Manco Brigitte, Arnaud Ginette, Caudron Clémentine, Jacquinet Claire, Dupuy Noëlle, Butty Pascal
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- Marie-Claude Joly
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1 ETUDE DE L ASSOCIATION ERYTHROMYCINE-COLISTINE IN VITRO : MISE EN EVIDENCE D UNE SYNERGIE SUR ESCHERICHIA COLI ET SALMONELLA (ENTERICA SEROVAR) HADAR D ORIGINE AVIAIRE Manco Brigitte, Arnaud Ginette, Caudron Clémentine, Jacquinet Claire, Dupuy Noëlle, Butty Pascal CEVA Santé Animale, ZI la Ballastière, LIBOURNE RÉSUMÉ L étude des associations d antibiotiques présente les principaux intérêts suivants: l élargissement du spectre antibactérien, la complémentarité de diffusion au niveau des sites infectieux, l obtention d une synergie et la prévention de l émergence de mutants résistants. La cinétique de bactéricidie in vitro de l association d érythromycine et de colistine est étudiée vis-à-vis de Escherichia coli et de Salmonella Hadar d origine aviaire. Cette étude montre que l association de ces deux molécules entraîne une bactéricidie complète sans recroissance bactérienne à 24 heures : l association est synergique. Cette combinaison semble particulièrement intéressante afin d améliorer l efficacité des antibiotiques dans les traitements des pathologies des volailles où l'implication concomitante de germes Gram+ et Gram- est reconnue (par exemple entérites bactériennes). ABSTRACT The antibiotic combinations study is interesting for: widening the antibacterial spectrum, diffusion complementarity in the infectious sites, obtaining a synergy and emergence preventing of resistant mutants. The in vitro bactericidal kinetics of association of colistine with erythromycine is studied for Escherichia coli and Salmonella Hadar strains issued from avian origin. In this study, the combination of these two molecules allows a complete bactericidal without bacterial re-growth in the first 24 hours: the association is synergistic. This combination appears particularly interesting to improve the antibiotics efficacy in the treatments of poultry pathologies including Gram-positive and Gram-negative aerobic organisms (bacterial enteritis for example). 376
2 INTRODUCTION L adaptation et l évolution de la sensibilité des bactéries pathogènes vis-à-vis des antibiotiques utilisés en pathologie aviaire justifient de plus en plus un usage rationnel de ces antibiotiques. Afin d optimiser leur efficacité dans un contexte peu favorable aux molécules de très large spectre, les associations d antibiotiques présentent certains intérêts: l élargissement du spectre antibactérien, la complémentarité de diffusion au niveau des sites infectieux, la prévention de l émergence de mutants résistants ou l obtention d une synergie en sont des exemples. Une synergie de l association érythromycine + colistine est démontrée par une méthode de cinétique de bactéricidie in vitro vis-à-vis d Escherichia coli et de Salmonella Hadar d origine aviaire. Le but de cette combinaison est d améliorer l efficacité de chaque antibiotique isolément notamment lors d entérites bactériennes associant des germes à Gram négatif et à Gram positif chez la volaille. 1. MATERIELS ET METHODES 1.1. Souches bactériennes utilisées - 2 Souches d Escherichia coli de sérotype 0 78 K 80 et O 2 K 1 isolées à partir de cas cliniques d élevage de poulets en France. - 2 Souches de Salmonella Hadar isolées de dindonneaux en France Antibiotiques utilisés - Erythromycine : laboratoire CEVA, numéro de lot : A dont le titre est de 772 µg/mg. - Colistine sulfate : laboratoire CEVA, numéro de lot : 70397, titre : UI/mg sur la substance anhydre Détermination des CMI (concentration minimale inhibitrice) La détermination des CMI de l érythromycine et de la colistine vis-à-vis des souches étudiées est réalisée par dilution en milieu liquide (bouillon nutritif de Muëller-Hinton) Souches testées CMI érythromycine CMI colistine E. coli O 78 K 80 n µg/ml 0,5 µg/ml E. coli O 2 K 1 n µg/ml 0,5 µg/ml Salmonella Hadar n µg/ml 1 µg/ml Salmonella Hadar n µg/ml 1 µg/ml 1.4. Méthode de cinétique de bactéricidie («Time killing curves») Cette méthode consiste à analyser l évolution d une population bactérienne dans le temps, en fonction de différentes concentrations d antibiotiques. - Le dénombrement bactérien est effectué avant incubation (T0), après 1, 3 et 5 heures d incubation à 37 C (phase précoce) puis à 24 heures d incubation (phase tardive). - Les concentrations choisies sont : la CMI et 2 µg/ml pour la colistine, et la CMI et 24 µg/ml pour l érythromycine. - La cinétique est représentée graphiquement par une courbe indiquant le logarithme (base 10) du nombre d unités formant des colonies par ml (UFC/ml) de culture bactérienne en fonction du temps. - Une association est dite synergique lorsque le taux de survie microbienne est inférieur à celui obtenu avec l antibiotique isolé le plus actif. Cette différence sera significative pour un écart de deux logarithmes entre les deux valeurs. 2. RESULTATS Les courbes de «contrôle» correspondent au comportement de l inoculum bactérien ne recevant aucun antibiotique Association érythromycine + colistine sur Escherichia coli d origine aviaire a) Cinétique de bactéricidie vis-à-vis d Escherichia coli sérotype O 78 K 80 (figures 1a et ab), et vis-à-vis d Escherichia coli sérotype O 2 K 1 (figure 2a et 2b), après traitement avec l érythromycine seule, la colistine seule et l association de ces deux antibiotiques. Les concentrations associées dans le milieu de culture sont les suivantes : Erythromycine Colistine a 64 µg/ml (CMI) 0,5µg/ml (CMI) b 24 µg/ml (3/8 CMI) 2 µg/ml (4 CMI) A une concentration de 24 µg/ml et jusqu à 64 µg/ml, l érythromycine n a aucun effet sur la croissance des deux sérotypes d E. coli. La colistine est un antibiotique bactéricide actif sur les germes en multiplication et au repos. A une concentration égale à la CMI (0,5 µg/ml) la colistine exerce un effet bactéricide pendant la phase précoce jusqu à 5 heures, puis une recroissance bactérienne est observée pendant la phase tardive. Pour la concentration supérieure à la CMI (4 CMI), la bactéricidie est totale pendant la phase précoce, mais une recroissance bactérienne est observée pendant la phase tardive (24 h). Malgré une bonne activité concentration-dépendante bactéricide précoce de la colistine vis-à-vis de ces deux sérotypes d E. coli., nous observons des recroissances bactériennes tardives. L ajout de la CMI d érythromycine à la CMI de la colistine (figures 1.a et 1.b) permet d obtenir un effet 377
3 bactéricide à 24 heures (pas de recroissance bactérienne). L association des deux antibiotiques à 24 µg/ml (3/8 CMI) pour l érythromycine et 2 µg/ml (4 CMI) pour la colistine permet une bactéricidie complète plus précoce (dès 3 heures), et sans recroissance bactérienne jusqu à 24 heures (figures 2.a et 2.b). Ces cinétiques montrent une véritable synergie en phase tardive de l association sur Escherichia coli. b) Pourcentage de bactéries survivantes après mise en contact avec les différentes concentrations d érythromycine + colistine pendant 24 heures (tableau 1) Association érythromycine + colistine vis-à-vis de Salmonella Hadar d origine aviaire a) Cinétique de bactéricidie vis-à-vis de 2 souches de Salmonella Hadar (figures 3 et 4), après traitement avec l érythromycine seule, la colistine seule et l association de ces deux antibiotiques. Les concentrations associées dans le milieu de culture sont les suivantes : Erythromycine Colistine 64µg /ml (CMI) 1 µg /ml (CMI) 24µg /ml (3/8 CMI) 2 µg /ml (2 x CMI) b) Pourcentage de bactéries (Salmonella Hadar) survivantes après mise en contact avec les différentes concentrations d érythromycine + colistine pendant 24 heures (tableau 2). L érythromycine seule n a aucun effet bactéricide sur Salmonella Hadar. La colistine à sa CMI (1 µg/ml) ou à 2 CMI provoque individuellement une inhibition de la croissance pendant la phase précoce, mais une recroissance bactérienne est ensuite observée à 24h pour les deux molécules. Contrairement à l effet de chaque antibiotique seul, l association érythromycine à 64 µg/ml (CMI) + colistine à 1 µg/ml (CMI) entraîne une bactéricidie précoce et sans recroissance jusqu à 24 heures. 3. DISCUSSION Il est reconnu que les macrolides sont des molécules naturellement inefficaces envers les entérobactéries en raison de leur taille imposante. Cette grande taille leur empêche de franchir facilement la membrane externe, l'espace inter-membranaire et la membrane plasmique de la bactérie pour atteindre leur cible (les ribosomes nécessaires pour la synthèse des protéines). Si certaines molécules arrivent à passer la membrane bactérienne externe elles sont souvent refoulées de l'espace périplasmique vers le milieu extérieur par l'intermédiaire de mécanismes d'efflux actifs et en aucun cas elles ne peuvent atteindre les ribosomes du cytoplasme. La colistine agit différemment en ciblant son activité sur les phospholipides des membranes bactériennes. La concentration cumulée de ces molécules perturbe irréversiblement les propriétés perméables des membranes des entérobactéries, aussi bien au niveau de la membrane externe qu au niveau de la membrane plasmique. Une activité synergique pourrait être expliquée par le fait que la perméabilité inhabituelle générée par la colistine permet à l'érythromycine d'atteindre ses cibles moléculaires alors que normalement cet accès est impossible. Les entérobactéries n'ayant génétiquement pas l'habitude de contrecarrer l'effet des macrolides présent dans le cytoplasme, les bactéries ne peuvent réagir par un mécanisme de résistance ciblé souvent génétiquement hérités par la pression de l'antibiothérapie. Quant aux macrolides, ils ne font aucune différence en terme d'activité si les ribosomes sont constitutifs de bactéries à Gram négatif ou à Gram positif. Cette hypothèse pourrait permettre d'expliquer pourquoi aucune recroissance est visible lorsque ces deux antibiotiques sont associés. CONCLUSION L étude de l association érythromycine + colistine vis-à-vis d Escherichia coli a montré que la présence des deux molécules à une concentration inhibitrice pour la colistine et à une concentration sub-inhibitrice pour l érythromycine, entraîne des bactéricidies plus précoces et complètes sans recroissance bactérienne jusqu à 24 heures. L association est synergique. L association érythromycine + colistine vis-à-vis et de Salmonella Hadar entraîne des bactéricidies précoces sans recroissance bactérienne jusqu à 24 heures. Les différentes concentrations des synergies obtenues dans cette étude sont intéressantes et permettent de supposer également une efficacité in vivo. La recherche d une synergie en utilisant in vitro la technique de l échiquier nous permettrait sans doute de compléter ces observations (mesures des CMI des différentes concentrations d antibiotiques associés). Il existe de nombreuses exceptions aux règles fondamentales de Jawetz de sorte que chaque association pertinente doit être étudiée préalablement in vitro vis-à-vis d un germe donné par des méthodes «statiques» (mesure des CMI par la méthode de l échiquier) et «dynamiques» (cinétique de bactéricidie). Cette étude a mis en évidence une synergie de l association érythromycine + colistine vis-à-vis d Escherichia coli et Salmonella Hadar d origine aviaire. La méthode de cinétique de bactéricidie a permis d apprécier très concrètement l intérêt d une 378
4 association d antibiotiques en terme d intensité et de vitesse de bactéricidie, paramètres importants pour l efficacité des schémas thérapeutiques. Cette association «érythromycine + colistine» per os pourrait être indiquée dans le traitement des poussins ou des dindonneaux lors de colibacillose, de salmonellose ou de pathologies associant des germes à Gram positif avec des germes à Gram négatif (entérites). Des essais dans les conditions terrain devront être mis en place pour confirmer l intérêt in vivo de cette association. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Ganiere J.P. et al, Proceeding des Journées nationales GTV, Humbert F, Manuel de bactériologie alimentaire, 27, Polytechnica, Paris. Keck G. et al, Rev. Med. Vet., 146(5) : Lecoanet J, Manuel de pathologie aviaire, 237, Editions de l Ecole Nationale vétérinaire d Alfort, Paris. Tableau 1. Réduction du nombre d Escherichia coli survivants en fonction du temps au contact de différentes concentrations d érythromycine + colistine. Effets in vitro (log CFU/ml difference) avec E. coli No.017 (sérotype O 78 K 80 ) Temps 0,5 µg/ml 2 (4CMI) + 0,5 (CMI) (h) (CMI) 24 µg/ml (3/8CMI) + 64 µg/ml (CMI) Effets in vitro (log CFU/ml difference) avec E. coli No (sérotype O 2 K 1 ) Temps 0,5 µg/ml 2 µg/ml (4CMI) + 0,5 µg/ml (CMI) 2 µg/ml 24 µg/ml 64 µg/ml (MIC) (h) (MIC) 24 µg/ml (3/8CMI) + 64 µg/ml (CMI) Tableau 2. Réduction du nombre Salmonella Hadar survivants en fonction du temps au contact de différentes concentrations d érythromycine + colistine. Effets in vitro (log CFU/ml difference) avec Salmonella Hadar No Temps (h) 1 µg/ml 2µg/ml (2 CMI) + 1 µg/ml (CMI) + (CMI) 24 µg/ml (3/8CMI) 64 µg/ml (CMI) Effets in vitro (log CFU/ml difference) avec Salmonella Hadar No Concentrations de Colistine Concentrations d érythromycine Colistine et Erythromycine associées Temps 1 µg/ml 2µg/ml (2 CMI) + 1 µg/ml (CMI) + (h) (CMI) 24 µg/ml (3/8CMI) 64 µg/ml (CMI)
5 Figure 1.a. Cinétique de bactéricidie (CMI Colistine, CMI Erythromycine) vis à vis d Escherichia coli sérotype O 78 K 80 Figure 3.a. Cinétique de bactéricidie (CMI Colistine, CMI Erythromycine) vis à vis de Salmonella Hadar N ,5 µg/ml Colistine (CMI) 64 µg/ml Erythromycine (CMI) 0,5 µg/ml Colistine + 64 µg/ml Erythromycine 1 µg/ml Colistine (CMI) 64 µg/ml Erythromycine (CMI) 1 µg/ml Colistine + 64 µg/ml Erythromycine Figure 1.b. Cinétique de bactéricidie (4 CMI Colistine, 3/8 CMI Erythromycine) vis à vis d Escherichia coli sérotype O 78 K 80 Figure 3.b. Cinétique de bactéricidie (2 CMI Colistine, 3/8 CMI Erythromycine) vis à vis de Salmonella Hadar N µg/ml Colistine (4 CMI) 24 µg/ml Erythromycine (CMI) 2 µg/ml Colistine+ 24 µg/ml Erythromycine 2 µg/ml Colistine (2 CMI) 24 µg/ml Erythromycine (3/8 CMI) 2 µg/ml Colistine+ 24 µg/ml Erythromycine Figure 2.a. Cinétique de bactéricidie (CMI Colistine, CMI Erythromycine) vis à vis d Escherichia coli sérotype O 2 K 1 Figure 4.a. Cinétique de bactéricidie (CMI Colistine, CMI Erythromycine) vis à vis de Salmonella Hadar N ,5 µg/ml Colistine (CMI) 64 µg/ml Erythromycine (CMI) 0,5 µg/ml Colistine+ 64 µg/ml Erythromycine 1 µg/ml Colistine (CMI) 64 µg/ml Erythromycine (CMI) 1 µg/ml Colistine + 64 µg/ml Erythromycine Figure 2.b : cinétique de bactéricidie (4 CMI Colistine, 3/8 CMI Erythromycine) vis à vis d Escherichia coli sérotype O 2 K 1 Figure 4.b. Cinétique de bactéricidie (2 CMI Colistine, 3/8 CMI Erythromycine) vis à vis de Salmonella Hadar N µg/ml Colistine (4 CMI) 24 µg/ml Erythromycine (CMI) 2 µg/ml Colistine+ 24 µg/ml Erythromycine 2 µg/ml Colistine (2 CMI) 24 µg/ml Erythromycine (3/8 CMI) 2 µg/ml Colistine+ 24 µg/ml Erythromycine 380
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