Méthodes et stratégies de diagnostic virologique.

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1 Méthodes et stratégies de diagnostic virologique

2 - Principales méthodes de diagnostic virologique prélèvements, sérologies, biologie moléculaire, - Exemples par syndrome hépatites virales infection par le VIH infections respiratoires aiguës infections pendant la grossesse méningo-encéphalites fièvres de retour du voyageur syndrome mononucléosique accident d exposition au sang

3 Méthodes virologiques courantes Méthodes directes : détecter l agent infectieux ou l un de ses composants - infectiosité : culture - protéines virales : réactions immuno-enzymatiques - acides nucléiques viraux : biologie moléculaire hybridation, amplification, séquençage Méthodes indirectes : détecter la réaction immunitaire de l hôte sérologies virales Stratégies : prescrire utile

4 Quels prélèvements pour le diagnostic? Sérologies virales Biologie moléculaire : PCR, séquençage Sérum Détection d antigènes Transport à 5 C - Tubes EDTA - Écouvillons (virocult) - Tubes stériles : LCR, urine, LBA - Biopsies non fixées

5 Qualité - Norme iso Accréditation des Laboratoires de Biologie Médicale - Bon sens et prudence : contact téléphonique avec le laboratoire partenaire * vérifier les conditions actualisées * prévenir de l'expédition d'un tube «précieux»

6 Non conformité : Mme M M Renseignements cliniques : leucémie aiguë Nature du prélèvement sur écouvillon : prélèvement inguinal PCR demandées : Grippe A Grippe B VRS

7 Sérologies virales But : mise en évidence d un contact Intérêts : automatisation, rapidité, sensibilité / spécificité (ELISA) Limite : sensibilité moindre aux âges extrêmes croisements antigéniques? Ac ELISA Chémiluminescence tubes unitaires HIV, HTLV, HCV, HBV, HAV CMV, EBV, HSV, VZV, rubéole, B19, rougeole, oreillons

8 Biologie moléculaire : PCR, séquençage PCR en temps réel : HIV, HBV, HCV «charges» CMV, EBV, HHV6, BKV, AdV HSV, VZV, Grippe, Séquençage : HIV, HCV, HBV Pas de tube hépariné

9 Biologie moléculaire But : détecter ou caractériser le génome viral dans un prélèvement. Hybridation : détection HPV oncogènes Amplification génique : PCR en temps réel (tous virus) Applications qualitatives (diagnostic) et quantitatives (suivi sous traitement anti-viral) Séquençage : mutations de résistance et génotype (HIV, HBV,HCV) Limites : - Risques de contamination - Aucune preuve du lien de causalité (viroses persistantes)

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11 Détection d antigènes? Ag HSV avant accouchement But : détection de la présence du virus en forte quantité Intérêt : rapidité (20 minutes à 3 heures) Limites : manque de sensibilité, lecture subjective Rotavirus

12 Cultures virales But : démonstration du caractère infectieux du virus Intérêt : technique de référence (phénotype d une souche) Limites : lenteur : 3 semaines pour les négatifs virus non ou mal cultivables

13 Une petite idée des prix Sérologie VIH : B54 Western blot VIH : B160 Sérologie HSV IgM + IgG : B50 Ag Rotavirus dans les selles : B20 Charge VIH : B220 Charge VHC : B220 ADN HPV : B140 Génotypage VIH : B1100 Multiplex respiratoire : RIHN 1500

14 Exemples par syndrome

15 Hépatite aiguë HAV -Transaminases - Sérologies virales : HAV : IgM + IgG- HEV Profils sérologiques classiques HEV : IgM+ IgG- HBV : Ag HBs+ IgM anti HBc+ HCV : Ac totaux Hépatite B aiguë Huraux et al, Traité de virologie Médicale, ESTEM, Paris, 2003

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18 Hépatite chronique Phase de tolérance immunitaire clairance immunitaire porteur inactif ADN HBV : Ag HBs+ Ac anti HBc+ Delta? Hépatite B chronique Marqueurs sériques VHC HCV : Ac anti HCV+ ARN + ARN VHC sérique ARN VHC sérique Ac anti-vhc Transaminases mois ans Hépatite aiguë Hépatite chronique

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21 Attention! Porteur inactif ou mutant précore charge HBV

22 Tolérance Immunitaire ALT normales Clairance Immunitaire ALT élevées Réactivation IgM anti HBc ALT élevées Portage inactif ADN VHB faible ALT normales ou Mutants pré-core ADN VHB élevé ALT élevées Ag HBe Ag HBe Ac anti HBe Ac anti HBe Ac anti HBc = contact Ag HBs = hépatite B en cours Hépatite B chronique années

23 Index et zone grise

24 CAT si première détection?

25 Second prélèvement : Seconde méthode ELISA (autre fabricant, autres Ag) Si +?

26 Premier prélèvement : Second prélèvement : Seconde méthode ELISA Si + : charge VHC détectable = infection par le VHC non détectable = infection passée et guérie

27 Vaccination HBV : Ac anti-hbs > 10 UI/mL Ac anti HBc négatifs HAV : IgG anti HAV positives (ou Ac totaux)

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29 Infection par le VIH 1) Diagnostic de contact avec le virus : sérologie + WB (un seul test ELISA suffit car Ac + Ag) confirmation sur 2ème prélèvement +++ 2) Suivi : - charge VIH (ARN quantitatif) et CD4 : 2/an - résistance au traitement : mutations de résistance (génotype de résistance) dans les gènes viraux codant transcriptase inverse, protéase, gp41, gp120, intégrase

30 Primo-infection par le VIH-1 ARN VIH-1 Ac anti VIH-1 Ag p24 Seuil de détection de la méthode J0 J11-12 J14-15 J20-21 J28-29 Fenêtre sérologique

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33 Infections respiratoires aiguës Privilégier les prélèvements directs : écouvillon nasal ou pharyngé, LBA pour recherche directe d antigènes et/ou PCR Enfant : VRS Influenza Rhinovirus Métapneumovirus humain Adulte en réanimation : HSV CMV Influenza Rhinovirus Personne âgée : Influenza VRS Immunodéprimé : + HHV6, EBV, VRS Seconde intention, si justification clinique +++ : VZV, Parainfluenzae, Adenovirus, Coronavirus, Bocavirus, rougeole, virus émergents

34 Grippe A, B VRS A, B Rhinovirus Metapneumovirus Virus parainfluenza (4) Bocavirus Adenovirus Coronavirus (3)

35 Infection virale pendant la grossesse rubéole (0-18 SA) CMV (1er trimestre) VZV (1er trimestre et péri-natal) parvovirus B19 (2ème trimestre) période périnatale : HSV, HIV, HBV Virologie : sérum = sérologies (IgG, IgM, avidité) liquide amniotique = PCR Suivi échographique Consultation de diagnostic anténatal + + +

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37 Première intention : Méningite, encéphalite LCR : PCR HSV, VZV et entérovirus Seconde intention? (contexte) : PCR LCR CMV, HHV6, EBV : possible impact thérapeutique Adénovirus, Parvovirus B19, JCV...

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39 Fièvre de retour du voyageur Sérologies et/ou PCR (ancienneté des symptômes) : Dengue, Chikungunya, Zika, West Nile PCR : MERS Coronavirus (péninsule arabique), grippe AH7N9 (Chine) Ebola Fiche descriptive détaillée pour envoi au CNR : fièvre jaune

40 Mme C Femme de 48 ans Antécédents : retour de voyage en Arabie Saoudite Signes cliniques : fièvre à 39.5 C, toux, diarrhée modérée Virus? Prélèvement? Méthode diagnostique?

41 Autre prélèvement?

42 Autre virus?

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44 Syndrome mononucléosique Primo-infection virale EBV : MNI test + sérologie EBV CMV : sérologie CMV IgM + IgG VIH : sérologie (si + : Ag p24 + western blot )

45 Sérologie EBV lors d un syndrome mononucléosique 10/07

46 10/07 04/08

47 10/07 04/08 15/10

48 Accident d'exposition au Sang Patient source Patient exposé 1) Infection VIH? sérologie rapide (4h) 1) Traitement anti-rétroviral précoce et durant 1 mois si PS infecté VIH puis diagnostic classique 2) VHC? 3) VHB? 2) Accident du travail et sérologies initiales (sans urgence) 3) Suivi pendant 6 mois 7 mois si traitement anti-vih

49 Rodin, Le Secret Analyse clinique clé de voûte du diagnostic Diagnostic virologique