Petrifilm. Test pour la Numération des Coliformes. Guide d Interprétation

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1 Guide d Interprétation Petrifilm Test pour la Numération des Coliformes Ce document est destiné à vous apporter une aide pour l interprétation des résultats obtenus à partir des tests M Petrifilm pour la Numération des Coliformes (CC). Pour plus d information, renseignez-vous auprès de votre contact officiel M Microbiologie le plus proche. Les tests Petrifilm CC contiennent un milieu sélectif de type VRBL (composé de sels biliaires, de cristal violet et de rouge neutre), un agent gélifiant soluble dans l eau froide et un indicateur coloré facilitant la lecture. Le film supérieur retient le gaz produit par les colonies fermentant le lactose. Les conditions d incubation ainsi que l interprétation des tests Petrifilm CC varient selon les méthodes suivies. L ISO définit les coliformes par leur capacité à se développer sur un milieu spécifique. La méthode ISO 482, dénombrement des coliformes par comptage des colonies, définit les coliformes par la taille de la colonie et la production d acide sur milieu VRBL (Violet Red Bile Lactose). Sur les tests Petrifilm CC, ces coliformes forment des colonies caractéristiques rouges avec ou sans bulles de gaz autour de la colonie (voir cercle ). La méthode ISO 48 décrit une numération des coliformes par la technique du nombre le plus probable (NPP) et définit les coliformes par leur capacité à se développer et à produire du gaz par fermentation du lactose dans un bouillon sélectif. Sur les tests Petrifilm CC, ces coliformes forment des colonies caractéristiques rouges avec une ou plusieurs bulles de gaz autour de la colonie (voir cercle 2). L AOAC International et la FDA (Food and Drug Administration) / BAM définissent les coliformes comme des bâtonnets gram négatif produisant de l acide et du gaz par fermentation métabolique du lactose. Les colonies de coliformes se développant sur les tests Petrifilm CC produisent de l acide qui réagit avec l indicateur ph et assombrit la couleur du gel. La présence d une ou plusieurs bulles de gaz autour d une colonie indique la présence de coliformes (voir cercle 2). Sur les tests Petrifilm CC, le dénombrement des coliformes totaux et des coliformes thermotolérants est aisément réalisable. L AOAC, le NMKL et l AFNOR ont validé l emploi des tests Petrifilm CC dans des conditions spécifiques. Se reporter aux pages 2 et de ce Guide d Interprétation. 2 Nombre de colonies gazogènes : 75 Nombre de colonies non gazogènes : 24 Nombre total de colonies = 99

2 Interprétation des tests M TM Petrifilm TM CC en fonction des protocoles décrits par les organismes suivants : AOAC, NMKL et AFNOR Lecture suivant les conditions décrites par les méthodes officielles de l AOAC pour les coliformes totaux (986., et 99.4) Incubation : Numération des coliformes dans le lait, le lait cru et les produits laitiers (méthodes officielles 986. et 989.0) : incuber 24h +/- 2h à 2 C +/- C. Numération des coliformes dans tout produit sauf ceux cités ci-dessus (méthode officielle 99.4) : incuber 24h +/- 2h à 5 C +/- C. Interprétation : Compter les colonies rouges gazogènes. 65 coliformes, méthodes officielles AOAC. A Lecture suivant les conditions décrites par la méthode NMKL pour les coliformes totaux (47.99) Incubation : 24h +/- 2h à 7 C +/- C Interprétation : Compter les colonies rouges gazogènes. 67 coliformes, méthode NMKL. B

3 Lecture suivant les conditions décrites par la méthode validée par l AFNOR pour les coliformes totaux (certificats M 0/2-09/89A et M 0/2-09/89B) Incubation : 24h +/- 2h à 0 C +/- C Interprétation : Comparaison à la méthode ISO 482 (certificat M 0/2-09/89A) : Compter toutes les colonies rouges gazogènes ou non. Comparaison à la méthode ISO 48 (certificat M 0/2-09/89B) : Compter uniquement les colonies rouges gazogènes. 97 coliformes, méthode validée par l AFNOR par comparaison à la méthode ISO coliformes gazogènes, méthode validée par l AFNOR par comparaison à la méthode ISO 48. C Lecture suivant les conditions décrites par la méthode validée par l AFNOR pour les coliformes thermotolérants (certificat M 0/2-09/89C) Incubation : 24h +/- 2h à 44 C +/- C Interprétation : Comparaison à la méthode NF V08-07 : Compter toutes les colonies rouges gazogènes ou non. D 2 coliformes, méthode validée par l AFNOR par comparaison à la méthode NF V08-07.

4 Test M TM Petrifilm TM pour la Numération des Coliformes Parallèlement à l augmentation du nombre de coliformes, noter l assombrissement de la couleur du gel entre les photos 2 à 6. 2 Nombre de colonies = 0 Les petites bulles de gaz visibles sont caractéristiques du gel et ne sont pas le résultat d un développement bactérien. Ces bulles sont de la taille d une tête d épingle et ne sont pas associées à des colonies. 2 Nombre de colonies non gazogènes = 7 Nombre de colonies gazogènes = 8 Nombre total de colonies = 5 La Figure montre comment la forme des bulles peut varier. Parfois, la quantité de gaz produite par la colonie fait éclater celle-ci (voir cercles et 2). Les bulles doivent se trouver au maximum à une distance approximativement équivalente au diamètre d une colonie. La présence d air dans l échantillon ou une inoculation inadéquate du test Petrifilm CC peut induire la présence de bulles artefact dans le gel. Ces bulles sont de taille irrégulière et non associées à une colonie (voir cercle ). Nombre de colonies non gazogènes = 29 Nombre de colonies gazogènes = 8 Nombre total de colonies = 2 La plage de dénombrement optimale (toutes colonies) est de 5 à 50 colonies. Ne pas compter les colonies sur le pourtour en mousse car la sélectivité du milieu y est modifiée (voir cercle ). 4 Nombre total de colonies (estimé) : 0 La zone de croissance circulaire du test Petrifilm CC est de 20 cm 2 environ. Des estimations sont possibles sur des tests Petrifilm CC contenant plus de 50 colonies en comptant le nombre de colonies dans un ou plusieurs carrés représentatifs et en déterminant le nombre moyen par carré. Multipliez ce nombre moyen par 20 pour déterminer le nombre estimé par test Petrifilm CC. Pour obtenir un dénombrement précis, procéder à d autres dilutions. 5

5 Tests M TM Petrifilm TM CC incomptables Pour obtenir un dénombrement précis, procéder à d autres dilutions. Les tests Petrifilm CC incomptables présentent une ou plusieurs de ces caractéristiques : nombreuses petites colonies, nombreuses bulles de gaz, gel de couleur rose très foncé. 6 Nombre de colonies gazogènes : 4 En présence d un nombre élevé de micro-organismes non coliformes, comme Pseudomonas par exemple, la couleur du gel du test Petrifilm CC peut virer au jaune. 7 Bulles de gaz Nombre de colonies gazogènes : 2 Les débris d aliments sont souvent de forme irrégulière et ne sont pas associés à des bulles de gaz (voir cercle ) Les exemples ci-dessus montrent des colonies associées à des bulles de gaz de formes variées. Toutes doivent être prises en compte comme coliforme. 9

6 Test M Petrifilm pour la Numération des Coliformes Pour des informations détaillées concernant les Mises en garde, Garantie limitée, Recours limités, Stockage et Destruction, Mode d emploi se reporter à la Notice d utilisation. Fiche d utilisation Stockage Petrifilm Petrifilm Petrifilm Stocker les poches non-ouvertes réfrigérées ou congelées à une température 8 C ( 46 F). Utiliser les tests Petrifilm CC avant la date d expiration indiquée sur la poche. Dans les locaux où règne une forte humidité, il est préférable de laisser les poches atteindre la température ambiante avant ouverture afin d éviter l apparition de condensation. 2 Pour refermer les poches, replier l extrémité et fermer à l aide d un ruban adhésif ou d une pince. Garder les poches entamées à une température 25 C ( 77 F) et une Humidité Relative 50%. Ne pas les placer au réfrigérateur. Utiliser les tests Petrifilm CC dans le mois qui suit l ouverture de la poche. Préparation de l échantillon 4 Peser ou pipeter le produit dans un récipient stérile (sac stomacher, bouteille, sac Whirl-Pack ou autre). 5 Ajouter la quantité nécessaire de l un des diluants stériles suivants : peptone-sel (méthode ISO 6887) (Maximum Recovery Diluent), tampon phosphate Butterfield (tampon phosphate IDF, KH2PO4 à 0,0425g/l, ajuster le ph à 7,2), eau peptonée à 0,%, eau peptonée tamponnée (méthode ISO 6579), solution saline (0,85-0,90%), solution de letheen sans bisulfite ou eau distillée. 6 Broyer ou homogénéiser l échantillon en utilisant la procédure habituelle. Ajuster le ph de l échantillon entre 6,6 et 7,2 : pour les produits acides, utiliser NaOH N, pour les produits alcalins, utiliser HCl N. Ne pas utiliser de tampons contenant du citrate, du bisulfite ou du thiosulfate, ils peuvent inhiber la croissance des bactéries.

7 Ensemencement 7 Placer le test Petrifilm CC sur une surface plane. Soulever le film supérieur. Avec une pipette tenue perpendiculairement au test Petrifilm CC, déposer ml de l échantillon dilué au centre du film inférieur. 8 Recouvrir délicatement avec le film supérieur de manière à éviter l introduction de bulles d air. Ne pas laisser le film supérieur retomber brutalement. 9 Placer le diffuseur, face lisse vers le bas, au centre du film supérieur, au niveau de l inoculum. Etaler l échantillon en exerçant une légère pression sur le diffuseur avant que le gel ne se forme.ne pas tourner ou faire glisser le diffuseur. Retirer le diffuseur. Attendre au minimum minute pour permettre au gel de se solidifier. Incubation Interprétation <70 F 0 Incuber les tests Petrifilm CC à l horizontale, le film supérieur vers le haut, sans empiler plus de 20 unités. La température d incubation varie selon les méthodes. Méthodes approuvées les plus courantes : Coliformes totaux Méthodes officielles AOAC 986. et AOAC (lait, lait cru et autres produits laitiers) : Incuber 24h ± 2h à 2 C ± C. Méthode officielle AOAC 99.4 (tout produit) : Incuber 24h ± 2h à 5 C ± C. Méthode NMKL : Incuber 24h ± 2h à 7 C ± C. Méthodes validées AFNOR M 0/2-09/89A et B : Incuber 24h ± 2h à 0 C ± C. Coliformes thermotolérants (fécaux) Méthode validée AFNOR M 0/2-09/89C : Incuber 24h ± 2h à 44 C ± C. Dans ce cas, l étuve doit être humidifiée pour minimiser la déshydratation Lire les tests Petrifilm CC à l oeil nu ou à l aide d un système permettant une amplification visuelle ou lumineuse. Se référer au Guide d Interprétation pour la lecture des résultats. 2 Pour isoler une colonie en vue d une identification plus poussée, soulever le film supérieur et prélever la colonie à l aide d une anse stérile.

8 For Europe, please contact : Laboratoires M Santé Tel. : () Fax : () Département Microbiologie Laboratoires M Santé Boulevard de l Oise Cergy-Pontoise Cedex Tél. : M et Pétrifilm sont des marques déposées par M. FP 0990