support en utilisant les encoches prévues à cet effet. c. Placer le plateau de moulage parfaitement à l horizontale. d. Lorsque la température de la solution atteint 50 C, la verser lentement et à vitesse constante au centre du plateau de moulage. Arrêter lorsque le niveau arrive juste au-dessous de la jonction dents-reste du peigne. Laisser ensuite le gel se figer 10 min à la température de la salle, puis 10 à 15 min au réfrigérateur. Enlever ensuite le peigne en le tirant bien verticalement : les puits apparaissent. Retirer le papier adhésif Les gels peuvent être stockés au réfrigérateur dans du tampon TAE 1X 4.2 Mise en route de l'électrophorèse et migration (environ 1 heure 30) Poser le support de gel dans la cuve, les puits devant être du côté de la cathode (borne négative). Remplir chaque compartiment de la cuve de tampon final TAE. Le tampon vient au contact du gel jusqu à dépasser les 2/3 de sa hauteur, mais ne le recouvre en aucun cas. Un niveau de tampon trop élevé peut engendrer une intensité supérieure aux limites autorisées par l alimentation qui disjoncte alors. Fermer la cuve à l'aide de son couvercle. Respecter la correspondance des couleurs entre les cordons de la cuve et les douilles de l alimentation. Régler la tension de votre alimentation sur 75V ou 100 V suivant votre modèle d alimentation. Raccorder l appareil au secteur. Mettre l alimentation sous tension. La migration démarre. Vérifier le bon déroulement de votre électrophorèse : de la buée doit apparaître sur le couvercle dans les cinq premières minutes si le générateur et la cuve sont bien alimentés. Pour stopper la migration, couper l alimentation, débrancher la cuve et le cordon secteur. Si, lors de la mise sous tension, l'alimentation disjoncte, retirer un peu de solution tampon. La disjonction peut être due à une trop grande conductivité de la solution, provoquant la mise en marche de la protection en court-circuit. Se reporter à la notice de l alimentation pour le rétablissement de la tension. FRANÇAIS 6

8 Migration en cours 4.3 Arrêt de l'électrophorèse et coloration Pendant la durée de la migration, préparer une solution de colorant Azur A pour électrophorèse à 0,4 %. Dissoudre le colorant dans une solution hydroalcoolique 20% éthanol soit 80 ml éthanol et 320 ml d eau. Arrêter l'électrophorèse lorsque l indicateur de migration, a au moins parcouru une distance équivalente aux 2/3 du gel (environ 1h/1h20) Retirer le support de gel (avec son gel) de la cuve et le déposer dans un cristallisoir. Recouvrir avec le colorant et attendre 4 min exactement Vider le colorant (qui peut être réutilisé). Rincer le gel resté dans le cristallisoir avec de l éthanol à 70% pour retirer l'excès de colorant pendant quelques secondes. Eliminer l alcool puis rincer à l eau distillée. Décolorer le gel par des bains successifs d'eau distillée jusqu'à apparition des bandes d'adn. FRANÇAIS 7

9 5 Réalisation de l électrophorèse 5.1 Préparation de l ADN amplifié - Retirer le microtube du thermocycleur, l ouvrir délicatement et y ajouter 1,5 µl de la solution DNARelease (tube à pastille rouge). Mélanger par pipetage doux. - Analyser par électrophorèse sur gel d agarose 0,8 à 1%. Le mélange réactionnel ne nécessite pas d ajout de tampon de charge avant dépôt. On chargera 10 à 20 µl du marqueur de poids moléculaire sur le gel (Figure 2). FRANÇAIS 8

10 Dépôt échantillons Dépôt ADN marqueur poids moléculaire 5.2 Remarques Il est généralement recommandé de placer les tubes sur la glace pendant les manipulations. Toutefois, ceci n est pas absolument indispensable, surtout si les consommables sont utilisés dans leur intégralité et les réactions préparées dans un temps raisonnablement court. Bien que travaillant sur l amplification de gènes humains, l utilisation de gants afin d éviter les contaminations n est pas obligatoire. Toutefois, on veillera à bien se laver les mains au savon avant les manipulations des différents composants du kit. En revanche, la stérilité des anses de prélèvement sera à maintenir absolument pour éviter les contaminations. Dans le cadre de ces travaux pratiques, la température d appariement des oligonucléotides a été choisie pour être proche de la température optimale de fonctionnement de l ADN polymérase. Ceci permet de simplifier les cycles de la réaction PCR en supprimant l étape d appariement des amorces à basse température et d accélérer ainsi le processus. FRANÇAIS 9

11 Figure 2 6 Service après-vente Pour toute question, veuillez contacter : JEULIN - SUPPORT TECHNIQUE 468 rue Jacques Monod CS EVREUX CEDEX France * * 0,15 TTC/min. à partir un téléphone fixe FRANÇAIS 10

12 Assistance technique en direct Une équipe d experts à votre disposition du lundi au vendredi de 8h30 à 17h30 Vous recherchez une information technique? Vous souhaitez un conseil d utilisation? Vous avez besoin d un diagnostic urgent? Nous prenons en charge immédiatement votre appel pour vous apporter une réponse adaptée à votre domaine d expérimentation : Sciences de la Vie et de la Terre, Physique, Chimie, Technologie. Service gratuit* choix n 3** * Hors coût d appel. 0,15 e TTC/min à partir d un poste fixe. ** Numéro valable uniquement pour la France métropolitaine et la Corse. Pour les DOM-TOM et les EFE, composez le Direct connection for technical support A team of experts at your disposal from Monday to Friday (opening hours) You re looking for technical information? You wish advice for use? You need an urgent diagnosis? We take in charge your request immediatly to provide you with the right answers regarding your activity field : Biology, Physics, Chemistry, Technology. Free service* ** * Call cost not included. ** Only for call from foreign countries. Aide en ligne FAQ.jeulin.fr 468, rue Jacques-Monod, CS 21900, Evreux cedex, France Métropole Tél : Fax : support@jeulin.fr International Tél : Fax : export@jeulin.fr SAS au capital de e - TVA intracommunautaire FR Siren RCS Evreux