TOXOCARA WB IgG est un test qualitatif de confirmation par immunoblot du sérodiagnostic (sérum, humeur aqueuse ou LCR) de la toxocarose.

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1 1 TOXOCARA WESTERN BLOT IgG #TXA-WB24G : 24 tests #TXA-WB12G : 12 tests #TXA-WB96G : 96 tests Technique d'immunoblot pour usage diagnostique in vitro NOTICE D'UTILISATION Indication du test TOXOCARA WB IgG est un test qualitatif de confirmation par immunoblot du sérodiagnostic (sérum, humeur aqueuse ou LCR) de la toxocarose. Contexte clinique La toxocarose est une helminthiase tissulaire due à des larves de Nématodes appartenant au genre Toxocara. L'agent responsable est le plus souvent Toxocara canis (parasite du chien) ou Toxocara cati (parasite du chat). La plupart des chiens et des chats non régulièrement vermifugés sont porteurs de Toxocara adultes. La toxocarose est donc une helminthozoonose cosmopolite, dont la séroprévalence varie dans les pays industrialisés de 2,5 % (zones urbaines) à 40% (zones rurales). La contamination de l Homme se fait par l'absorption d œufs embryonnés ou de larves. Dans le premier cas, les facteurs de risque sont la consommation de crudités ayant poussé sur des sols contaminés par des déjections d animaux de compagnie, une hygiène insuffisante (enfants portant à leur bouche des mains souillées ; problème du sable des bacs à jeux) ou un phénomène de géophagie. Dans le deuxième mode, la contamination provient de larves libérées lors de la digestion d abats (foie surtout) insuffisamment cuits. [6] La toxocarose est le plus souvent asymptomatique et guérit spontanément, laissant persister pendant des années une positivité sérologique. En cas d'infestations massives et/ou répétées, elle peut entraîner des signes généraux (asthénie, amaigrissement, rarement fièvre), des manifestations d allergie, surtout cutanées (plus importantes si le patient est F122 TXAWBG-f-07/07/2005 v5

2 2 porteur d un terrain atopique, connu ou ignoré), et des troubles digestifs (douleurs variées, diarrhées). [2, 3, 6, 9] Des manifestations viscérales polymorphes (pulmonaires, nerveuses, cardiaques...) se voient essentiellement lors d atteintes massives (syndrome de larva migrans viscérale). A l inverse, la toxocarose oculaire est souvent isolée. [6] L'examen parasitologique direct, invasif, n'est pas réalisable et le diagnostic, orienté par les anomalies biologiques non spécifiques (hyperéosinophilie, élévation du taux des IgE totales) repose sur la sérologie. [2, 6, 9] Du fait de la forte prévalence de la toxocarose systémique dans la plupart des populations, l immunodiagnostic de la toxocarose oculaire, beaucoup plus rare, pourra être réalisé utilement sur l humeur aqueuse du patient. L immunodiagnostic sur le LCR pourra également être réalisé devant une symptomatologie neurologique inexpliquée et une éosinophilie rachidienne. [7] Parmi les techniques sérologiques classiques, la plus sensible et la plus couramment utilisée est l ELISA. Les fréquentes réactions croisées et le manque de sensibilité observés lors de l emploi d antigènes figurés ou d extraits solubles de larves ou de vers adultes font utiliser aujourd'hui les antigènes d'excrétion-secrétion (E/S) obtenus par culture in vitro de larves de Toxocara canis. [1] Les antigènes E/S sont néanmoins complexes et présentent de nombreuses communautés antigéniques avec d'autres helminthes, ce qui entraîne des réactions croisées altérant les performances des tests qui leur font appel. [4, 8] Utilisant les antigènes E/S après séparation électrophorétique, le test TOXOCARA WB IgG permet de différencier les antigènes 24-35kDa, spécifiques de Toxocara. [5] La remarquable sensibilité de l'immunoblot et sa spécificité absolue ont conduit à proposer cette technique pour l immunodiagnostic de la toxocarose humaine, en confirmation des résultats obtenus par les méthodes sérologiques classiques. Principe du test Origine et présentation des bandelettes Les antigènes E/S de larves de Toxocara canis, après séparation électrophorétique sur gel de polyacrylamide, ont été fixés par électro-transfert sur la surface de bandelettes de nitrocellulose (technique de Western blot).

3 3 Les bandelettes sont fournies prêtes à l'emploi, numérotées et prédécoupées. Déroulement du test : Chaque échantillon (sérum, humeur aqueuse ou LCR) à tester est incubé séparément avec une bandelette. Les anticorps anti-toxocara éventuellement présents se fixent sélectivement sur les antigènes E/S présents sur les bandelettes. Le lavage élimine les anticorps non fixés. Chaque bandelette est ensuite incubée avec le conjugué anti-igg humaines-phosphatase Alcaline qui se lie aux anticorps anti-toxocara éventuellement fixés. Le lavage élimine le conjugué non fixé. Lors de la dernière étape, cet immuncomplexe réagit sur le substrat : les bandes antigéniques reconnues par les anticorps anti-toxocara de classe IgG éventuellement présents dans les échantillons sont révélées sous forme de bandes transversales violettes. La réaction de coloration est arrêtée par un lavage à d'eau distillée. Les bandelettes sont séchées ; leur coloration est stable plusieurs années à l'abri de la lumière. Lecture : 4 bandes d'un poids moléculaire compris entre 24 et 35kDa, bien visibles sur la bandelette, sont spécifiques de l infestation toxocarienne. [4] La présence d'au moins 2 bandes parmi ces 4 bandes permet d'interpréter le test comme positif et de conclure à la présence d'anticorps IgG anti-toxocara dans l'échantillon testé. Réactifs fournis avec la trousse Nota : Les volumes et quantités indiqués (en italique) correspondent au conditionnement de 12 tests #TXA-WB12G. Ceux indiqués en caractères gras correspondent au conditionnement 96 tests #TXA-WB96G. R1 : Une (1) pochette de 24 (12, 4x24) BANDELETTES SENSIBILISEES Bandelettes de nitrocellulose, numérotées et prédécoupées mais attachées par leur extrémité supérieure à la souche. Les bandelettes ont été sensibilisées par électro-transfert d antigènes E/S de larves de Toxocara canis séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. F122 TXAWBG-f-07/07/2005 v5

4 4 R2 : Un (1) flacon contenant 30 (16, 120) ml de DILUANT ECHANTILLONS (Prêt à l'emploi - solution rose) Solution tampon + surfactant + NaN3 (inf. 0.1%). R3 : Un (1) flacon contenant 60 (30, 240) ml de TAMPON DE LAVAGE CONCENTRE 10X (A diluer 10 fois dans de l'eau distillée - solution incolore) Solution tampon + surfactant + NaN3 (inf. 0.1%). R4 : Un (1) flacon contenant 30 (16, 120) ml de CONJUGUE ANTI-IgG (Prêt à l'emploi - solution bleue) Solution tampon + sérum polyclonal de chèvre anti-igg humaines conjugué à la phosphatase alcaline + NaN3 (inf. 0.1%) + stabilisants. R5 Un (1) tube contenant 100 (50, 200) µl de SERUM DE CONTROLE POSITIF (Prêt à l'emploi - pastille rouge sur le bouchon) Solution tampon + pool de sérums humains positif en sérologie toxocarose + NaN3 (inf. 0.1%) + stabilisants. R6 : Un (1) flacon contenant 30 (16, 120) ml de SUBSTRAT (Prêt à l'emploi - flacon opaque marron) Solution tampon + NBT + BCIP + stabilisants. Standards colorés (protéines recombinantes) situés dans la pochette (R1) à droite des bandelettes permettant d'estimer de haut en bas la distance de migration et correspondant aux Poids Moléculaires suivants (kda) : Bleu : 250, Bleu : 150, Bleu : 100, Rose : 75, Bleu : 50, Vert : 37, Rose : 25, bleu : 20, bleu : 15. Le coffret contient également, à titre d exemple, la reproduction scanner d'immunoblots provenant de sérums positif et négatif (voir page 15 de la présente notice). Matériel nécessaire mais non fourni - Gants en latex. Pincette pour manipuler les bandelettes - Cuves d'incubation multicanaux en polypropylène adaptées aux miniblots (Réf. LDBIO # WBPP- 08 ou équivalent) - Agitateur oscillant pour immunoblots

5 5 - Système d'aspiration pour les liquides permettant de vider les cuves d'incubation - Cutter ou scalpel - Règle plate transparente - Papier absorbant de type Whatman - Papier aluminium - Eau distillée ou désionisée de bonne qualité - Pipettes automatiques, micropipettes et pointes à usage unique (volumes de 10µl, 25µl, 1.2ml et 2ml) - Éprouvettes graduées, récipients adaptés, pissette de laboratoire. - Chronomètre - Ruban adhésif transparent de bonne qualité - Tubes et matériel pour le prélèvement des échantillons. Conditions de conservation Tous les réactifs du coffret doivent être conservés entre 2 et 8 C. Ils sont valables jusqu'à la date de péremption indiquée sur le couvercle de la boîte et les étiquettes des flacons. Une fois dilué, le tampon de lavage est stable 2 mois, conservé entre 2 et 8 C. Précautions spéciales d'emploi Sécurité - pour usage in vitro exclusivement. - Le contrôle positif est un sérum d'origine humaine. Il a subi un dépistage négatif, concernant les anticorps anti-vih 1 et 2, les anticorps anti-vhc et l'ag HBs, mais doit cependant être manipulé comme un produit potentiellement infectieux. - Manipuler selon les Bonnes Pratiques de Laboratoire et considérer tout réactif et tout échantillon comme potentiellement toxique et/ou infectieux. - Le substrat contient un mélange NBT et BCIP toxiques par contact (peau et muqueuses) et inhalation. - Les réactifs contiennent de l'azide de sodium susceptible de former des sels métalliques explosifs avec le plomb ou le cuivre. Rincer à l'eau tout rejet à l'évier. - Porter des vêtements protecteurs (blouse, gants, lunettes). - Ne pas boire, manger ou fumer dans le laboratoire. - Ne pas pipeter avec la bouche. Refermer les flacons après usage. - Éliminer les déchets (prélèvements, pointes, tubes, liquides de lavage, réactifs usagés...) conformément aux bonnes pratiques en usage dans la profession et aux règlements en vigueur dans le Pays. F122 TXAWBG-f-07/07/2005 v5

6 6 Précautions - Ne pas toucher les bandelettes avec les doigts, porter des gants et utiliser une pincette. - Ne pas utiliser de réactif après la date de péremption. - Conserver les réactifs dans le coffret fourni. - Ne pas utiliser ensemble des réactifs de lots différents. - Les réactifs doivent être bien mélangés avant usage. - Ne pas utiliser de réactif provenant d un flacon présentant des signes de fuite. - Ne pas laisser inutilement les réactifs hors du réfrigérateur. - Bien mélanger le tampon de lavage concentré avant dilution. - La qualité de l'eau est importante pour obtenir un bon tampon de lavage. - Ne pas utiliser de solution trouble ou précipitée. - N'utiliser que des cônes de pipette à usage unique. - Éviter toute contamination inter-puits. Attention à la formation d'aérosols. - Établir un plan de distribution précis avant de commencer la manipulation. - L omission de distribution d un échantillon ou la distribution d un volume inapproprié peut faire considérer comme négatif le résultat du test quelque soit son statut réel. Prélèvement des échantillons Prélever de manière aseptique les échantillons sur tube sec. Un minimum de 10 µl d échantillon (sérum, LCR ou humeur aqueuse) sont nécessaires pour l analyse. Dans les cas particuliers de l humeur aqueuse ou du LCR, l utilisation de 25 µl d échantillon au lieu de 10 µl permettront d augmenter la sensibilité du test. Laisser coaguler le sang, centrifuger et décanter sérum, humeur aqueuse et/ou LCR. Conserver les échantillons à 2-8 C. Les congeler à -20 ± 5 C s'ils ne doivent pas être utilisés dans les 72h. Éviter de congeler et décongeler les échantillons plusieurs fois. Préparation des réactifs Tampon de lavage : Pour 4 tests diluer dans un flacon propre 10ml de tampon de lavage concentré 10x (R3) dans 90ml d'eau distillée ou désionisée (le tampon dilué se conserve 2 mois à 2-8 C). Mode opératoire 1/ Préparer un plan de distribution des échantillons. Il est vivement

7 7 conseillé d'y inclure le contrôle positif (R5). L'utilisation de ce contrôle permet de valider techniquement la manipulation et de fournir un modèle très fiable pour l'identification finale des bandes antigéniques révélées. 2/ Distribuer 1.2ml de tampon échantillon (R2) dans chacun des puits selon le plan établi. 3/ Mettre des gants. Ne pas toucher les bandelettes. Utiliser une pincette pour les manipuler. A l'aide d'un cutter (ou scalpel) et d'une règle plate transparente propre et sèche, découper le nombre de bandelettes (R1) nécessaire. Pour cela, maintenir fermement les bandelettes plaquées par la règle et les découper du coté de la souche (les numéros étant visibles au travers de la règle par transparence). 4/ Distribuer les bandelettes numérotées à l'aide des pincettes selon le plan de distribution. Laisser les bandelettes se réhydrater dans le tampon pendant environ 5 minutes, face vers le haut (N visible) et totalement recouvertes par le tampon. 5/ Distribuer les échantillons (sérum: 10µl ; LCR / humeur aqueuse: 25µl si possible) et le contrôle positif (10µl), selon le plan de distribution. Agiter doucement la cuve après chaque dépôt. Incuber sur un agitateur oscillant pendant 60mn ± 5mn à C. 6/ Lavage : Aspirer le contenu des puits à l'aide d'une pompe aspirante et répartir environ 2-3ml de tampon de lavage dilué dans chacun d'eux en évitant de retourner les bandelettes. Agiter doucement la cuve manuellement puis réaspirer le contenu des puits. Répartir à nouveau environ 2 à 3ml de tampon de lavage dilué en évitant de retourner les bandelettes. Incuber 3 à 5mn sur l'agitateur. Aspirer le liquide. Répéter cette dernière opération 2 fois. 7/ Distribuer 1.2ml de conjugué anti-igg (R4) dans chacun des puits. Les bandelettes doivent être totalement recouvertes et face vers le haut (numéros visibles). Incuber sur un agitateur oscillant pendant 30mn ± 5mn à C. 8/ Lavage : procéder comme pour l'étape 6. 9/ Distribuer 1.2ml de substrat NBT/BCIP (R6) dans chacun des puits. Les bandelettes doivent être face vers le haut (N visible) et totalement recouvertes par le substrat. F122 TXAWBG-f-07/07/2005 v5

8 8 Incuber sur un agitateur oscillant 30mn ± 5mn à C et à l'abri de la lumière directe (recouvrir les cuves d'un papier aluminium). L'arrêt se fait par l'aspiration du substrat avec la pompe et la distribution de 2ml d'eau distillée ou désionisée dans le puits. Laisser incuber 3 à 5mn et répéter une fois ce dernier lavage. 10/ Saisir les bandelettes par leur extrémité numérotée à l'aide de la pincette (cette manipulation est plus aisée si les puits sont pleins d'eau) et les déposer, numéro visible, sur un papier absorbant de type Whatman. Laisser les bandelettes sécher à l'air (éventuellement à proximité d'une lampe à incandescence pour diminuer le temps de séchage). La couleur des bandelettes s'éclaircit naturellement en séchant. 11/ Transférer les bandelettes sur la feuille de papier qui servira à les archiver. Les maintenir avec la règle plate et les coller par le haut à l'aide du ruban adhésif transparent. Éviter de les manipuler avec les doigts. Attention : plus les bandelettes sont sèches, plus elles sont fragiles. Interprétation Étalonnage des poids moléculaires - La juxtaposition de la bandelette d'un échantillon et du standard de poids moléculaire (PM) coloré fourni dans la trousse (pochette R1) permet d'estimer le PM des bandes antigéniques révélées (il faut auparavant le découper à l'aide d'une règle et d'un scalpel comme une bandelette ordinaire et le manipuler avec une pincette). - Le contrôle positif R5 utilisé dans la même série que les échantillons fournit une bandelette témoin qui indique très précisément la position des bandes de bas poids moléculaire (BPM) 24 à 35kDa spécifiques. - La reproduction d'immunoblots de sérums positifs testés avec le présent lot de réactifs est incluse dans le coffret à titre d'exemple. Interprétation Rechercher la présence des bandes BPM 24-35kDa pour chacun des échantillons testés à l'aide des outils d'étalonnage décrits ci-dessus. Ces bandes, groupées et bien isolées, sont caractéristiques et généralement très facilement repérables.

9 9 La présence sur la bandelette d'un minimum de 2 bandes BPM dans la zone 24-35kDa permet d'interpréter le test comme positif et de conclure à la présence d'anticorps IgG anti-toxocara dans l'échantillon testé. Autres bandes pouvant être observées : - Une paire de bandes située à environ 50kDa ne sont visibles qu'avec certains sérums très positifs, réagissant très fortement (coloration des 4 bandes BPM bleu-noir intense). Elles sont également spécifiques de la toxocarose. Pour conclure à la positivité du test, les bandes BPM 24-35kDa doivent également être présentes. - Deux groupes de bandes de haut poids moléculaire (HPM) peuvent être observés dans la zone 70-90kDa et autour de 200 kda. Ces bandes ne sont pas spécifiques de la toxocarose : Elles peuvent accompagner les bandes BPM 24-35kDa (toxocarose). Elles peuvent être présentes isolément sur la bandelette en l'absence des bandes BPM 24-35kDa (réaction croisée avec une autre helminthiase, ou toxocarose débutante à confirmer nécessairement sur un autre prélèvement). Remarque : La dissociation d'intensité de la coloration entre les groupes BPM et HPM (bandes 24-35kDa très pâles associées à des bandes 70-90kDa et/ou 200kDa très intenses) pourrait correspondre à une positivité mixte : toxocarose (faible titre d IgG spécifiques) associée à une réaction croisée due à une autre helminthiase. Limites du test Les résultats sérologiques doivent être interprétés en fonction des renseignements épidémiologiques, cliniques et des résultats de l hémogramme afin d'établir le diagnostic de toxocarose. Un résultat sérologique négatif n'écarte pas le diagnostic de toxocarose. Un résultat positif (sérum) chez un patient normo-éosinophilique peut faire en principe conclure à une séropositivité résiduelle, sauf en cas de suspicion de toxocarose oculaire. La recherche des anticorps anti-toxocara dans l humeur aqueuse peut être très utile au diagnostic de la toxocarose oculaire. F122 TXAWBG-f-07/07/2005 v5

10 10 Problèmes rencontrés "Les bandes sont pâles et peu contrastées" : Certains sérums très peu chargés en anticorps peuvent donner de tels résultats. "Des zones d'ombre se voient, plus ou moins colorées, légèrement diffuses" : - La bandelette n'était pas totalement immergée dans l'un des réactifs et n'a pas incubé correctement sur toute sa longueur. - Des taches peuvent être également présentes à l endroit du dépôt de l échantillon si la cuve n a pas été agitée après la distribution. "Le bruit de fond est important, rendant la lecture très difficile" : Les lavages ont été insuffisants ou la dernière incubation a été trop longue. S'assurer du bon déroulement technique du test, du respect des temps de lavage, de la qualité de l'eau. Diminuer le temps de la dernière incubation. Exceptionnellement, certains sérums peuvent réagir ainsi de façon non spécifique. Le résultat de l'immunoblot ne peut alors être rendu. Ce bruit de fond non spécifique peut également ne concerner qu'une partie de la bandelette, rendant les résultats ininterprétables sur cette partie seulement. "Un précipité apparaît dans la solution lors de la dernière étape de révélation" Le substrat peut effectivement partiellement précipiter (flocons noirs) dans le tampon en fin de révélation. Ce phénomène n'altère pas la qualité de la révélation qui doit être poursuivie normalement. Le lavage final à l'eau distillée élimine les particules solides éventuellement présentes. Contrôle de qualité Le sérum de contrôle inclus dans le coffret doit systématiquement être inclus dans toute série de WB et permet : - de valider techniquement le bon déroulement du test (les bandes doivent apparaître très nettement sur la bandelette), - d'étalonner précisément la position exacte des bandes 24-35kDa spécifiques pour aider à l'interprétation des échantillons. - de connaître également la position des autres bandes que l'on peut couramment rencontrer.

11 Performances Spécificité : 11 D après les données de la littérature, la spécificité des bandes 24-35kDa est de 100%. [5] L étude menée par un laboratoire de référence indépendant sur 10 sérums de patients n'ayant jamais voyagé hors de France et préalablement contrôlés indemnes de toute helminthiase par coprologie et sérologie confirme ces résultats : ils sont tous retrouvés négatifs par la trousse TOXOCARA WB IgG. Sensibilité : - 10 sérums de patients atteints de toxocarose (présentant les signes cliniques compatibles avec la maladie ainsi qu'une hyperéosinophilie et une augmentation des IgE totales) ont été testés par un laboratoire indépendant avec la trousse TOXOCARA WB IgG. Tous ont été trouvés positifs sérums de patients atteints de diverses helminthiases ont été testés avec la trousse TOXOCARA WB IgG par le même laboratoire. 35% d'entre eux présentent une positivité du test TOXOCARA WB IgG (présence des bandes BPM kda). Ces sérums, le plus souvent d'origine rurale ou tropicale, zones dans lesquelles la prévalence de la toxocarose est forte, contiennent très certainement des anticorps anti-toxocara. Cette zoonose peut donc très fréquemment être associée à une autre helminthiase sérums (45 positifs et 45 négatifs) adressés pour sérodiagnostic de la toxocarose ont été testés par un laboratoire indépendant avec la trousse TOXOCARA WB IgG en comparaison avec une trousse ELISA du commerce utilisant l'ag-e/s de T. canis : ELIS A du com m e rce POSITIF NEGATIF WB POSITIF LDBIO NEGATIF 2 44 Fig.1 La sensibilité du test TOXOCARA WB IgG est significativement plus élevée que celle de l'elisa, démontrant l'intérêt du WB comme test de confirmation. F122 TXAWBG-f-07/07/2005 v5

12 12 Corrélation : Les mêmes 90 sérums ont été testés par le même laboratoire de référence en comparaison avec sa propre technique Immunoblot : REFERENCE WB POSITIVE NEGATIVE LDBIO POSITIVE 40 4 WB NEGATIVE 5 41 Fig. 2 La corrélation des deux techniques Western blot est bonne (test χ 2 de Mac Nemar NS) Réactions croisées : D'autres parasitoses et en particulier les Helminthiases peuvent très fréquemment provoquer l'apparition des bandes HPM sur le Western blot. Interférences : Bien qu aucune interférence particulière n ait été relevée avec des sérums hémolysés, ictériques ou lipidiques, il est conseillé d interpréter les résultats provenant de l utilisation de tels échantillons avec prudence. Aucune interférence particulière n'a été relevée avec les sérums positifs en facteur rhumatoïde ou en anticorps anti-nucléaires. Reproductibilité : - Reproductibilité inter-lots : 6 sérums positifs et 2 sérums négatifs ont été testés 2 fois dans la même série avec des réactifs provenant de 2 lots différents (antigènes de lots de production différents) : La corrélation sérum à sérum vis à vis des bandes BPM spécifiques 24-35kDa est totale. - Reproductibilité inter-séries : 3 sérums positifs et 1 sérum négatif ont été testés 4 fois dans 4 séries différentes avec des réactifs provenant du même lot de fabrication : La corrélation sérum à sérum vis à vis des bandes BPM spécifiques 24-35kDa est totale.

13 13 Bibliographie 1 D.H. De Savigny. In vitro maintenance of Toxocara canis larvae and a simple method for the production of Toxocara canis ES antigens for use in serodiagnostic tests for visceral larva migrans. Journal of Parasitology (1975); 61: L.T. Glickman, J-F. Magnaval, L.D. Domanski et al. Visceral larva migrans in French adults: a new disease syndrome? American Journal of Epidemiology (1987); 125: Ph. Humbert, S Buchet, T. Barde. La toxocarose: une zoonose parasitaire cosmopolite. Allergie et Immunologie. (1995); 27: N.R. Lynch, L.K.Wilkes, A.N. Hodgen et al. Specificity of Toxocara ELISA in tropical populations. Parasite Immunology.(1988); 10: J-F.Magnaval, R. Fabre, P. Maurieres et al. Application of the western-blotting procedure for the immunodiagnosis of human toxocariasis. Parasitology Research (1991); 77: J-F. Magnaval, L.T. Glickman, Ph. Dorchies. La toxocarose, une zoonose helminthique majeure. Revue de Médecine Vétérinaire (1994); 145: J-F. Magnaval, V. Galindo, L. Glickman, M. Clanet. Human Toxocara infection of the central nervous system and neurological disorders: a casecontrol study. Parasitology (1997), 115: F. Speiser, B.Gottstein. A collaborative study on larval secretory excretory antigens of Toxocara canis for the immunodiagnosis of human toxocariasis with ELISA. Acta Tropica (1984); 41: M.R. Taylor, C.T. Keane, P. O'Connor, et al. The expanded spectrum of toxocaral disease. Lancet (1988); i : F122 TXAWBG-f-07/07/2005 v5

14 14 RESUME DU MODE OPERATOIRE Nota Bene : ne pas pratiquer le test sans avoir préalablement lu la présente notice dans son intégralité. 1/ Etablir un plan de distribution. 2/ Distribuer 1.2ml de R2 (tampon échantillons rose) dans chacun des puits. Agiter doucement la cuve. 3/ Placer une bandelette numérotée R1, face vers le haut, dans chacun de puits. Attendre 1mn puis agiter doucement la cuve pour immerger la bandelette. 4/ Distribuer les échantillons et le contrôle positif R5 (10µl). (Nota : humeur aqueuse et LCR, distribuer si possible 25µl) Agiter doucement la cuve après chaque dépôt. Incubation 60 mn sur agitateur. 5/ Laver 3 fois avec R3 dilué au 1/10 6/ Distribuer 1.2ml de R4 (conjugué anti-igg bleu), agiter doucement la cuve, incubation 30 mn sur agitateur. 7/ Laver 3 fois avec R3 dilué au 1/10 8/ Distribuer 1.2ml de R6 (substrat flacon opaque), agiter doucement la cuve. Incubation 30 mn sur agitateur. 9/ Arrêt de la réaction par 2 lavages à l eau distillée. 10/ Transférer les bandelettes sur un papier filtre. Laisser sécher à l air 15 mn 11/ Comparer le profil de l immunoblot de chaque échantillon avec celui du contrôle positif R5.

15 15 TOXOCARA WB IgG Exemple d immunoblots obtenus (échantillon négatif et positif) NEG POS Standards PM pré-colorés recombinants (kda) HPM BPM La zone de bas poids moléculaires (BPM) est spécifique de la toxocarose : la présence d au moins deux bandes entre 24 et 35 kda permet d interpréter le test comme positif et de conclure à la présence d anticorps IgG anti-toxocara dans l échantillon testé. La zone de hauts poids moléculaires (HPM >80kDa) est de moindre spécificité et peut donner lieu à des réactions croisées en particulier avec d autres helminthiases. F122 TXAWBG-f-07/07/2005 v5

16 16 Index n page Indication 1 Contexte clinique 1-2 Principe du test 2-3 Réactifs fournis avec la trousse 3-4 Matériels nécessaires non fournis 4-5 Conditions de conservation 5 Précautions spéciales d'emploi Sécurité 5 Précautions 6 Prélèvement des échantillons 6 Préparation des réactifs 6 Mode opératoire 6-8 Interprétation 8-9 Limites du test 9 Problèmes rencontrés 9-10 Contrôle de qualité 10 Performances Bibliographie 13 Résumé du mode opératoire 14 Exemple d immunoblot (positif et négatif) 15 LDBIO DIAGNOSTICS LYON - F R A N C E NF EN ISO (2001) 19 A rue Louis Loucheur TEL : +33(0) FAX : +33(0) Ldbiodiag@aol.com