UE1 ACIDES AMINES-PROTEINES & ENZYMOLOGIE

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1 UE1 ACIDES AMINES-PROTEINES & ENZYMOLOGIE BY YASMINE & TAIRINA BY FATIMA & YOUSSRA ETUDIANTES SF!!! :D Night Tutorat du et

2 PROGRAMME DU NIGHT TUTORAT

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4 PETITES QUESTIONS CONCERNANT LES AA : 1- QUELS SONT LES ACIDES AMINES CONSTITUTIFS? 2- COMMENT SONT CLASSIFIES LES ACIDES AMINES? 3- QU EST-CE QUE LE PKA & A QUOI SERT-IL? 4- COMMENT PEUT-ON IDENTIFIER LES DIFFERENTS AA? PAR COLORATION PAR SEPARATION

5 Cependant 1- QUELS SONT LES AA CONSTITUTIFS? On a 2O Acides Aminés constitutifs :

6 1- QUELS SONT LES AA CONSTITUTIFS? (SUITE) AA constitutifs non-codés (issus de transformations posttraductionnelles des AA standards) - Cystine - N-méthylysine - γ-carboxyglutamate - 4-hydroxyproline AA non-constitutifs (jamais dans les protéines, toujours à l état libre) Acides α-aminés - Homocystéine - Ornithine - Citruline Acides aminés non-α - Β-alanine - Acide-γ-aminobutyrique(GABA)

7 2- COMMENT SONT CLASSIFIES LES AA? Il existe 4 classes d AA constitutifs (en fonction du groupe latéral): Groupement latéral non polaire - Glycine (2C) - Alanine (3C) - Valine (5C) - Méthionine (5C) - Proline (5C) - Leucine (6C) - Isoleucine (6C) - Phénylalanine (9C) - Tryptophane (11C) Groupement latéral non chargé - Sérine (3C) - Cystéine (3C) - Thréonine (4C) - Asparagine (4C) - Glutamine (5C) - Tyrosine (9C) Groupement latéral chargé + - Aspartate (4C) - Glutamate (5C) Groupement latéral chargé - - Arginine (6C) - Histidine (6C) - Lysine (6C)

8 3- QU EST-CE QUE LE PKA & A QUOI SERT-IL? Les AA ont un caractère amphotère/ampholyte. Le pka est le ph de demi-dissociation qui correspond au potentiel de dissociation. Il permet de calculer le phi. pka= (pk1+pk2) 2 Le phi est le ph du solvant dans lequel l AA est retrouvé avec les 2 charges: - COO- - NH3+ SI ph du solvant > phi de l AA ANODE SI ph du solvant < phi de l AA CATHODE

9 4- COMMENT PEUT-ON IDENTIFIER LES DIFFERENTS AA? Méthodes de coloration des AA - Réaction à la ninhydrine coloration violette (pourpre de Ruheman) pour tous les AA, SAUF pour la Proline coloration jaune (peu spécifique) - Méthode de Sanger au DNFB coloration jaune (peu sensible) - Réaction au chlorure de Dansyl obtention d un AA dansylé fluorescent (très sensible) Méthodes de séparation des AA - Chromatographie de partage Migration sur papier, puis révélation à la ninhydrine. Les AA les plus polaires très liés à la cellulose migrent peu - Chromatographie par échange d ions (Stein&Moore) Résine échangeuse de cations, tampon à ph acide

10 PETITES QUESTIONS CONCERNANT LES PEPTIDES: 1- QUELLES SONT LES CARACTERISTIQUES DE LA LIAISON PEPTIDIQUE? 2- QUELLES SONT LES METHODES DE COLORATION DES PEPTIDES? 3- COMMENT DETERMINER LA COMPOSITION DES PEPTIDES EN ACIDES AMINES?

11 1- QUELLES SONT LES CARACTERISTIQUES DE LA LIAISON PEPTIDIQUE? - Liaison covalente - Réaction endergonique (donc non spontanée) - Structure plane & rigide (6 atomes adjacents de la double liaison sont dans le même plan) - Stabilisée par résonance/mésomérie - Toujours en position trans SAUF parfois avec la PROLINE

12 2- QUELLES SONT LES METHODES DE COLORATION DES PEPTIDES? Réaction de Biuret 2 molécules d urée en milieu alcalin avec des ions Cu2+ donne une coloration bleue Mais avec des peptides, on a une coloration violette Sensibilité modérée 30 min de temps d attente Réaction de Lowry (Biuret améliorée) Réduction du complexe phospho-tungstomolybdique: Réaction de Folin & Ciocalteu donne une coloration bleue Sensibilité + élevée mais spécifique 40min (temps plus long) Réaction de Bradford (Le + utilisée) Protéine en milieu acide forme un complexe Coomassie/Protéine (coloration bleue au final) par le bleu de Coomassie (coloration rouge au départ) Sensibilité ++ élevée 5min (simple et rapide) ATTENTION!! Ne pas confondre les différentes méthodes pour les AA, les peptides et les protéines

13 3 COMMENT DETERMINER LA COMPOSITION DES PEPTIDES EN AA? Par hydrolyse Par séquençage Acide Chimique : Alcaline Bromure de cyanogène Coupe à DROITE M - X Enzymatique : Pepsine (milieu acide) Coupe à GAUCHE X - F,Y,W Trypsine (milieu basique) Coupe à DROITE K,R - X Chymotrypsine (milieu basique) Coupe à DROITE F,Y,W - X Fragments séparés par chromatographie avec la méthode récurrente d Edman

14 PETITES QUESTIONS CONCERNANT LES PROTEINES : 1- QUELS SONT LES TYPES DE STRUCTURES QUE L ON RENCONTRE DANS UNE PROTEINE? 2- QUELLES SONT LES DIFFERENTES LIAISONS AU SEIN DE SES STRUCTURES? 3- QUELS SONT LES ROLES DE LA POMC? 4- COMMENT FONCTIONNE LES RECEPTEURS AUX OPIACES (MORPHINIQUES)? 5- QUELS PROCEDES PERMETTENT L ETUDE & L IDENTIFICATION DES PROTEINES?

15 1- QUELS SONT LES TYPES DE STRUCTURES QUE L ON RENCONTRE DQNS UNE PROTEINE? Structure Secondaire: Hélice α Feuillets β (parallèles et antiparallèles) plutôt interchaine Hélice β* plutôt intrachaine - Boucles* (épingles à cheveux: 2 brins β adjacents antiparallèles) - Coudes β* (feuillets β antiparallèles) * Structures non répétitives Structure Tertiaire: Disposition des différents motifs secondaires entre eux avec repliement d une protéine dans l espace Structure Quaternaire: Dans le cas de protéines multimériques uniquement!

16 2- QUELLES SONT LES DIFFERENTES LIAISONS AU SEIN DE SES STRUCTURES? Liaisons faibles : Intéractions hydrophobes (Leu Zipper) Liaisons hydrogènes Liaisons fortes : Ponts S-S Liaisons salines (entre AA de charges opposées)

17 3- QUELS SONT LES ROLES DE LA POMC? POMC contient +sieurs peptides avec des fonctions : - β lipotropine qui assure la dégradation des lipides - Corticotropine ou ACTH pour la sécrétion de cortisol par les surrénales - MSH (hormone mélano stimulante) pour la coloration de la peau - β endorphine qui a les mêmes fonctions que les opioides endogènes

18 3- QUELS SONT LES ROLES DE LA POMC? (SUITE) ACTH : Peptide de 39 résidus d AA de la POMC qui possèdent des fonctions différentes: - De 4 à 10 : indispensable à l activité mais, seule a une activité moindre que le peptide entier - De 11 à 24 : activité antagoniste à celle du peptide, elle inhibe la sécrétion de cortisol - De 1 à 24 : action analogue à celle du peptide entier Β endorphine : Peptide de 31 derniers résidus d AA de la POMC Peut avoir 2 autres origines : - Enképhaline (avec précurseur, la proenképhaline) - Dynorphine (avec précurseur, la prodynorphine) Structure analogue aux autres opioïdes endogènes : TYR-GLY-GLY-PHE en N-ter

19 4- COMMENT FONCTIONNENT LES RECEPTEURS AUX OPIACES? On a des récepteurs morphiniques ou opiacés à 7 domaines transmbr μ (morphinique), δ, κ avec 3 sous-unités : α,β,γ Couplés à l AMPc Neurotransmission dépendante de l AMPc 3 effets différentes sont présentés: 2 effets présynaptiques et 1 post-synaptique 1 er effet : Présynaptique, lié à la sous-unité α du récepteur Cette sous-unité est couplée à Gi (activité inhibitrice de l AMPc) La du taux d AMPCc entraine une de la neurotransmission du signal. Certaines messages sont ainsi inhibés comme celui de la douleur. D où l effet antalgique des opiacés.

20 4- COMMENT FONCTIONNENT LES RECEPTEURS AUX OPIACES? (SUITE) 2 ème effet: Présynaptique, lié aux sous-unités βγ du récepteur L activation du R entraine une inhibition des canaux Ca++/VOD L absence d entrée du Ca++ dans la cellule entraine son relâchement et l arrêt de l activité des neurotransmetteurs Ca++/dépendants Ceci induit donc une hypotension (vasodilatation) 3 ème effet: Post synaptique, lié aux sous-unités βγ du récepteur Leur activation induit l ouverture des canaux K+ (KIR) Donc libération massive de K+ qui induit une hyperpolarisation de la cellule, ce qui la rend réfractaire à tout activation. La conduction nerveuse est stoppée Cet effet explique aussi les propriétés antalgiques des opiacés A noter : Ces R sont sensibles aux opiacés mais aussi aux petits peptides!!!

21 5- QUELS PROCEDES PERMETTENT L ETUDE & L IDENTIFICATION DES PROTEINES? NEPHELMETRIE & TURBIDIMETRIE Objectif : Mesure de la [] d une protéine dans un sérum Procédé : Injection d un Ag dans une souris qui produit des Ac formations de complexe-immuns Résultat : Incidence d une lumière dans les complexes qu on mesure par l intensité de la lumière transmise (sortante) = TURBIDIMETRIE ou qu on mesure par l intensité de la lumière dispersée (à l int de la cellule) = NEPHELEMETRIE (méthode + sensible et + spécifique)

22 5- QUELS PROCEDES PERMETTENT L ETUDE & L IDENTIFICATION DES PROTEINES? (SUITE) CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE A HAUTE PRESSION : Objectif : Quantifier les protéines d un sérum 2 méthodes différentes: En phase réverse Procédé: Phase mobile = liq bio à identifier dans de l eau (le + souvent) Phase stationnaire = microbilles de silices greffées à des résidus hydrophobes Les résidus hydrophobes du liq à identifier sont retenus par la phase stationnaire ALORS, les AA hydrophiles passent. Puis détachement des AA hydrophobes, avec utilisation d un liq organique B qui chassent les AA du vers le + hydrophobe Par échanges d ions Procédé: Phase mobile = liq bio à identifier dans de l eau (le + souvent) Phase stationnaire = microbilles de silices greffés à des ions carboxylates Les résidus chargés + du liq à identifier sont retenus par la phase stationnaire ALORS, les AA chargés passent. Puis détachement des AA chargés +, on utilise un solvant : NaCl qui chassent les AA chargés +, Na+ prend la place des ions carboxylates

23 5- QUELS PROCEDES PERMETTENT L ETUDE & L IDENTIFICATION DES PROTEINES? (SUITE) Résultat par échange d ions : A l aide d un appareil fixé à 230nm, on obtient un CHROMATOGRAMME En fonction du temps d émission ET de la quantité de liq B, on va identifier la protéine. En effet, l aire sous la courbe est fonction des [] de B On quantifie ainsi la quantité de protéine. SPECTROMETRIE DE MASSE : Objectif : Identification des protéines en fonction de leur masse Procédé : Application d un rayon laser sur le sérum > ionisation des protéines Résultat : + la protéine est lourde, + elle sera distante au centre de la cible. Différenciation à 5 ou 6 Da. Pour mesures plus performantes, utilisation d un quadripôle, le trajet n est dont plus rectiligne mais hélicoïdal augmentation du tps de vol. Différenciation à 1 Da.

24 ACIDES AMINES QCM: A L histidine est un AA non polaire. B Les AA ont un rôle structural, énergétique, métabolique et fonctionnel. C La sérine, tyrosine et méthionine ont un groupement hydroxyle dans leur chaine latérale. D Les AA absorbe la lumière du visible. E L AA dont le phi=5,1 migrera vers la cathode dans un tampon ph=2

25 CORRECTION: Réponse : BE A L histidine est un AA POLAIRE CHARGE POSITIVEMENT. C La méthionine possède un atome de soufre! tyrosine et sérine ont un groupement hydroxyle dans leur chaine latérale. D Les AA absorbe la lumière du visible de l UV.

26 PEPTIDES QCM: A La liaison peptidique se crée par partage d ion. B Le caractère amphiphile des peptides provient du groupement latéral. C La réaction de biuret à une sensibilité forte pour les peptides. D L hydrolyse acide est plus utilisé que l hydrolyse basique. E La méthode de séquençage enzymatique et chimique permet d obtenir des petits peptides.

27 CORRECTION: Réponse : ADE A Car c est une liaison covalente! B Le caractère amphiphile AMPHOTERE/AMPHOLYTE des peptides provient du groupement latéral. C La réaction de biuret à une sensibilité forte MODEREE pour les peptides.

28 PROTEINES QCM : A La β endorphine peut seulement être issue de la POMC. Elle a une action analogue aux opioïdes endogènes. B La propriété antalgique des récepteurs morphiniques est explicable par ces 2 effets présynaptiques. C La turbidimétrie mesure l intensité de la lumière transmise. D La néphélémétrie mesure l intensité de la lumière dispersée. E Ces deux techniques permettent l identification des protéines en fonctions de leur masse

29 CORRECTION: Réponse : CD A La β endorphine peut seulement être issue de la POMC. + Enképhaline et Dynorphine B La propriété antalgique des récepteurs morphiniques est explicable par ces 2 effets présynaptiques, on a 1 effet postsynaptique et 1 effet présynaptique. E Ces deux techniques permettent l identification des protéines en fonctions de leur masse par techniques immunologiques.

30 FIN BONNE CHANCE :D